Способ иммобилизации оксидоредуктазных ферментов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (») 618048

BÄу

Н,«A, ð (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 09.07.76(21) 2382510/23-04 (23) Приоритет — (32) 10.07.75 (31) 25251 A/75 (33) Италия (43) Опубликовано 30.07.78.Бюллетень № 28 (45) Дата опубликования описания 05.09.78 (51) М. Кл.

С 07 7/02

Государственный комитет

Совета Министров СССР па делам изооретений и открытий (53) УДК 577. 15. .07(088,8) Иностранцы

Джулио Просперы, Вальтер Маркони, Сильвия Джиовенко и Франко Моризи (Италия) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Снам Прогетти С. и. A." (Италия) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ОКСИДОРЕДУKTAÇHbIX

ФЕРМ EHTOB

Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментных препаратов, а именно к способу получения иммобилизованных в волокнах оксидоредуктаз.

Препараты, полученные данным способом, могут найти применение в тонком органическом синтезе, в аналитической химии и в лабораторной практике.

Известно, что иммобилизация фермен- 1О тов на различных нерастворимых в воде носителях позволяет увеличить продолжительность использования ферментов и обеспечивает их технологичность 1, Особые трудности при иммобилизации встречаются 15 в случае оксидоредуктаз, поскольку проявление ферментативной активности этими ферментами обязательно связано с наличием в реакционной среде кофермента типа. нихотинамидадениндинуклеотида (Н АД ) . При 20 этом НАД легко. диссоциирует из комплексов с ферментами и поэтому при циклических операциях с иммобилизованными оксидоредуктазами необходимо каждый раз вводить в реакционную смесь весьма дорого- 25 стоящий кофактор, который в последующем теряется в ходе очистки выделямых из реакционной среды продуктов. Это является серьезным ограничением для использования иммобилизованных оксидоредуктазных систем.

Известен также способ получения ферментсодержаших волокон, заключающийся в том, что фермент в виде эмульсии или суспензии или раствора в растворителе полимера добавляют в прядильный раствор полимера, из которого затем формуют волокно в условиях,. не оказывающих дезактивируюшего действия на ферменты (2).

Однако этот способ в отношении к НАДзависимым оксидоредуктазам имеет описанные выше ограничения.

Цель предлагаемого способа — устранение недостатков известного способа.

Для этого предложен способ, в котором при формировании волокон, содержащих апоферменты оксидоредуктаз, осуществляют одновременное включение в волокна иммобилизированного на водорас x вор;.— мом поликатиониее НАД, Указанная опера618048 ция приводит к сохранению активности оксидоредуктаз в иммобилизованном состоянии. Полученные препараты не требуют добавления в реакционную среду НАД при циклических процедурах получения продук- 5 тов ферментативных реакций, катализируемых оксидоредуктазами, что резко улучшает технологические свойства полученных препаратов. Кроме того, поскольку в волокна включают одн овре меня о два окс и- 1О доредуктазных апофермента, при получении продуктов ферментативного превращения происходит рециклизация иммобилизованного НАД за счет сопряженной реакции, катализируемой вторым оксидоредуктазным ферментом. Рециклизацию HAlj, можно проводить не только энзиматическим путем, за счет включения в волокно второй оксидоредуктазы, Но и химическим путем,когда в волокно включена только одна окси20 доредуктаза, а возвращение НАД в цикл осушествяется с использованием химического соединения, Система рециклизации выбирается в зависимости от продукта, ко25 торый желательно получить.

Согласно изобретению описывается способ иммобилизации оксидоредуктазных ферментов, зависимых от НАД, с сохранени- ем ферментами биологической активности и с улучшенными технологическими свойствами путем одновременного включения в волокна .полимера на основе триацетилцеллюлозы иммобилизованного на водорастворимом поликатионите НАД и апоферментов оксидоредуктаз.

Предпочтительно процесс проводят следующим образом.

Готовят водный раствор, содержащий ферменты, подлежащие включению в волок- О

40 на и иммобилизованный на поликатионите (полиэтиленимине или полилизине) НАД, Далее растворяют триацетилцеллюлозу в хлористом метилене в соотношении 1:14, и к этому раствору добавляют вышеука- 45 занную смесь и соотношении водный раствор « «органическая фаза, равном 1:7.

Эмульгирование двух фаз интенсифицируо ют энергичным перемешиванием при 0 С в течение 30 мин.

