Способ проведения ферментативной реакции

 

О П И С А Н И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ, ьизво

Сеюв Сееетских

Сециалистических

Ресиублни (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 02.01.73 (21) 18?0481 28-13 (23) Приоритет (51) М. Кл.2 С 0?G 7/02

Государственный комитет

Севета Министров СССР ла делам изобретений н открытий (53) УДК 577.151(088.8) (43) Опубликовано 25,01.77. Бюллетень № 3 (45) Дата опубликования описания 19.04.78 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Чин Ки Ли, Маргарет Эстер Лонг и Чарльз Вилбур Нистром (Соединенные Штаты Америки) Иностранная фирма

«Р. Дж. Рейнольдс Тобакко Компани» (Соединенные Штаты Америки) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОИ РЕАКЦИИ

Изобретение относится к ферментации, а точнее к процессам превращения различных субстратов в присутствии энзимосодержащих веществ, предварительно обработанных флоккулирующими агентами.

Известен способ проведения ферментативной реакции путем контактирования субстрата с суспензией микробных клеток, обладающей ферментативной активностью.

Однако такой способ не обеспечивает возможности многократного использования суспензии микробных клеток.

С целью обеспечения возможности многократного использования суспензии микробных клеток по предложенному способу их перед контактированием агрегируют, обрабатывая флоккулирующими агентами — полиэлектролитами.

При этом перед агрсгацией в суспензию микробных клеток можно вводить дополнительно средство, облегчающее фильтрацию жидкости через слой агрегированных клеток, например целит 545.

В качестве флоккулирующих агентов применяют анионные или катионные полиэлектролиты.

При использовании в качестве субстрата глюкозы ферментативную реакцию осуществляют при рН 6 — 10 и температуре 50 — 90 С.

Кроме того, агрегированные клетки высушивают перед контактированием с субстратом.

5 Способ осуществляют следующим образом.

Ферментативную реакцию проводят путем контактирования субстратов с суспензией микробных клеток, обладающей ферментативной активностью.

В качестве микробны.; клеток используют штаммы Arthrobac ter 1чКК1 В3724, МЯКИН

В3725, МКК1 В3726, ИККИ В3727 и ХКК1

В3728, которые культивируют в стерильной среде, содержащей источники углеводородов и неорганических солей.

Микробные клетки перед контактированием агрегируют, обрабатывая их флоккулирующими агентами — полиэлектролитами, при этом применяют анионные илп катионные поли20 электролиты, такие как Прнмафлок С-7 и

Примафлок А-10, в виде 2%-ного раствора.

Флоккулирующие агенты вводят, обычно в количестве 0,05 — 2,50 вес, о о, например

0,25 вес. о о от веса всей жидкости пРи легком

25 перемешивании, при этом агрегация осуществляется в течение 10 — 15 мин.

Масса флоккулированных клеток осаждается на дно фермснтационного резервуара.

544380

Клетки отделяются путем декантации большей части прозрачной жидкости с последующей фильтрацией на вакуум-фильтре.

Для облегчения фильтрации жидкости через слой агрегированных клеток перед агрегацией в суспензию микробных клеток вводят дополнительное средство, например, целит

545 в количестве 0,5 /О (вес/объем).

Полученные агрегированные клетки перед контактированием с субстратом сушат при

55 С или замораживают при минус 5 С с последующей выдержкой их в замороженном состоянии в течение 8 час и оттаиванием.

Затем агрегированные клетки взмучивают в воде и измельчают, например с помощью смесителя Уоринга.

Затем взвесь заливают в колонку, частично заполненную водой, где клетки осаждаются.

Через колонку пропускают субстрат, например 50 /о-ный раствор глюкозы, при этом ферментативную реакцию осуществляют при рН

6 — 10 при температуре 50 — 90 С.

Скорость вывода раствора регулируют так, чтобы конверсия глюкозы во фруктозу составляла 40 — 50 /о.

