Способ получения иммобилизованных ферментов

 

ОП ИСАНИЕ „„пе, ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскыи

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 21,08.74 (21) 2058144/23-04 (23) Приоритет — (32) 22.08.73 (3l) 7330413 (33) Франция (51) М. Кл. С 07 Сэ 7/О

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изооретений и открытий (43) Опубликовано 30.!0.77. Бюллетень № 40 (53) УДК 577.15.07 (088. Й) (4б) Дата опубликования описания 29.12.77 (72) Автори изобретения

Иностранцы

Жильбер Дюран и Пьер Монсан (Франция) Иностранная фирма

"Рон-Прожиль" (Франция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к способу получения нммобнлизованных ферментов. Комплексы носитель-фермент могут находить применение в качестве специфических катализаторов в химической, пищевой и фармацевтической промышленности.

Известно, что использование ферментов в малотоннажной промышленности ограничено их нестабильностью. При более рациональном использовании ферментов их фиксируют на нерастворимых носителях при помо.ци адсорбции или введением в нерастворимые гели, или путем образования ковалентной связи между носителем и ферментом.

В литературе описаны многочисленные способы получения иммобилизованных ферментов. Наиболее часто используется метод фиксации ферментов на носителях посредством образования между ними ковалентной связи. Он осуществляется путем контактирования фермента с активированным носителем в среде полностью или частично водной. Прн этом поддерживают рН, при котором фермент стабилен, и температуру ниже 50 С.

Однако скорость процесса фиксации является медленной, а получаемые комплексы носительфермент часто недостаточно стабильны или малоактивны 11). Кроме того, в этом процессе наблюдается реакция молекул воды с реакциоппоспособными группами носителя, по приводит к 01рапиченной фиксации фермента, а следовательпо - к получению недостаточно стабильных и ак гнвпых

5 препаратов.

С целью повышения стабильности фермента. связанного с носителем, в предложенном способе процесс ведут в среде безводного апротоппого растворителя при 30 — 120 С, что позволяе получать комплекс носитель-фермент с повьппеппым количеством фиксированного фермента.

В литературе отсутствуют сведения о способе получения иммобилизованных ферментов. который осуществлялся бы в безводной органической среде.

15 В качестве апротонных органических растворителей используют алифатическне, циклоалпфатическне и ароматические углеводороды.

В качестве носителя используют минеральные. органические или органоминеральные соединения, рв не растворимые в органической среде и обладающие одной или несколькими реакционноспособпыми функциональными группами, такил1и как амин, карбоксил, сульфогндрил. гндроксил. В случае. когда носитель не обладает сам по себе указанп и р11 группами, его модифицируют.

578893

25

45

60

В качестве носителей применяют кирпич, окись кремния, окись алюминия, глину, лесок, агарозу, крахмал, полидскстраи, целлюлозу, полимеры, такие как полибутадиен, полистирол сетчатый или не сетчатый, сополимеры метакриловой кислоты, сополимеры малеинового ангидрида и этилена, Носитель модифицируют или активируют таким образом, чтобы снабдить его одной или несколькими функциональиыми группами, реагирующими с ферментом. Модификацию осуществляют известными способами в зависимости от природы взятого . носителя и фиксируемого фермента. Активацию ведут диаэотированием или галогенированием, или сульфированием. Можно назвать реакции носителя, например, с галогенидами сульфурила, цианурила, дициана, тионила, прививочную сополимериэацию носителя, а именно полимеры с полифункциональными гидролиэую1цимися силаиами или с карбонильными группами.

Такие носители применяются в виде зерен,размер которых в большинстве случаев больший, чем

100 мкм, может сильно меняться. Они должны быть свободны от всех продуктов, ингибирующих или деиатурирующих ферменты, и от всяких следов воды.

В качестве органической среды, не растворяющей фермент, используют углеводороды алифатические, циклоалифатические,ароматические, например гексан, бензол, толуол, ксилол, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан, трихлорэтан, трихлорэтилен, лерхлорэтилен, диоксан, тетрагидрофуран, диметилсульфоксид. Углеводороды применяются индивидуально или в смеси.

