Способ получения иммобилизованной амилазы

 

1п1 58 6182

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 30.08.74 (21) 2056243/23-04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.12.77. Бюллетень ¹ 48 (45) Дата опубликования описания 01.02.78 (51) М. Кл з С 07G 7/02

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

В. П. Торчилин и |:. Б. Макарова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ а-АМ ИЛ АЗЫ

Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов, которые могут найти применение в химическом и фармацевтическом производстве, а также в пищевой промышленности.

В числе ферментов, представляющих особый интерес для получения в иммобилизованном состоянии, следует назвать а-амилазу, которая находит широкое применение в пищевой промышленности для гидролиза крахмала до сахаров.

К настоящему времени известен целый ряд препаратов иммобилизованной а-амилазы, полученных как ковалентным связыванием фермента с полимерным носителем, например модифицированной целлюлозой, так и включением в полиакриламидный гель.

В частности, известен способ ковалентного связывания а-амилазы с эфирами целлюлозы. В этом случае иммобилизацию фермента проводят на предварительно обработанном для введения реакционноспособных групп носителе, например, диазосочетанием фермента с диазотированными 3- (n-аминофенокси) -2оксипропиловым и 2-окси-3- (и-изотиоцианатофенокси) -пропиловым эфирами целлюлозы.

Для иммобилизации раствор фермента в водном буфере при соответствующем значении рН перемешивают с нерастворимым носителем, причем иммобилизацию ведут при пониженных температурах в течение длительного времени, получая в результате препарат иммобилизованного фермента, обладающий в зависимости от условий процесса различным со5 держанием активного фермента, не превышающим, однако, во всех случаях 15 мг активноIo фермента на 1 г полимерного носителя.

Однако такой способ, как и другие, известные к настоящему времени и имеющие лишь

10 незначительные отличия, имеет ряд недостатков, к которым относятся: сложность получения активированных полимерных носителей, использование токсичных препаратов, низкая контролируемость процесса иммобилизации, 15 малая технологичность получаемых продуктов (а в случае включения фермента в гель — заметное вымывание активного фермента в процессе работы), а также невысокое качество получаемых препаратов, определяемое коли20 чеством связанного активного фермента на едипицу веса носителя.

Термическая стойкость получаемых продуктов невысока — при выдерживании в течение 7 дней при 45 С они сохраняют лишь 20% ис25 ходной активности, Целью изобретения является упрощение процесса иммобилизации фермента а-амилазы, а также повышение качества продукта.

Это достигается за счет того, что а-амила30 зу вводят в водную или спиртовую среду вме586182

Таблица 1

Время реакции, ч

100

110

90

100

2

24

Таблица 2

Время реакции, ч

50

100

24

2

30

110

105

120 сте с карбодиимидом, а в качестве полимерного носителя используют карбоксилсодержащий материал.

Предлагаемый способ заключается в том, что а-амилазу вводят в водную или спиртовую среду вместе с сочетающим агентом— карбодиимидом, используя в качестве носителя карбоксилсодержащий материал, например полипропиленовую ткань с привитыми группами акриловой кислоты, частично гидролизованный полиэтилентерефталат и т. д., в форме тканей, пленок, гранул, волокон и т. и.

При этом в случае проведения иммобилизации в водной среде прп значениях рН порядка 5 в соответствующем буфере, когда фермент полностью растворим, в качестве сочетающего агента применяют водорастворимые карбодиимиды, например 1-циклогексил3- (2-мор фолиноэтил) — кар бодиимид-л-и-толуолсульфонат и т. д.

Учитывая, что водорастворимые карбодиимиды представляют собой дорогие и дефицитные реактивы и сложны в производстве, предлагаемый способ предусматривает возможность проведения иммооилизации а-амилазы в этиловом спирте с использованием в качестве сочетающих агентов значительно более дешевых и менее дефицитных карбодиимидов, растворимых в органических растворителях, например дициклогексилкарбодиимида. При этом а,-амилаза образует в спирте не раствор, как в воде, а суспензпю, и таким образом иммобилизация протекает в гетерогенных условиях.

