Способ получения электропроводных фермент-ковакторных систем

 

Союз Советскик

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 593439 (6I ) Дополнительное к авт. саид-ву(22) Заивлено04.08.75 (21) 2 163035/04 (5 I ) M. Кл. с присовдиненнем заявки ЖС 076 702

Говударстввнный комитет (23) Приорнтет— по делам нзооретений н открытий (53) УДК 577. 15. .0 7 (О 88. 8) Опубликовано 07. 10,80. Ь оллетень № 37

Дата опубликования описания 1Q.)0.80 !! (72) Авторы изобретения

П. П. Гладышев, М. И. Горяев и iO. А. Шаповалов

Ордена Трудового Красного Знамени институт химических наук АН Казахской ССР (7I) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОПРОВ ОЧНЫХ

ФЕРМЕНТ-КОФАКТОРНЫХ СИСТЕМ

Изобретение относится к способу получения алектропровоцных фермент-кофакторных систем, которые могут найти применение в ферментативных электрохимических реакторах, топливных алеменS тах и индикаторных электродах.

Известен ряц способов получения иммобилизованных коферментов. Такие системы используются в основном для целей аминной хроматографии. Известен,<

t0 в частности способ получения кофермента никотинамидадеииндинуклеотида (НАД) ковалентно связанного с полиэтиленом С 13, Это водорастворимое производное, обла- дающее коферментной активностью со своI5 бодной и связанной с матрицей дегидрогеназой (кофермент может быть, восстановлен до НАДН). Ковалентно связанное восстановленное производное

НАДН) в свою очередь может быть окислено с участием лактатдегидрогеназы. Однако полученные Qo последнего времени продукты иммобилизации коферментов на нерастворимых и растворимых неэлектропровоцных полимерах и продуктах неорганической природы непригодны цля ис польз ов ан ия их в ферментативных электрохимических реакторах, топливных алементах и индикаторных алектроцах, вследствие их неспособности обеспечить электропровоцность иммобилизов анной системы.

С целью получения ферменткофакторных систем, обладающих проводниковыми свойствами и способных обеспечить перенос заряда с иммобилизованных кофакторов на электропроводный матери ал матрицы, а также с целью разработки стюсоба удаления с алектропроводной основы отработанных неактивных веществ и нанесения на нее новых активных компонентов в предлагаемом способе сорбцию кофактора производят на различные электропроводные материалы (графит, окисленный графит, металлы, карбохромы). Замена инактивированных в процессе длительной работы кофактора и фермента на новые осуществляется посредст3 5934 вом десорбции в условиях, отличных от тех, в которых работает система — ферментиммобилизоввнный кофермент.

Прецлагают способ получения электро« проводных ферменткофакторных систем путем адсорбции кофакторов — никотина-мидацениндинуклеотида в окисленной (НАД) или восстановленной (НАДН) форме, никотинамидацениндинуклеотидфосфата в окисленной (НАДФ) или восстановлен- 0 ной (НАДФН) формах или флавинадениндинуклеотида в окисленной (ФАД) или восстановленной (ФАДН) формах — на различные электропроводные материалы - графит, окисленный графит, метал- 15 лы, карбохромы, с последующим контактированием полученной системы с раствором, содержащим соответствующие субстраты и ферменты.

Воэможность получения фермент-кофвкторных систем на различных электропроводных материалах проверена на системе: окисленный графит — НАДалкогольдегидрогенаэа. Для этого 25 кофермент НАД сорбируют из водного

0,015 М буферного раствора фосфора калия с рН 7,7 на гранулированный графит, который предварительно обрабатывают кипеней концентрированной азот- 50 ной кислотой в течение 6 ч. Получен-ная таким образом ферменткоферментная систсма прочно удерживается на, электропроводном метериале — окисленном графите. Система работает в течение 250 ч в условиях работы системы фермент-кофактор, при этом не наблюдается заметной инактивации активных компонентов. В случае потери активности системы, например, во време- 40 ни, осуществляют ее десорбцию водноспиртовой смесью (3:1) при рН 10 с последующей иммобилизацией активных компонентов.

