Способ очистки оксидазы д-аминокислот

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Н llATEHTY

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) S72205 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 21,04.75 (21) 2125586/04 (23) Приоритет — (32) 22.04.74 (31) 7413865 (Ц) Франция (43) Опубликовано 05.09.77. Ьюллетень № 33 (45) Лата опубликования описания 25,07.77 (51) М. Кл. С07 G 7/02

Государственный комитет

Совета Мнннатрав СССР па делам нзабретеннй н аткрытнй (53) УДК 577,15.04.002.. 237.66 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Оноре Мазаргий, Франсуа Мейе и Пьер Мопсам (Франция) Иностранная фирма

"Рон — Прожил ь" (Франция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ОКСИДАЗЫ 0 — АМИНОКИСЛОТ

Изобретение относится к способу очистки оксидазы 0 - аминокислот, применяемой в химической промыци1енности для получения а-кетокислот, в частности пировиноградной кислоты.

Известен способ очистки оксидазы 0-амино5 кислот путем двукратного хроматографического разделения смеси белков, содержащей оксидазу

О-аминокислот, на колонке со смесью геля фосфата кальция с целлюлозой с иослелу1ошей перекристал. лиэацией белка в присутствии сульфата аммония, раствореииел1, хроматографироваиием на колонке с гелем Сефадекса Gx 75 и иов1ориой иерекристаллизаиией.

Однако известный способ труцоемок, длителен и связан с использованием хроматографических

15 носителей, которые мало усзойчивbl к действию тепла и давления и легко разруи1аютсн ири загрязнении микроорганизмами, 1 о ие позвощ1ет применяп его в и1гол1ьаиле1ип 1х л1аси11абах. 20

С иель1о упрощения процесса иредлгп ается смесь белков наносить иа fflfllcральиый носитель, солержаишй алкилксилильи|й ос1аток, зал1ещенпьи1 1руипой <1ю рл1улы

-NH 1СН > 1. - NH — 1111 1Y >- f ОО11

25 и проводить отделение оксидазы в среде этиленгликоля, предпочтительно при концентрации этиленгликоля 5 — 35 об. %.

Минеральный носитель состоит из окисей, гидроокисей или других нераствсримых и пористых л1инеральных соединений, на которых привиты замещенные или незамещенные группы галоидалкилсилана.

Для модификации носителя замещают галоид, содержащийся в носителе, остатком формулы

-NH (СН,),-NH (CH), )-СООН.

В этом случае обрабатывают носиЖь, замещенный галоидалкилсиланом, соединение ормулы

NH,— (CH,),-NH (CH,),/ ООС,H, по любой известной методике, в сп1ости в сусиензии при кипении, и проводят гидролиз в присутствии любой концентрированной кислоты, в особегности соляной.

Для очистки оксидазы 0-аминокислот хроматографическую колонку заполняют моцифипи. рованным носителем, сусие1щированныл1 в буфер е. имеющем рН, при котором не происходит ииакгивации ферменга, и чере 3 колонку пропускают смесь белков, сонержлцую окс1щазу и иахолящун1ся в буферном растворе. Колонку иромгнвают водой ц>и

572205

Составитель А. Бочаров

Техред И. Асталош

Редактор Т, Карганова

Корректор И. Гоксич

Тираж 553 Поднисное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

i 13035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 2232/58

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4

3 удаления неактивных белков, а затем вводят рао твор этиленгликоля о концентрацией менее

50 об, %. Практически актив ность очищенного фермента равна первоначалыюй активности смеси белков.

Применяемые реагенгы могут быть получень, известными способами, Пример. К 230 мл пер емешиваемого водного, раствора серной кислоты (;-120 г/л) добавляют по каплям водный раствор силиката натрия (220 г/g

SiO,), при рН 3,8 добавление силиката натрия прекращают, добавляют 2 капли алкилсульфоната натрия, вьшиваюг полученный золь в 8 л сильно перемешиваемого трихлорэтилена, наблюдая осаж дение шариков гидрогеля, добавляют 1 л аммиачной воды (рН 9) и фильтруют.

Шарики промывают 33 раза 0,1 н. соляной кислотой и водой. Полученный гидр огель содержит 80% воды.

120 г гидрогеля, 15 r триэтоксииодпропилсилана и 200 мл бензола нагревают до кипения и в течение 3 час удаляют 95 мл воды (азеотропная отгонка) . После охлаждения образовавшийся продукт обезвоживают, промывают ацетоном, сушат и получают привитой кремнезем с группами иодпропилсилана, содержащий 2,1 вес. % иода. Размер частиц менее 200 мк, уд, поверхность 425 м /r, объем пор 1,1 мл/г.

11 r привитого кремнезема вводят в 25мл бензольного раствора, содержащего 1,5 г соединения

H,N — (CH ),— NH — (СН ), / С(,ДС Н нагревают дисперсию 24час с обратным холодильником, охлаждают, отфильтровывают кремнезем, промывают его этанолом (удаление непрореагиро. вавшего соединения) до обесцвечивания растворителя и затем водой.

Полученный продукт и 50 мл 4 н. соляной кислоты кипятят 24 час, охлаждают, отфильтровывают шарики, промывают их дистиллированной водой и добавляют буферный раствор пир офосфата до рН 8,6. Фиксированное количество соединения

-1г.

Ц хроматографическую колонку загружают 11 г полученного привитого модифицированного кремнезеьи и со скоростью 9 мл/час пропускают 5 мл

0,2 М буферного раствора пирофосфата (pH 8,5), содержащего 150 мг смеси белков, включающей оксидазу О- аминокислот.

Для раствора, выходящего из колонки, определяют ферменгативную активность путем добавления о-аланина в 0,2 М буферном растворе пирофос1О фата (рН 8,3) и динитрофенилгидразина с последующим спектрофотометрированием при 440 нм.

Раствор не обнаруживает активности, что указывает на полную задержку оксидазы на носителе.

Затем через колонку с той же скоростью пропускают воду до тех пор, пока спектрофотс» метрирование раствора, выходящего из колонки, при 280 нм не подтвердит отсутствие неактивных белков.

Неактивные белки составляют 90% от всего количества белков.

Потом через колонку со скоростью 9мл/час пропускают 20 мл буферного раствора пирофосфата (рН- 8,5), содержащего 30 об.% этиленгликоля, и определяют ферментативную активность элюата, Активность элюата составляет 90% от активности исходной смеси. Коэффициент обогащения

100.

Формула изобретения

1. Способ очистки оксидазы D-аминокислот путем нанесения смеси белков, содержащих указанную оксидазу, на носитель с последующим отделением фермента от носителя, о тли чающий с я ав тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве носителя применяют минеральный носитель, содержащий алкилсилильный остаток, замещенный группой

NH (СН,),-NH (CH,);,- COPH а отделение фермента проводят в среде этиленглик оля.

2. Способ ло и. 1, от ли ч а ющ ий ся тем,что применяют этиленгликоль при концентрации 5 — 35 об.%.