Способ получения иммобилизованных ферментных препаратов

 

п11 608804

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Сееа Соеетееа

Соцнапнстнческщ

Респубпик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 28.06.76 (21) 2378187/04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 3005.78. Бюллетень № 20 (45) Дата опубликования описания 09.05.78 (51) М. Кл. С 07G 7/02

Государственный комитет

Совета Министров СССР по дела и изобретений н открытий (53) УДК 577.15.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

С. В. Ельчиц, В. Б. Пичко и В. А. Чугуй

Киевский технологический институт пищевой промышленности (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ

ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Изобретение касается технологии ферментных препаратов и может быть использовано в пищевой, фармацевтической и химической промышленности.

Известны многочисленные способы иммобилизации ферментов (1).

Все известные способы иммобилизации можно разделить на четыре основных метода: адсорбции, ковалентного связывания с носителем, заключения ферментов в гель и микроинкапсулирование.

Кроме того, для иммобилизации могут также успешно использоваться и комбинации перечисленных методов.

Прототипом изобретения является способ получения иммобилизованных ферментов, представляющий собой комбинацию ковалентной иммобилизации и иммобилизации путем изоляции фермента с помощью полупроницаемой мембраны (микроинкапсулирование) (2).

Этот способ включает ковалентное связывание фермента в присутствии субстрата с гидрофильным носителем, содержащим реакционноспособные группы и последующее покрытие частиц носителя с иммобилизованным ферментом полупроницаемой оболочкой, причем носитель получают при взаимодействии гексаметилендиамина и бисульфитного производного карбоксилсодержащего полимера, например пол и а крол еи на. В состав полупроницаемой оболочки, которой покрывают частицы, входят различные производные целлюлозы, например карбоксиметилцеллюлоза, ацетилцеллюлоза и др.

Однако такой способ длителен и трудоемок, поскольку процесс получения носителя длится от 18 — 20 ч до 4 дней и ведется в атмосфере азота при повышенных температурах (65—

75 С). Процесс собственно иммобилизации

10 длится 18 ч. В способе используются высокоочищенные ферменты и дорогостоящие реактивы, что увеличивает себестоимость получаемых иммобилизованных препаратов.

Кроме того, мелкие размеры частиц носи15 теля с ферментом создают большое сопротивление при работе в непрерывно действующих колонках, что ограничивает их применение в технологических процессах.

С целью упрощения процесса получения им20 мобилизованных ферментных препаратов при одновременном снижении себестоимости получаемых препаратов предлагается способ, состоящий из механического связывания фермента в присутствии субстрата с гидрофиль25 ным носителем — силикагелем, путем обкатки частиц силикагеля в растворе фермента и последующего покрытия частиц полупроницаемой оболочкой на основе ацетилцеллюлозы.

В настоящее время силикагель широко при30 меняется в практике иммобилизации фермен608804

400,2 руб.

2,4 млн. руб./год

0,21 месяца

65 тов и др. биологически активных соединений как нейтральный носитель, обладающий высокой адсорбционной способностью, химической инертностью, Й хорошими физическими свойствами;;.- Отечественная промышленность выпускает йесколько видов силикагелей не только с хорошо развитой поверхностью, но и со строго определенным размером пор, что обеспечивает известную изоирательность в отношении молекул иммобилизуемого вещества.

Технология способа состоит B следующем.

Силикагель в виде сферических частиц с диаметром 2 — 3 мм обкатывают в дражировочном аппарате в водной смеси следующего состава, %.

11репарат фермента 1,0

Субстрат фермента 1,0

Крахмал 1,0

Аэросил 0,5

Карбоксиметилцеллюлоза 0,5

Субстрат, вводимый в смесь для обкатки, служит .для стабилизации фермента, остальные компоненты служат для более прочного связывания фермента с носителем. При этом аэросил может быть заменен акриламидом, а карбоксиметилцеллюлоза может быть исключена из состава смеси.

Нанесение на носитель смеси указанного состава производится путем распыления при вращении дражировочного аппарата со скоростью 50 — 60 об./мин. Распыление смеси производится порциями, затем частицы носителя с нанесенной смесью подсушиваются в течение нескольких минут теплым воздухом (30—

35"С). После нанесения всего количества смеси частицы подсушиваются и погружаются B охлажденный (Π— 2 С) раствор пленкообразователя — 1 ацетилцеллюлозы в смеси ацетона и этанола, и высушиваются теплым воздухом. Операцию покрытия пленкой повторяют дважды и окончательно подсушивают частицы током теплого воздуха.