Эмульсию выливают в открытую емкость выдерживаемую при 0 С и ведут

0 прядение в атмосфере азота. Нити коагулируют в толуоле при 0 С и собирают на

0 каркасе катушки. Для удаления органичес55 ких растворителей производят сушку волокон на воздухе. Полученные препараты используют многократно для получения продуктов ферментативных реакций, катализируемых оксидоредуктазами, Пример 1. B смеси буфера и г,.ицерина (75:25) растворяют полиэтиленимин-НАД /PEG-HAll (37,5 мг/мл, 0,63 мкмоль НАД в мл), лактатдегидрогеназу (препарат из мышц кроликов фирмы БоеЬ ingest, Maezhe< mÄ èÜÍв концентрации 17,5 мг/мп и аланиндегидрогеназу (препарат из B.биЬ6 Я а фирмы Boehri><

Да, МаПИ Е гп ДиЬН") в концентрации

3,75 мг/мл.

10 r триацетипцелпюпозы (Г2 2ВМ gQ.

5ЫСЙ9 ) растворяют при перемешивании в реакторе в 133 г хлористого метилена, к раствору полимера прибавпяют

20 г раствора энзима и эмульгирование двух фаз интенсифицируют энергичным перемешиванием при О С в течение 30мин. о

Эмульсию выпивают в небольшой плавильный тигель, выдерживаемый при темпера;уре 0 С и прядение ведут в атмос 0 фере азота. о

Нити коагулируют в толуоле при О С и собирают на каркасе катушки.

Для удаления органических растворителей производится сушка на воздухе, 2 г свежеполученного вопокна, что соответствует примерно 1 r сухого полимера, промывают бикарбонатным буферным раствором с рН 8,0 для удаления непрочно связанных ферментов и PE Д - НАД, а затем вонокно помещают в 10 мп 3/-ного водного раствора L -лактама аммония, рН 7,4. Производят перемешивание при комнатной температуре в течение .10 ч.

Далее с помощью анализатора аминокислот определяют количество образовавшегося l„- апанина. Оно составняет О, 163 г (96% от теории).

То же волокно повторно вводят в контакт со свежим раствором лактата аммония. После 7 циклов использования процентное содержание 4 - апанина составляет 94% после 10 ч инкубации.

После 33 цикла оно составляет соответственно 90%. 1 - Алании выделяют осаждением этанслом при рН 6,2; (оц1 =

=+14,6 (c=2,0>5 н. HC J).

Пример 2. 2 r волокна, полученного как в примере 1, промывают

0,05 М фосфатным буфером, рН 8 и помещают в 10 мл водного раствора .спедуюшего состава: 0,05 М фосфатный буфер, рН 8;5 /о-ный (вес/объем) З, 1, -лак тат аммония. Через 10 ч содержание аланина составляет 98% от теоретичес618048 кого. То же волокно повторно помещают в 10 мп аналогичного раствора и расгвор заменяют через каждые 7 ч. Через

30 дней непрерывной работы содержание апанина после 10-часового цикла состав- 5 ляет 95% от теоретического.

Пример 3. Волокно готовят, как это описано в примере 1, но с заменой

PEG -HAH на попипизин-НАД. Реакцию ведут аналогично примерам 1 и 2. В пер- О

1О вом цикле через 10 ч содержание аланина составляет 92% от теоретического. Через

30 дней использования достигается 87% степень превращения.

Пример 4. Ферментсодержаший раствор готовят растворением компонент в смеси буфер-глицерин (75:25);, РЕ0 -НАД 25,5 мг/мп (3,78 мкмопь

НАД/мп); дегидрогеназа 3- сс -2- j3—

-оксистероида (фермент из 5 1 Вр10Ж СРЕ

Мф1 ОфВМамфиРма BOehа 1ngeV,Мают) Е1 а, С1пЬН, 12,5мг/мл (225 ед/мл, 25 С, этанол в качестве субстрата); апьдегиддегидрогеназа (фермент из дрожжей, QvpMa5igrng, Gt,l,Og j ") 30 мг/мл (90 ед./Mn, 25 С, ацетапьдегид в качестве субстрата), Волокно готовят как в примере 1.