Процесс проводят следующим образом.

Активньй носитель и один или несколько ферментов диспергируют одновременно или последовательно в углеводороде, затем реакционную смесь нагревают до температуры реакции, предпочтительно до температуры кипения, в течение времени, необходимого для фиксации фермента. Фермент берут в избытке по отношению к функциональным группам носителя. Количество используемого углеводорода меняется в зависимости от природы носителя и фермента. Процесс ведут при 30 — 120 С, температура зависит от природы утлеводорода и фермента. Для ускорения реакции можно работать при повышенном давлении. В отличие ат известного метода рН среды в процессе фиксации не влияет на свойства фиксированного фермента. Время реакции составляет от нескольких минут до 2ч. После фиксации углеводород легко отделяют и полученньп1 комплекс носитель-фермент промывают буферным раствором, взятым с таким рН и такого состава, чтобы он не вызывал денатурацию комплекса. В результате фермент адсорбируется на носителе. Затем фермент можно испольэовать вновь в реакции фиксации.

Полученные комплексы носитель-фермент состоят из одного или нескольких ферментов, фиксированных на носителе. В случм, когда комплекс содержит несколько ферментов, последние могут фиксироваться либо одновременно, либо последовательно. Хорошие комплексы получают смешивание м двух комплексов.

Количество фермента, фиксированного при помощи ковалентных связей, зависит от природы фермента, а также от природы и структуры носителя.

Предлагаемые комплексы носитель-фермент могут существовать при более высоких температурах, чем известные комплексы, полученные в водной среде. Кроме того, их выгодно использовать непрерывно в течение довольно длительного времени, так как фермент не теряет своей активности.

Пример 1. Фиксация пектиназы на кирпиче.

Растолченный и просеянный однородный . кирпич с размером зерен 0,5 — 0,8 мм промывают дистиллированной вод й, затем водным раствором

1 и, соляной кислоты и опять дистиллированной водой. После прокаливания в течение 15 ч в атмосфере кислорода при 700 С получают активированный кирпич, не содержащий примесей. 2 r кирпича вносят в 40 мл 10 -ного по объему раствора хлористого сульфурила в безводном бенэоле. Затем суслензию перемешивают, доводят до температуры кипения и выдерживают при этой температуре 20 ч.

Полученньй активньй кирпич отделяют.

0,5 r продажной пектиназы и затем 2 г активного кирпича диспергируют при помощи звука в

50 мл безводного бензола. Полученную дисперсию нагревают при температуре кипения 1 ч. После охлаждения твердое вещество отжимают, промывают 20 мл 1 М раствора хлористого натрия, оставляя смесь стоять 15 ч при 4 С, центрифутируют и сушат. Промывание проводят 7 раз, что позволяет

1 десорбировать адсорбированньй на носителе фермент, который можно использовать снова. После каждого промывания твердого вещества, состоящего из комплекса носитель-фермент, в котором фермент фиксирован на носителе при помощи ковалентной связи, определяют фермеитативную активность. Это делают следующим образом.

1 г комплекса диспергируют в 10 мл 0,4 -ного по весу раствора полигалактуроновой кислоты в ацетатном 0,01 М буферном растворе с рН 4.

Дисперсию нагревают при 35 С 30 мин. После охлаждения и декантации отбирают 5мл раствора, затем прибавляют 0,3 мл 9 ного по весу раствора сульфата цинка в воде и 0,3 мл 1 н. водного раствора соды н дают отстояться. После центрифутирования определяют количество восстановленных соединений в оставшейся части при помощи динитросалицилатного метода. Для сравнения каждый опыт повторяют, осуществляя фиксацию в водной среде. При этом берут раствор 0,5 мг пектиназы в

50 мл воды, 2 г активного кирпича и выдерживают при 4 С 7 ч.

Полученные результаты приведены в табл. 1, где они выражаются в процентах активности

578893 комплекса по отношению к активности фермента до фиксации.

