Способ контроля катализируемого аспартазой процесса полуения l-аспарагиновой кислоты

 

В.Э.Калнс, А.А.Хагеидорф, Г.А.Янкевиц, О,З.Скроделис, . ° ., Ф:а*

С.М.Малей и А.К.Арен

1. 1

t! (72) Авторы изобретения (7I) Заявитель (54) СПОСОБ КОНТРОЛЬ КАТАЛИЗИРУЕМОГО АСПАРТАЗОЙ

ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ (.-АСПАРАГИЙОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к новому способу контроля реакций получения аспарагиновой кислоты, в частности к способам контроля реакции получения L-аспарагиновой кислоты при катализе аспартазой.

Известен способ контроля процесса превращения фумаровой кислоты в L-аспарагиновую под действием аспартазы, согласно которому время

tO от времени берут образец контактирующей с аспартазой реакционной смеси, содержащей фумарат и ионы аммония, разбавляют.его водой и на спектрофотометре измеряют зависимую от

3$ концентрации фумарата степень поглощения ультрафиолетового света при

240 нм полученным раствором. С помощью предварительно составленного калибровочного графика определяют концентрацию фумарата и степень превращения его в аспарат. На основании ряда таких определений просле.живают ход процесса )I).

Однако известный способ обладает существенньяи недостатками, заключающимися в значительной затрате времени на осуществление контроля (около четверти часа только на одно определение) и в отсутствии возможности осуществления своевременного непрерывного контроля реакции, так как контроль ведется на основании анализа отбираемых вручную проб реакционной смеси.

Недостатком известного метода является и -то, что контроль дает инфориащао, относящуюся не к текущему, а к проведшему моменту времени, что также ограничивает возможности своевреиеияого оперативного регулирования хода щюцесса.

Цель изобретения -.интенсификация процесса, Указаипая цель достигается тем, что согласно способу контроля катализируемого аспартазой процесса получения L-аспарагиновой кислоты, 8571 l 5

Состав

Сопроти вление

Ом (при использовании ячейки констан той

K=5 9 см

УменьПоказа

Удельная электропроводность (%,„

Ом -см шеиие ф ь

Ом ° см ия

100 40,4

98 42,5

83 48,7

70 54,2

36 69,5

17 75,6

О 84,25

Q,I 7

0,139

0,121

0,109

0,085

0,078

0,070

0,008

0,026

0,038

0,062

0,069

0i077

1,0

0,9

0,66

0,50

0,20

0,10

Оь1

4 033

2 0,50

0,5 0,80

0,22 0,90

0 1,0

2

2 2

2 путем измерения превращения фумарата в аспархат измерение превращения фумарата в аспартат осуществляют

-по показаниям анализатора электропроводности.

Прослеживание реакции основывается на томь что электропроводность исходного содержащего ионы аммония раствора фумарата примерно вдвое превышает электропроводность раствора аспартата, получаемого при завершении реакции, и поэтому в" ходе реакции электропроводность уменьшается. Ири этом в течение процесса удельная электропроводность линейно зависит от концентрации фумарата, используемого и реакции. Процесс ведется беэ отбора проб, а результаты, не затрачивал времени на анализ, считывают со шкалы анализатора электропроводности. При этом получают непрерывные зависящие от глубины реакции показания, что обеспечивает непрерывный автоматический контроль кода реакции, причем результат анализа всегда относится к данному моменту времени. Поэтому на основе результатов анализа возможно своевременное оперативное регулирование хода процесса. Кажцое соответствующее данной злектропроводности показание обеспечивается электрическим сигналом определенной силы, которая зависит от концентрации фумарата в реакционной смеси. Поэтому, с одной стороны, показания анализатора электропроводкости можно записывать регистрирующим прибором 1,самописцем) и таким образом регистрировать глубину реакции ыа каждый момент прошедшего времени, записывая весь ход процесса.

С другой стороны, непрерывно получаемый электрический сигнал, сила которого зависит от глубины реакции, непосредственно может быть использован для автоматизации регулирования хода процесса.