Пример 1. Иэ исходного раствора восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН ) с концентрацией 0,005 моль/л в буферном

0,015 M растворе фосфата калия с рН

7,7 берут вликвоту, содержащую

260 ° 10 r НАДН в 2 мл буферного раствора (количество взятого для сорбции НАДН проверяют спектрофотометрическим методом при 340 ммк в 1 см кювете, учитывая, что коэффициент светопоглощения для НАДН E ®

6,2). Приготовленный раствор кофермента приливают к О, l г гранулиро39 4 ванного графита, предварительно окисленного кипяией концентрированной азотной кислотой в течение 6 ч. Сорбцию кофермента проводят при 5 С в течение 1 ч и периодическом перемешиваиии. После сорбции графит отделяют от раствора и последний спектрофотометрируют.

По разности исходных и конечных количеств НАДН.,определяют величину сорбции. Для окисленного графита она соответствует 62%. Слабо связанный с сорбентом HAQH отмывают буферным раствором.

Количественное определение иммобилизированного на графите НАДН осуществляют по нинги црии-сернокислотной методике (2J, Для этого готовят раствор, содержащий следующие компоненты: О, 15 ммоль/мл буфера фосфата калия и рН 7,7, 50 мкмоль/мл этанола, l7 мкмоль/мл лвктальдегица и О, 16 мг/ мл алкогольдегицрогеназы (все компоненты реакционной смеси смешивают о прй О С). 0,2 мл полученной смеси приливают в пробирки: со стандартными растворами, содержащими известное ко,пичество HAQH@, и с О, 1 г графита с сорбироввнным НАИН ° Реакционные смеси инкубируют в термостате при 37 С в течение 45 мин, после чего графит отделяют от раствора, ферментативную реакцию останавливают добавлением 1 мл концентрированной серной кислоты в выделенный и стандартные растворы.

Растворы тщательно перемешивают и снова инкубируют при 7ОО С в течение

10 мин. Затем реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и при тщательном перемешивании добавляют 40 мкл свежеприготовленного раствора нингидрина (3% нингидрина и

5% бисульфита натрия). Раствор оставляют стоять при комнатной температуре в течение 60 мин, затем в смесь приливают еще 1 мл концентри- рованной серной кислоты и оставляют стоять при комнатной температуре в течение 5 мин, Оптическую плотность раствора замеряют при 595 ммк.

Количество сорбированного кофермента определяют по калибровочной кривой в зависимости от величины оптической плотности, Получают количественное значение сорбированного НАДН, проявляющего физиологическую активность ь иммобилизованном состоянии. Оно равно 74% от общего количества кофермента, сорбированного на графит.

5 593

Многократные опыты по определению активности иммобилизованного на окис- ленную поверхность графита кофермента дают стабильное дают стабильные результаты.

Пример 2. К 100 мг карбохрома приливают 2,5 мл 0,002 M раствора

НАДФН, содержащего 0,015 М буферный раствор фосфата калия с рН 7,8, Количественную оценку содержания НАДФН осуществляют спектрофотометрическим методом при 340 ммк в 1 см кварцевой кювете. Коэффициент светопоглощения для НАДФН равен Е1 0 = 6,3 ° 10

Сорбцию проводят в течение 2,5 ч при

5 С, раствор затем отделяют центрифугированием и спектрофотометрируют, По разности исходных и конечных количеств НАДФН определяют величину сорбции, На карбохроме сорбция НАДФН составляет 4,8 мг HB 1 г сорбента Много— кратное промывание сорбента 0,0 15 M буферным раствором с рН 7,8и последующее с пектрофотометрирование промывных вод свидетельствует о стабильности иммобилизованной системы. ки по максимуму поглощения при 340 ммк.

Е у О= 6,3 ° 10 . Найдено, что сорбция

НАДФН на окисленном графите составляет

7,8 мг на 1 г сорбента.

Пример 4. 2,5 мл 0,002 Q раст вора HAL!ФН в 0,0 1 5 М раствора фос« фата калия с рН 7,8 приливают к 100 мг платиновой черни. Сорбцию проводят

b течение 2,5 ч при 5 С. Затем

> лорошок отделяютот раствора центр>ифугированием. Раствор спектрофотометрируют и определяют количество сорбированного НАДФН. На платиновой черни сорбируются 4,4 мг НАДФН на 1 г сорбента. Многократное промывание буферным. раствором сорбента с иммобилизованным

НАДФН показывает стабильность системы.