Пр им ер 1. В качестве препарата фермента использован препрат Р-галактозидазы, в качестве субстрата — лактоза. Активность препарата по лактозе составляет 150—

200 ед./г.

За единицу активности принято количество фермента, которое катализирует гидролиз

1 мкмоля субстрата за 1 мин при рН 4,2 и

30 С.

Для обкатки частиц носителя используют

50 мл водной смеси следующего состава, /ю. р-Галактозидаза 1,0

Лактоза 1,0

Крахмал 1,0

Аэросил 0,5

Кар боксиметилцеллюлоза 0,5

Нанесение смеси на частицы силикагеля (10 г) производится в дражировочном аппарате при постоянном его вращении методом распыления. Распыление производится порциями по 3 — 5 мл, после нанесения каждой порции частицы подсушиваются в течение 2 — 3 мин током теплого воздуха (30 — 35 С). Затем ча5

50 стицы с нанесенной на их поверхность смесыд и окончательно подсушенные погружаются на

5 мин в охлажденный (Π— 2 С) раствор пленкообразователя, содержащий 1 /ю ацетилцеллюлозы в смеси ацетона и этанола (60: 40) и подсушиваются теплым воздухом. Операции пленкообразования и подсушивания повторяют два раза. Высушенные частицы промывают дистиллированной водой до исчезновения белка в промывных водах и снова высушивают теплым воздухом. Выход активности полученного препарата р-галактозидазы 64,8 /ю.

Пример 2, Аналогично примеру 1 получают иммобилизованный ферментный препарат на основе р-фруктофуранозидазы (инвертазы)

Asp. awamori 16. В качестве субстрата используют сахарозу. Активность инвертазы по сахарозе 5000 ед./r. 3a единицу активности инвертазы принимают количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкмоля сахарозы за 1 мин при 30 С. Выход активности полученного препарата инвертазы 68 /ю.

Предлагаемый способ получения иммобилизованных ферментных препаратов обладает следующими технологическими преимуществами: возможность использования для иммобилизации неочищенных ферментных препаратов, выпускаемых промышленностью; максимальное сохранение нативных свойств ферментов; возможность применения для иммобилизации любых ферментов, катализирующих превращение низкомолекулярных субстратов; осуществление процесса с помощью технологических приемов, широко применяемых в промышленности; возможность широко варьировать размеры носителя; низкая себестоимость получаемых препаратов иммобилизованных ферментов.

Предварительный технико-экономический расчет для строительства цеха по реализации предлагаемого способа производительностью

20 кг препарата в сутки с активностью 10ед./r носителя с учетом затрат на строительство цеха, приобретение и монтаж оборудования (в том числе автоматической линии «Штайнберг»

18,5 тыс. руб.), основное и вспомогательное сырье, производственных рабочих и непроизводственных расходов показал следующее:

Полная себестоимость препарата 99,4 руб./кг.

Прибыль на 1 кг препарата

Общая прибыль

Окупаемость

Рентабельность продукции 401 ю/ю

В настоящее время в нашей стране препараты иммобилизованных ферментов не выпускаются, а цены препаратов, выпускаемых зарубежными фирмами, составляют 30—

120 руб,/г, т. е. 30000 руб.(кг, 608804

Формула изобретения

Составитель О. Скородумова

Редактор В. Мирзаджанова Техред А. Камышникова Коррсктор А. Степанова

Заказ 1371/5 Изд. № 421 Тираж 568

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

Таким образом, полная себестоимость препаратов иммобилизованных ферментов, получаемых целевым способом, составляющая при малых масштабах производства всего

100 руб./кг, в 300 раз ниже цен на аналогичные препараты, выпускаемые зарубежными фирмами.

1. Способ получения иммобилизованных ферментных препаратов, включающий связывание фермента с гидрофильным носителем в присутствии субстрата фермента и последующее покрытие полупроницаемой оболочкой, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве гидрофильного носителя используют силикагель, а связь1вание фермента с гидрофильным носителем осуществляют механически — путем обкатки частиц носителя в растворе фермента.

2, Способ по и. 1, отличающийся тем, что в качестве фермента используют р-галактозидазу, а в качестве субстрата — лактозу.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве фермента используют инверта10 зу, а в качестве субстрата — сахарозу.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Кестнер А. И. Иммобилизованные ферменты. — «Успехи химии», 1974, т. 43, вып. 8, с. 1480.

2. Патент США Мю 3730841, кл. С 07G 7/02, опублик. 01.05.73,