Как видно иэ табл. 1, фиксация фермента в бензоле является более быстрой, чем в водной среде. Кроме того, пектнназа, фиксированная в органическом растворителе, является более стабильной, чем пектиназа, фиксированная в водной среде. С другой стороны, для пектиназы, фиксированной в органической среде, сначала наблюдается некоторое понижение активности; затем активность остается постоянной после 3-го про;взывания, в то время как активность пектиназы, фиксированной в водной среде, непрерывно уменьшается. Таким образом, количество фермента, ковалентно фиксированного в органической среде, определенновыше, чем количество, фиксированного в водной среде.

Пример 2. Фиксация папаина на кирпиче.

2 мг папаина и 2 г активного кирпича,аналогичного при меру 1, суспендируют в 20 мл гексана.

Полученную суспензию нагревают с обратным холодильником 1 ч, После охлаждения отделяют твердое вещество, промывают водой, 20мл 1М раствора хлористого натрия и еще раз водой. Затем. измеряют ферментативную активность полученного комплекса носитель-фермент, суспендируя последний в 1 мл воды, прибавляют 9 мл 0,3 -ного по весу раствора казеина в фосфат-цитратном 0,025 М буферном растворе с рН7. Суспензию нагревают при 37 С 10 мин. После охлаждения и декантации отбирают 4 мл раствора и прибавляют 4 мл

10 о-ного по весу водного раствора трихлоруксусной кислоты. Иэбьпок казеина уходит в осадок, его отфильтровывают и в фильтрате определяют содержание пептидов по методу Лоури. Комплекс носитель-фермент снова промывают водой, 1 М раствором хлористого натрия и водой и опять измеряют (жрментативную активность. Эти операции повторяются несколько раз. Для сравнения фиксируют папани на том же носителе в водной среде при 40 С

7 ч. После промывания измеряют ферментативную активность указанным способом. Результаты (в мкг свободных пептидов на мл/мин) представлены в табл, 2.

Как видно из табл. 2,фиксация папаина в гексане более быстрая, а количество фиксированного фермента в 10 раз больше, чем в воде.

Пример 3. Фиксация трипсина на кирпиче.

Повторяют опыт примера 2, заменяя папаин .трипсином. Полученные результаты приведены в табл. 3.

Как видно из табл. З,фиксация трипсина в гексане более быстрая, чем в воде, количество фиксированного фермента высокое, и фермент более стабилен.

Комплекс носитель-фермент, полученный в гексане, относительно стабилен, несмотря на последовательные промывания, вредные для комплекса.

Эта стабильность еще более велика, когда комплекс применяют непрерывно.

2В

25 за

Так,50 г комплекса активный кирпич — трипсин, приготовленного, как указано выше. помещают в колонку, где поддерживают температуру

37 С. Через колонку непрерывно пропускают

З о-ныл раствор (по весу) казеина в фосфат-цитратном 0025 М буферном растворе с рН7 в течение

15 ч со скоростью 60 мл/ч. Все 24 ч проводят измерение активности указанным способом. Через 15 ч активность уменьшается только на 5 .. Это хорошо демонстрирует стабильность предложенных комплексов.

Пример 4. Фиксация рибонуклеазы на полибутадиене.

Полибутаднен активируют реакцией с хлористым ацетилом.

20 мг фермента суспендируют в 50 мл бенэола, прибавляют 2 г активного полибутадиена, пол> ченную суспензию нагревают до кипения и выдерживают нри этой температуре 1 ч. 3а фиксацией фермента следят при помощи ИК-спектроскопии. Полоса поглощения 1720 см карбонильной группы, которая присутствует в активном полибутадиене, исчезает в процессе фиксации, в то время как появляется полоса поглощения 1640 см, которую приписывают иминной функции. После разделения полученный комплекс носителы фермент промывают 20 мл карбонатного буферного раствора с рН

10,5 для удаления адсорбированного фермента. Затем измеряют активность фиксированного фермента по отношению к рибонуклеиновой кислоте (PHK). 20 мг полученного комплекса носительфермент суспендируют в смеси 1 мл 0,2 М трпс-буферного раствора с . рН 7,8, содержащего 0,02 М этиленднаминотетрауксусную кислоту, 1 мл воды и

1 мл водного раствора РНК такой концентрации, чтобы она составляла 3,3 мг PHK на 1 мл смеси.