Аналогично проводят сорбцию коферментов НАДН и ФАД на платиновой черни. Величина сорбции НАДН 3,6 мг/г, ФАД 2,6 мг/г.

10 l5

2Î

Сорбция рассматриваемых коферментов на графите незначительна (в пределах О, 1-0,5 мг на 1 г}.. Восстановленные и окисленные формы коферментов сорбируются одинаково.

Пример 5. С целью доказательства способности фермент-кофакторной системы обеспечивать перенос заряда на электропроводный материал матрицы использован биологический топливный элемент, в котором ЗДС возникает за счет сопряженной ферментативной окислительно-восстановительной реакции. Перенос заряда в элементе достигается за счет того, что в качестве катализатора используется иммобилизованный на электропроводной основе ферМент-кофакторный комплекс.

В этом случае фермент и его кофактор являются частью электрода, на котором происходит непосредственный перенос заряда с материала электрода в активные центры ферментов.

На фиг. 1 приведена схема реконструированной НАД-зависимой ферментативной системы, где Е и Е - иммобилизованные ферменты, АН и. В - продукты скис, ления и восстановлениями- на фиг. 2 - механизм работы двухэлектродной системы, построенной по указанному принципу; на фиг. 3 - схема топливного элемента.

Чтобы исключить возможность протекания побочных процессов, используется симметричная система из эквивалентных попуэлементов с одним и тем же НАД-завиСорбцпю коферментов НАДН И ФАД на карбохроме проводят аналогичным путем.

Разница лишь в том, что для ФАД в качестве буферного раствора используют

0,1 М раствор фосфата калия с рН 7,0.

Коэффициент светопоглощения для ФАД йьо= 25>3 10 . Сорбцпя ФАД На

Ъ карбохроме составляла .1;2 мг/г, НАДН35

3, 1 мг/г.

Пример 3. К 100 мг окисленного графита. приливают 2,5 мл 0,0032 M раствора ФАД, содержащего О, 1 М буферный раствор фосфата калия с рН 7,0.4О

Количество ФАД определяют спектрофотометрическп по максимуму поглощения в области 260 ммк. Анализ выполняют в 1 см кварцевой кювете. F 6 25,3

Ъ

10 . Сорбцию проводят в течение 2,5 ч гри 5" С, затем раствор фильтруют

: центрифугированием. По количеству ФАД до и после сорбции судят о ее величине, На 1 r окисленного графита сорбируется

2,1 мг ФАД. Промывание сорбента 0,1

М буферным раствором с рН 7,0 и последующий анализ промывных вод свидетельствует о стабильности полученной системы.

Аналогично проводят сорбцию НАДФН на окисленном графите. Для этого используют 0,015 Мфосфатный буферный раствор с рН 7,8, Количественную оценку сорбции осуществляют спектрофотометричес20

59343 симым ферментом и фоновым электролитом. В качестве модельной ферментативной системы выбрана алкогольдегидрогеназа (АДГ) в сочетании с никотинамидадениндинуклеотидом (HAQ). Ферменткофакторная система получена иммобилиэацией на электропровопной матрице. В качестве электролита используют 0,015

M фосфатный буфер с рН 7,7 на фоне

0,5 М раствора хлорида натрия. Электро 10 химические исследования проводят в . микроячейках, изготовленных из полиметилметакрилата и фторопласта. В одном из полуэлементов проходит окисление спирта до ацетальдегида, и другом— 15 восстановление лактальдегида до 1,2пропандиола. В результате электрохимического сопряжения указанных процессов в системе возникает ЭДС. При замыкании полуэлементов через нагрузку в системе генерируется устойчивый ток.

Биологический топливный элемент, работаюший по предлагаемому способу, в котором используется иммобилизованная на электропровопнсм носителе фермент-кофакторная система, имеет ряд преимушеств; исключается стадия диффузии компонентов в объему раствора, а также перенос кофактора между электродом и ферментом, лимитирующие окислительно-восстановител.ную реак-. цию; обеспечивается эффективный перенос заряда с кофермента на матрицу электрода; появляется возможность распространения этого принципа на многие фермент- кофакторные системы, что позволяет использовать в топливных элементах самые разнообразные субстраты в качестве топлива и окислителя.