Схему иммобилизации можно представить следующим образом: фермент образует в спирте суспензию, очень небольшая часть фермента переходит в раствор, где взаимодействует с носителем через сочетающий агент, вызывая таким образом переход в раствор еще одной порции фермента, ее иммобилизацию и т. д.

Таким образом, настоящий способ предусматривает возможность иммобилизации фермента как из гомогенного раствора в воде, так и из суспензии в органическом растворителе — спирте. При этом количество иммобилизуемого фермента легко удается регулировать изменением его концентрации в исходной смеси, изменением концентрации сочетающего агента и изменением времени реакции.

Применяемые в способе в качестве исходных веществ соединения являются продажными препаратами или могут быть получены известными способами.

П р и м ер 1. 1 г а-амилазы (препарат Лмилоризин-П10х производства рассказовского химзавода с амилолитической активностью

2000 ед/г) растворяют в 100 мл ацетатного буфера с рН 5,0 и ионной силой 0,02. Раствор охлаждают до 4 С, помещают в него образец полипропиленовой ткани с 12 вес. % привитой акриловой кислоты размером 4+4 см и при перемешивании добавляют различные

65 количества растворенного в том же буфере водорастворимого карбодиимида с мол. весом

492. Реакцию сочетания ведут в течение 2—

48 ч. Затем ткань извлекают, промывают

500 мл того же ацетатного буфера, 250 мл

1М NaCl, 250 мл 0,001 н. НС1 и 500 мл воды, все промывки ведут порциями по 50 мл и вы.сушивают. Амилолитическую активность препарата иммобилизованной а-амилазы определяют фотокалориметрически по количеству расщепленного крахмала.

Количество активной иммобилизова иной а-амилазы в мг/г носителя в зависимости от концентрации карбодиимида и времени реакции приведено в табл. 1.

Количество активной иммобилизованной а-а ми лазы, м г/г, при концентрации карбодиимида, мг

Пр и мер 2. 1 г а-амилазы суспендируют в

100 мл 9б% -ного этилового спирта, суспензию охлаждают до 4 С, помещают в нее такой же образец носителя, как в примере 1, и при перемешивании добавляют различные количества растворенного в спирте дициклогексилкарбодиимида. Бремя реакции и npoxtaraKa ткани после иммобичизaции такие me, как и в примере 1, 1(оличество активной иммобилизованной а-амилазы, мг/r носителя, в зависимости от концентрации карбодиимида и времени реакции приведено в табл. 2.

Количество активной иммобилизованной а-амилазы, мг/г, при концентрации карбодиимида, мг

Пр им ер 3. Суспензию а-амилазы готовят по примеру 2 и помеща;от в нее образец полиэтилентерефталатной пленки 4+4 см, предварительно подвергнутый гидролизу 3 н. НС1 при 80 С в течение 48 ч. Все дальнейшие процедуры проводят, как в примере 2.

586182

Таблица 3

Формула изобретения

Количество активной иммобилизованной а-амилазыь мг/г, при концентрации карбодиимида, мг

Время реакции ч

100

25

60

55

10

48

65

Составитель А. Богаров

Техред И. Карандашова

Редактор Т. Никольская

Корректор О. Тюрина

Заказ 3173/4 Изд. Re 109 Тираж 563

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

Количество активной иммобилизованной аамилазы в мг/г носителя в зависимости от концентрации карбодиимида и времени реакции приведено в табл. 3.

Во всех трех случаях для каждого образца было проведено по 120 испытаний его активности, которая оказывалась постоянной, к то6 му же все образцы сохраняли до 80% активности после выдерживания в течение 7 дней при 40 С.

1. Способ получения иммобилизованной

10 а-амилазы на полимерном носителе, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса иммобилизации и повышения качества продукта, а-амилазу вводят в водную или спиртовую среду вместе с карбодиимидом, а

15 в качестве полимерного носителя используют карбоксилсодержащий материал.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в водной среде применяют водорастворимый карбодиимид.

20 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в спиртовой среде применяют карбодиимид, растворимый в органических растворителях.