Суспензню выдерживают 2 мин при 37 С, затем прибавляют 1 мл реактива Файдена и оставляют на

15 мин при 0 С и центрифутируют 5 мин со скоростью 6000 об/мин при 3 С, чтобы отделить избыток PHK. Оставшийся раствор разбавляют в отношении 1:30 и измеряют поглощение при 260 мм, сравнивая с носителем без фермента. Ферментативная активность соответствует 1,2 мг активного фермента на 1 r носителя.

Пример 5. Фиксация глюкоамилаэы на кремнеземе.

Кремнезем с поверхностью 15 м /г активируют путем. прнвивочной сополимеризации с силаном, имеющим эпоксидную функцию.

1 г активного носителя прибавляют в 50мл дисперсии хлороформа, содержащей 20 мг глюкоамилазы. Полученную суспензию нагревают с обратным холодильником 2 ч. После охлаждения полученный комплекс декантируют, сушат и промывают

3 раза по 20 мл дистиллированной водой и затем промывают в течение 24 ч 20 мл 2 М раствора хлористого натрия при 4 С. Для сравнения тот же опьп проводят в водной среде с 50 мл ацетатного

0,1 М буферного раствора с рН4,5, содержащего

578893

Таблица 1

47,0 47

27,5 24

47

69,0 50

Бензол

44,5 39

32

Вода

Таблица 2

1,0

0,1

3,2

0,3

Гексан

Вода

1,6

0,2

Таблица 3

4,8

0,6

2,6

0,3

Ге ксан

Вода

1,4

0,1

Таблица 4

0,564

0,120

Хлороформ

Вода

0,800

0,180

20 мг глюкоамилаэы и 1 г того же носителя. Раствор иеремеиивают при 4 С 66 ч. После декантации и промывания, как указано выше, измеряют активность. Полученные комплексы носитель-фермент вносят в 10 мл 3%ного по весу раствора крахмала в ацетатном 0,1 М буферном растворе с рН 45 и перемешивают 10 мин при 40 С. После отделения определяют количество восстановленного сахара в жидкой фазе колориметрическим методом, примеФормула изобретения

1. Способ получения яммобилизованных ферментов путем контактярования фермента с активированным носителем, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения стабильности фермента, связанного с носителем, apoqecc ведут в среде безводного апротонного растворителя при 30--120 С. няя 3,5 - динитросалициловую кислоту. Г1оследовательно проводят несколько промываний и измерений активности. В табл. 4 приведены результаты, выраженные в величине оптической плотности.

Как и в предыдуших опытах, время фиксации глюкоамилазы в хлороформе меньше, чем в воде, а полученные комплексы более активны и более стабильны, 2. Способ по п.1,отличаюшийся тем,что

55 в качестве фермента используют оксндоредуктазу, трансферазу, гидролазу, лиазу, изомеразу, лигазу.

3. Способ по и. 1, отличающийся тем, что в качестве носителя используют минеральное, органическое или органоминеральное вешество, не растворимое в органической среде и обладаюгцее реакционноспособными функциональными группами

578893

Составитель А. Бочаров

Редактор В. Мнрзаджанова Техред М, Келемсш

Koppexrup Л. Нсбола

Заказ 3833/708 Тирщк 553 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР до делам изобретений и открытий

1l3035, Москва, Ж-35, Раушская иаб., д, 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Уасгород, ул. Просктиая, 4 при помощи которых могут фиксироваться ферменты.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что носитель представляет собой кирпич, кремнезем, окись алюминия, глину, песок, агарозу, крахмал, полидекстран, целлюлозу, полимеры.

5. Способ по и.1, отлнчающи йся тем,что в качестве органической среды используют углеводоводы алифатическне, пнклоалифатические, ароматические.

6, Способ по и. l, îòëè÷aþùèéñÿ тем,что процесс ведут в течение времени от нескольких минут до 2 ч.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Zaborsky О. Immobilized Enzymes. "CRS.

Press Cleveland, Ohi o, 1973.