Способ получения ингибитора фосфолипазы с

 

Союэ Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

< >908798 (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) 3aяa e o 05.12.79 (21) 2877340/28--13 (5I )M. Кл.

С 12 P 1/06//

С 12 Р l/06

С 12 R l/465 с присоединением заявки М

1Ъеударстинныб квмнтет (23) Приоритет ав аннам нмбратеннй н открьгтнй

Онубликовамо 28.02.82. Бюллетень _#_e 8 (53 ) УД К 615.779..94 (088.8) Дата опубликования описания 28.02.82 (72) Авторы изобретения

T. И. Рожанская, Е. В. Аверьянова, T. В. Андреева, В. Н. Жерлицына, А. А. Селезнева, Е. П. Яковлева, М.

Л. Г. Мясникова, Ж. Д. Мазунина, Л. И. Фатеева н И. оляк, Тбрейий-:г

Всесоюзным научно — нсслсловательскнй телнологический игу ".ю ;::::з— антибиотиков н ферыентов ыелноннского назначении (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ФОСФОЛИПАЗЫ Г

Изобретение относится к медицине, а именйо к способам получения ингибиторов ферментов.

Известен способ получения ннгибитора фосфолнпазы С из нативного раствора процуцента путем депигментацин на анноните ФАФ с последующим прогреванием при 50 — 55 С, отделением образовавшегося осадка и очисткой супернатанта 11).

Однако известный способ технологически сложен и ие поддается масштабированию. о

11ель изобретения — упрощение способа, Поставленная цель достигается тем, что прн осуществлении способа получения ннгибитора фосфолнпазы С иэ нативного раствора продуцента путем депигментации на анионите ФАФ с последующим прогреванием при 50 — 55ОС, отделением образовавшегося осадка и очисткой супернатанта и лифнлизацией целевого продукта, депигмснтированный раствор перед прогреванием подщелачнвают до рН 9,2 — 9,7, последовательно обрабатывают растворами натриевой соли карбоксимстнлцеллюлозы в концентрации

0,06- 0,07% и алюмокалиевых квасцов до усгановлення рН 4,5 — 4,9 и затем прогревают в течение 4,5 — 5 мин.

Прн этом очистку супернатанга проводят с помощью днализа против 0,001 М фосфатного буфера при рН 5,2 — 5,7 или соч .-анием диализа, ультра- н днафильтрации 0,001 М фосфатным буфером чере мембрану УАМ вЂ” 100 М.

При этом в качестве продуцента используют штамм streptomyces saraceticus var..cerasus.

Способ осуществляют следующим образом, Нативный раствор депигментируют, сорбнруя пигменты на анионите ФАФ в хлоридной форме с коэффи;;иентом набухання 3,8. Затем депигментированный нативный раствор попшелачивают до рН вЂ” 9,2 — 9,7, обрабатывают при перемешнванни натриевой солью карбокснметилцеллюлозы Na КМЦ (нз расчета 60 — 70 мг на

100 мл раствора), затем добавляют при перемешивании раствор алюмо-калиевых кварцов до рН вЂ” 4,5 — 4,9 и прогревают 5 мин при

50 С, после чего супернатант отделяют центрифугированием и оппцают от ннзкомолекулярных примесей диалнзом против 0,001 М фосфатного буфера прн рН вЂ” 5,2 — 5,7 или сочетаСоставитель Ю. Алмазов

Техред О.Легеза

Корректор Г. Огар

Редактор Е, Дианская

Заказ 749/27

Тираж 505

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытии

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб. д. 4/5

Подписное

Филиал НПП "Натент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 90879 нием диалиэа и ультра-и диафильтраций через ацетилцеллюлоэную мембрану УАМ вЂ” 100 М с диаметром пор 100 — 120 А прн давлении

2,5 а1 м, десятикратном концентрировании при использовании фосфатного буфера (О,OOI М рН 5,4) и диализованный супернатант илн концентрат лиофильно высушивают известными способами, Полученные препараты ингибитора не токсичны. Внутрибрюшинное введение препарата в дозах 50 — 100 мг/мышь (6,5 — 11 мг/мышь по белку) гибели белых мышей весом 18—

20 г не вызывало.

Пример 1. 500 мл нативного раствора пропускают через колонку, загруженную 15,0 г анионита ФАФ в хлоридной форме с коэффициентом набухания 3,8. Депигментированный нативный раствор подщелачивают до рН вЂ” 9,5, добавляют 6 мл S o-ного раствора Na KMU (общая концентрация Na КМЦ в обрабатываемом нативном растворе 0,06%). Через 5 мин перемешивания добавляют 6 -ный расвтор алюмо- калиевых квасцов до pH .— 4,8. Вновь перемешивают 5 мин, а затем помещают на

5 мин в водяную баню при 50 С, Суспернатант отделяют центрифугированием, з затем диализуют в течение 1 сут цротив 0,001 М фосфатного буфера (рН вЂ” 5,4) . Диализованный супернатант лиофилъно высушивают. Иэ 500 мл нативного раствора получают 200 мг очищенно30 го препарата ингибитора фосфолипазы С, не содержащего балластных белков и характеризующегося 40 — 50 o-ной ингибицией при концентрации 20 мг препарата/мл.

Пример 2. 500 мл нативного раствора обрабатывают TBK же, как в. примере 1, затем частично диализованный в течение 15 ч супернатант концентрируют и обессоливают ультраи диафильтрацией ацетилцеллюлоэную мембрану

УАМ-150 М с радиусом пор 100 — 120 Х. Из

500 мл нативного раствора при проведении одной диафильтрации с десятикратным разбав8 4 лением получают «О мг препарата, харакгериэуюшегося 60-40 ной ингибицией при концентрации I0 мг препарата/мл и 30--40 -ной ингибицией при концентрации 5 мг препарата, ми

Предлагаемый способ позволяет получить но вый нетоксичный и стабильный ингибитор фосфолипаэы С при сокращении числа технологических стадий и дешевизне используемого сырья.

Формула изобретения

1, Способ получения ингнбитора фосфолипазы С из нативного раствора продуцента путем депнгментации на анионите ФАФ с последующим прогреванием при 50 — 55 С, отделением образовавшегося осадка и очисткой супернатанта, от лича ю щ ийс я тем, что, с целью упрощения способа, депигментироваиный раствор перед прогреванием подщелачивают до РН 9,2 — 9,7, последовательно обрабатывают растворами натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы в концентрации 0,060,07% и алюмокалиевых квасцоа до установления рН 4,5 — 4,9 и затем прогревают в течение 4,5 — 5 мин.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что очистку супернатанта проводят с помощью диализа против 0,001 М фосфатного буфера при рН 5,2 — 5,7 или сочетанием диализа, ультра- и диафильтрации 0,001 М фосфатным буфером через мембрану УАМ вЂ” 100 М.

3. Способ по п, 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве продуцента используют штамм Streptomyces saraceticus var. ce—

res us.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР К 734260, кл. С 12 D 13/00, !978,