Топливный элемент состоит из симмет-40 ричных эквивалентных камер А и Бе Графитовый электропровопный корпус 1 камер заполняется гранулиров анным окисленным графитом 2 с сорбированной ферменткофакторной системой. В целях эффектив- 4> ной подачи продуктов в зону реакции и удаления отработанных веществ проводят рециркуляцию растворов в камерах А и

E. Рециркуляцию субстратов осуществляют с помощью перестальтического насоса 3.

Электрическая схема топливного элерф мента состоит из электролитического мостика 4, заполненного сефадексом Г 150 в 0,0 15 М буферном растворе фосФата

1 серж раствор хлорида натрияа Для эффективного снятия заряда к омедненной снаружи поверхности 5 графитового корпуса 1 топливного элемента лрипаффн контакт 6.

9 8

Для контроля тока,и напряжения, возникающего в результате ферментативных окислительно-восстановительных, процессов, используются микроамперметр

7 и милливольтметр 8.

В качестве модели выбрана НАД-зависимая фермент-кофакторная система.

Она создается сорбцией НАДН на окисленном графите в растворе 0,015 М буферного раствора фосфата калия с рН 7,7 и последующей иммобилиэацией ферментаалкогольдегидрогенаэы (АДГ), В предлагаемой системе фермент АДГ участвует как в окислении этилового спирта до ацетальдегида, так и в восстановлении лактальдегида в 1,2-пропандиол.

Камера А биологического топливного элемента, в которой идет окисление спирта по схеме

СН СН ОН

CH> CHO + 2Н, содержит 1 М раствор этилового спирта в 0,015 М фосфатном буферном растворе с рН 7,7 на фоне 0,5

М раствора хлорида натрия. Спирт, окисляясь, отдает .два электрона, которые посредством фермента по сопряженной иммобилизированной электропроводной цепи, включающей кофактор, переносятся в камеру Б

НАДН Е НАД + Н, (камера А — генерация восстановленной формы кофактора) (камера Б - генераппя окпспенноя формы кофактора) и затем принимают участие в восстановлении лактальдегида в 1,2пропандиол СН> СН (ОН) СН + 2Н еХе СН2СН (OH) СН20Н, В камере Б нспопьеуется 0,03 М раствор лактальдегида в фосфатном буферном растворе на фоне 0,5 М хлорида натрия, Опыты показывают, что реконструированная ферментативная система может эксплуатироваться в течение длительного времени беэ потери каталитической Ек- тивности. Увеличение скорости рециркуляции субстратов приводит к значительному воэростанию тока, что обусловлено интенсификацией транспорта субстрата к ферментативной системе.

Формула изобретения

1. Способ получения электропроводных фермент-кофакторных систем, о т л и ч аю,шийся тем, что щроиэводят адсорбцню кофакторов-никотинамидадениндинуклеотида в окисленной или восстановленной

9 593439 форме, никотинамидадениндинуклеотидфосфата в окисленной или восстановленной форме или фпавинадейиндинуклеотида, в окисленной или восстановленной форме на электропроводный материал — матрицу, с последующим контактированпем полученной системы с раствором, содержащим соответствующие субстраты и ферменты, фиг. фиг. 2

2,.Способ по и. 1, о т л и ч а юш и и с я тем, что в качестве электропроводных материалов используют графит, окисленный графит, металлы, карбохромы.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе .z.a.адеь, р.вциоме, м.де ее, 81осЬ!Ю.Ь10РЙЮ.АЬФ6,1972, 286, 260268.

1О 2..С.L.МЕОСЮец, N.К.Cupola, алаИt1Ñ01Å 910С116Ю $1Г 1971, 43, 343.

593439

Фиг. 5

Составитель А. Бочаров

Редактор Т. Колодцева Техред T. Маточка Корректор Л. Иван

Заказ 8655/71 Тираж 495 Подписное

ВНИИ ПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4