2 г волокна, соответствующие 1 г

0 сухого полимера, промывают при 25 С в 10 мм буферного раствора триэтанопамина (0,1 М, рН 7,3), содержащего

0,3 М KCE . 5 мпмоль fb -меркаптоэтаноп и 1/0 этаноп. При этой операции под

35 действием дегидрогеназы спирта и дегидрогеназы альдегида РЕ3 -HAG превращается в свою восстановленную форму.

ranee врлокно помещают в свежий буферный раствор (10 мп) того же соста40 ва, содержащий дополнительно 2 мг. кортизона (Ь 4«прегнен-17-< -21-диоп-3, 11,20-трион). Раствор перемешивают при 25 С в течение 1 ч. Затем отделяют о волокно и раствор экстрагируют 3 порциями хлороформа по 2 мп, органический экстракт концентрируют в вакууме до объема 1 мл и определяют кортизон и

Ь 4-прегнен-17- а . -20- ф -21-триоп-3, 1 1-дион.

Степень превращения составляет 95%.

Тот же образец волокна использован в

20 циклах превращения с незначитепьным снижением активности.

Пример 5, Ферментосодержаший раствор готовят растворением компонентов в смеси буфер — глицерин (75:25);

РЕ3- НАД 25,5 мг/мп (3,78 мкмоль

HAll/ìë); дегидрогеназа Р- оксистероида (фермент из Pseudomenas testostevoni фирма"5 п1а,б Л,only" сорт ALT), 40 мг/мл; диафораза (фермент из сердца, свиньи, фирма "Boehvingev Mannhe1m маркаЦ )

19,4 мг/мп (содержит 6,45 мгlмп энзиматического бенка).

Волокно готовят как в примере 1. 2 г волокна промывают буферным раствором триэтаноламина(0,067 М рН 7,6) и помешают в 10 мп того же буфера, содержащего 288 мг тестостерона (17-Р-окси-д 4-андростен-3-он) и, 2,9 мг

2 6-дихпорфенопиндофенола. Раствор

9 о перемешивают при 25 С при пропускании через него кислорода дпя окисления восстановленного красителя.

Через 4 ч смесь экстрагируют тремя порциями этипацетата по 3 мп, органический экстракт сушат безводным сульфатом натрия, фильтруют и упаривают досуха. Твердый остаток растворяют в

0,5 мп метанола и определяют количество продукта Д 4-андростен-3, 17-диона.

Оно составляет 90%, из расчета на исходный тестостерон.

Пример 6. Используется то же волокно, что и в примере 5. 1 r волокна, соответствующий 0,5 г сухого полимера промывают буферным раствором гидрохпорида триэтанопамина, 0,06 М, рН 7,6.

Приготовлены пять растворов, содержащих буферный раствор гидрохпорида триэтаноламина, 0,06 М, рН 7,6, 2,6-дихпорфенопиндофеноп, 80 мкмопь и тестостерон (17/д -окси- Ь 4-андростен-3-он); 10мкмоль, 20мкмоль, 30мкмоль, 40мкмольи 50мкмоль. 1 гпромытого волокна помещают в 5 мп каждого раствоо ра и смеси перемешивают при 25 С, измеряя оптическую плотность при длине волны 600 нм. Построена калибровочная прямая, на которой откладывают разности оптической плотности. То же волокно повторно использовано дпя опредепения тестостерона в растворе, который содержал его в концентрации 30 мкмопь.

Во время ста отсчетов отклонений от калибровочной кривой не обнаружено.

Формула изобретения

1. Способ иммобилизации оксидоредуктазных ферментов, зависимых от никотинамидадениндинукпеотида (НАД) путем включения их в волокна полимера на основе триацетипцеллюлозы, отличающийся

618048

Составитель Л. Бочаров

Редактор Л. Герасимова Техред Н. Лндрейчук Корректор И. Гоксич

Заказ 4705 Тираж 559 Подписное

UHNMIIM Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, K-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 тем, что, с целью сохранения активности иммобилизованных оксидоредуктаз, осуществляют одновременное включение в вопокна иммобилизованного на водорастворимом поликатионите HAll и апоферментов оксидоредуктаз.

2. Способпоп. 1, от ли ча юшийся тем, что водорастворимыми по поликатионитами являются полиэтиленимин и попилизин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1Л итоЬ бхед Enzymes,ÎË.Zaboгвкч, CRC P ess, 1924.

2. Патент ССОР %364173, кл. кл,, Б 01 j 11//1100, 26.06,68,