Возможна последовательная установка двух колонок и извлечение насадочного материала из колонок для последующего применения в изомеризации глюкозы, при этом активность изомеразы сохраняется.

Возможно также использование в качестве микробных клеток вида Streptomyces, при этом наиболее пригодными являются Streptomyces albus, Streptomyces echinatur, Streptomyces achromogenes, Streptomyces olivaceus и другие.

Способ апробирован в лабораторных условиях.

Пример 1. Микробные клетки Arthrobacter NRRZ В-3788 вносят в стерилизованную питательную среду состава, /о. 2 декстрозы;

0,3 мясного белка; 0,1 дрожжевого экстракта, 0,6 (NH4) НР04, и 0>01 MgSO4 7Н О с р Н вЂ” 6,9.

Ферментацию проводят при 28 С в течение

60 час, после чего рН среды равно 5,5. Затем добавляют 2 (вес/объем) раствора Примафлок С-7 до получения конечной концентрации 0,25 /, (вес/объем). Предварительно рН полиэлектролитного раствора устанавливают

5,0 и ферментационную жидкость во время его добавления легко перемешивают. Перед введением полиэлектролитного раствора добавляют 0,5О/, (вес/объем) целита 545 (фирмы Джекс-Менвил, Балтимор) .

Перемешивают до образования стойких агрегатов клеток примерно, в течение 10 мин, после чего клеточным агрегатам дают возможность агломерироваться, а затем клеточный материал отделяют от прозрачной жидкости с помощью вакуум-фильтра.

Агрегированные клетки перед применением замораживают при минус 5 С или сушат при

55 С.

При испытании отделенной культуральной

65 жидкости обнаруживается полное извлечение изомеразы путем флоккуляции.

Пример 2. Проводят непрерывную конверсию глюкозы во фруктозу с применением флоккулированных клеток, полученных по примеру 1 и хранившихся несколько часов при минус 5 С.

Замороженные флоккулированные клетки погружают в воду или в глюкозный сироп, дают массе клеток оттаять и измельчают их перемешиваппем или другими механическими средствами до получения частиц одинаковой крупности. Затем эту взвесь вакуумируют

30 мин для удаления газов и вносят в колонку диаметром 23,5 мм, имеющую рубашку, частично наполненную водой или глюкозным сиропом.

Кол онку н а гр ев а ют до 60 С и п р опускают

2 М раствор глюкозы, содержащий 0,004 моля

MgC1 .бН О со скоростью, необходимой для получения заданной степени конверсии глюкозы, например, до 50 /о.

Пример 3. Получают сухие флоккулированные клетки и применяют их в колонке при непрерывном процессе изомеризации глюкозы

nо фруктозу, используя катионный и аниониый флоккулирующие агенты.

Пять частей свежей культуры Arthrobacter при рН 5,6 обрабатывают одной частью

1 /о -ного (вес/объем) раствора катионного

Примафлок С-7.

Ферментационную жидкость, содержащую флоккулянт, медленно перемешивают до образования больших клеточных агрегатов, после чего добавляют одну часть 1 -ного (вес/объем) анионного Примафлок А-10 (фирмы Ром и Хаас) и продолжают перемешивание до раздробления больших агрегатов в тонкие частицы. Затем флоккулированным клеткам дают возможность агломерироваться (см. пример 1), прозрачную жидкость отделяют, а клетки отделяют путем вакуум-фильтр ации.

Перед добавлением к ферментационной среде рН флоккулирующих растворов устанавливают едким натром, рН раствора катионного Примафлок С-7 устанавливают 5,0 и анионного Примафлок А-10 — 7,0, а конечный рН составляет 5,6.

Отфильтрованные клетки экструдируются через мундштук перед их сушкой в сушилке с принудительной циркуляцией в течение

24 час при 55 С.

Высушенные клетки гранулируют в барабане, просеивают до 20 — 40 мин и гранулят помещают в колонку.

Изомеризацию глюкозы проводят по примеру 2.