1О

Пример 1. Готовят 20 л I М раствора фумаровой кислоты, доведенного до рН 8,4 при 18 С водным аммиаком и содержащего 0,003 M двухлористого, марганца, и 50 мл 1 М раствора L — аспарагиновой кислоты, доведенного до рН 8,4 при 18 С водным аммиаком и содержащего 0,003 M двухлористого марганца. Снимают показания анализатора электропроводности с фиксированной чувствительностью при последовательном термостатировании при 37 С детектора прибора в растворе фумарата, растворе аспартата и их смесях, имитирующих различные стадии превращения фумарата в аспартат. Кроме того, имеют сопротивление и рассчитывают удельную злектропроводность этих растворов. В табл. I приведены показания и результаты, полузо ченные при использовании по прописи фирмы в качестве анализатора электропроводности прибора "Conductolyzer"

Шведской фирмы LKB установленного так, что в случае I М фумарата получают показание 100, а в случае 1 М аспартата — 0 (детектор — ячейка с константой К 5,9 см ).

Т а б л и а 1

8571

ЗО

Формула изобретения

Составитель И.Андрианова

Редактор Н.Лазаренко Техред А. Ач

Корректор Г.Назарова

Подписное

Заказ 7134 36 Тираж 443

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий!

13035, Москва, Ж-35, Рнушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пользуясь выявленной в таблице зависимостью показаний анализатора электропроводности от степени превращения фумарата в аспартат, дополнительно размечают шкалу прибора в единицах концентрации аспарагиновой кислоты.

К 20 л l М фумарата аммония при

37 С добавляют при размешивании 40 мл экстракта Е. coli К-12 со средней !о аспартазной активностью 223 мкмоль

L — аспарагиновой кислоты в минуту на 1 мл. В размешиваемый и термостатируемый при 37 С раствор l М фумарата аммония погружают ячейку 15 кондуктолайзера с константой 5,9 см и ход реакции превращения 1 М фумарата аммония в аспартат прослеживают по размеченной шкале. Результаты, полученные при прослеживании 20 .реакции, приведены в табл. 2.

Концентрация аспарагиновой кислоты, М0,,07 О,,27 О,,30 1

После 5, 6 ч от начала реакции хроматографическим методом в реакционной

35 смеси определяют 0,99 M концентрацию аспарагиновой кислоты. При продолжающемся размешивании реакционную смесь подкисляют до рН 4,8 с помощью концентрированной серной кислоты, добавляют к ней 20 г активированного угля марки КАД, нагревают до 80оС и отфильтровывают через три слоя фильтровальной бумаги. Слой угля на фильтре промывают деминералиэованной водой, фильтрат с присоединенной промывной водой (около 30 л) подкисляют концентрированной серной кислотой до рН 2,66 и получившуюся при этом суспензию

l5 4 аспарагиновой кислоты 16 ч размешивают и охлаждают спиралью с текущей водопроводной водой.

Полувоенную аспарагиновую кислоту отфильтровывают через слой бельтинга, промывают на фильтре охлажденной до 10 С деминералиэованной водой до отсутствия сульфат- ионов и затем

4 л спирта. После высушивания при

60-70 С получают 2,!95 кг (827. выхода) L — ..парагиновой кислоты.

fd. 12о+24 7о (c=l; 5 и НС!) ь

Пример 2. 6 мл ферментного раствора (полученного смешиванием

0,95 мл экстракта Е. coli К-12 с

39 мл воды и 0,015 г бычьевого альбумина), налитого с вытеснением воздуха в закрытый с обоих сторон сплющенный целлофановый рукав 6 4 5 см, выдерживают при 37 6 с 35 мл 1 М фумарата аммония. Для прослеживания реакции берут пробы реакционной смеси, и каждый раз термостатируя пробу с детектором кондуктолайзера (ячейкой c константой 5,9 см ) прц 37 С, со

- о ткалы прибора считывают концентрацию аспаргиновой кислоты, определяют, что через 1 сут достигнута 0,86 М, а через 5 сут 0,97 М концентрация аспарагиновой кислоты (хроматографически через,5 сут определена 0,95 М концентрация аспарагиновой кислоты).

Способ контроля катализируемого аспартаэой процесса получения L — аспарагиновой кислоты, включающий измерение превращения фумарата в аспартат, о т .л и ч а ю шийся тем, что, с целью интенсификации процесса, измерение превращения фумарата в аспартат осуществляют по показаниям анализатора электропроводности.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

l. Biochore. Biophys. Acta, 1977, 483 (1), 193-202 (прототип).