Пример 4. Aspergillus niger культивируют в питательной среде, состоящей из глюкозы, фруктозы, MgSO4 7Н О, КН РО4, NH4HPO4, мочевины и кукурузного настоя.

По окончании периода ферментации к среде добавляют 0,3 /о (вес/объем) полиэлектролита, перемешивают до агрегации клеток, 544380

Составитсль А. Бражникова

Текред P. Юсипова

Корректоры: Л. Орлова и Е. Хмелева

Редактор А. Бер

Изд. М 319 Тираж 550 Подписное

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 908/19

Типография, пр. Сапунова, 2 флоккулированные клетки отделяют и загружают в колонку с рубашкой.

Колонку нагревают до 40 С и пропускают

5 /о-ный раствор инвертного сахара, получая жидкую смесь, содержащую глюконовую кислоту и фруктозу.

Пример 5. Streptomyces olivaceus штамм

Мв NRRZ В-3583 культивируют в питательной среде, содержащей, /,: 0,7 ксилозы, 0,3 декстрозы, 0,5 мясного экстракта, О, 25 дрожжевого экстракта, 1,0 пептона, 0,5 NaCI, 0,05 NgSO4

° 7НаО и 0,024 СаС1 .6Н20.

Ферментацию проводят при 28 С 24 час.

К ферментационной жидкости добавляют

2% -ный (вес/объем) раствор катионного полиэлектролита в количестве, эквивалентном

0,05% (вес/объем) сухого флоккулянта, жидкость перемешивают до образования агрегированных клеток, после чего перемешивание прекращают и дают возможность последним осесть.

Агрегированные клетки отделяют по примеру 1, после чего их сушат 24 час при 60 С, механически измельчают и загружают в колонку, частично наполненную 1,0 М раствором глюкозы.

Колонку нагревают до 70 С и пропускают

1 М раствор глюкозы, содержащий О, 04 М раствор МдС12 6НаО для конверсии глюкозы во фруктозу.

Пример 6. Saccharomyces cerevisiae культивируют в питательной среде, содержащей мелассу. После ферментации добавляют раствор полиэлектролита при перемешивании, достаточном для образования агрегатов клеток.

Флоккулированную клеточную массу отделяют и помещают в колонку, которую поддерживают при 60 С.

Через колонку пропускают 0,5 М раствор сахарозы, которая превращается в инвертный сахар.

Пример 7. Aspergillus oryzae культивируют в среде, содержащей пшеничные отруби в смеси с углеводами, минеральными и буферными веществами.

Ферментацию проводят 48 час при 30 С и затем добавляют раствор подходящего полиэлектролита при перемешивании, достаточном для агрегирования клеток.

Флоккулирование клетки загружают в колонку, поддерживаемую при 50 С. Через колонку пропускают нейтральный 0,2 М раствор ацетил — ДЛ вЂ” метионина, содержащий 5;к, X1О " 1ЧСо+, получают Л вЂ” метионин.

15 Формула изобретения

1. Способ проведения ферментативной реакции путем контактирования субстрата с суспензией микробных клеток, обладающей ферментативной активностью, отл и ч а ю20 шийся тем, что, с целью обеспечения возможности многократного их использования, микробные клетки перед контактированием агрегируют, обрабатывая флоккулирующими агентами-полиэлектролитами.

25 2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что перед агрегацией в суспенцию микробных клеток вводят дополнительно средство, облегчающее фильтрацию жидкости через слой агрегированных клеток, например целит 545.

30 3. Способ по пп. 1 и 2, отл ичающийся тем, что в качестве флоккулирую1цих агентов применяют анионные или катионные полиэлектролиты.

4. Способ по пп. 1 — 3, отличающийся

35 тем, что при использовании в качестве субстрата глюкозы ферментативную реакцию осуществляют при рН 6 — 10 и температуре 50—

90 С.

5. Способ по пп. 1 — 4, отличающийся

40 тем, что агрегированные клетки высушивают перед контактпрованием с субстратом.