Способ определения поверхностных белков легочной ткани

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ в>941882 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 07.08. 80(2 ) 2988589/28-13

f53) M. Кп.э с присоединением заявки Мо

G 01 К 1/28

A 61 В 10/00.

Государственный комитет

С С С P но делам изобретений и открытий. (23) Приоритет

Опубликовано 070782, Бюллетень Мо25 (53) УДК 615.475 (088.8}

Дата опубликования описания 07.07.82 (72) Авторы изобретения

В.В.Ерохин, В.Б.Иванов, Л.Н.Филиппенко и В.Н.Филиппенко

Я

Центральный научно-исследовательский институт ! туберкулеза (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ

БЕЛКОВ ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ

Изобретение относится к медицине, а именно патоморфологйи.

Известен способ определения поверхностных белков легочной ткани путем ее фиксации перфузией в легочные сосуды с последующим окрашинием и электронно-микроскопическим изучением (1) .

Однако известный способ имеет низкую точность из-за наличия трудоемких и длительных по времени иммуногистохимических операций, связанных с необходимостью получения специфических антител на поверхностные .белки легочной ткани и их последующей обработки для выявления под трансмиссионным электронным микроскопом.

Цель .изобретения — повышение точности способа.

Эта цель достигается тем, что при осуществлении способа определения поверхностных белков легочной ткани путем ее фиксации перфуэией в легочные сосуды с последующим окрашиванием и электронно-микроскопическим изучением, фиксацию и окрашивание проводят в среде. следующего состава:

0,2-0,3%-ный проционовый ярко-голубой Н56Б; 3,6Ъ-ный глутаровый альдегид, 0,2 М какодилатный буфер рН.

5,6-6,0, взятых в соотношении l lãl, при этом перфузию проводят в течение

10-15 мин под давлением 25-30 см вод, ст., далее легочную ткань выдерживают в том же составе в течение 1,5 2,0 ч и затем в насыщенном растворе тиосемикарбазида в в течение 2030 мин.

Способ осуществляют следующим образом.

Легкие в течение 10-15 мин под давлением 25-30 см вод. ст. перфузируют in situ через легочную артерию фиксирующе-красящей смесью, содержащей равные объемы 0,2-0,3%-ного водного раствора проционового ярко-голубого H5GS, 3,6%-ного глутарО- ° ваго альдегида и 0,2 М какодилатного буфера рН 5,6-6,0. Далее легкое выделяют из грудной полости и помещают в тот же состав еще на 1,52,0 ч. Затем легочную ткань режут на 1-2 см кусочки, выдерживают

20-30 мин в насыщенном водном растворе тиосемикарбаэида, дофиксируют

30 мин 1й 0504 и подготавливают для электронно-микроскопического исследования обычным способом.

Пример 1 ° Легкие трех морс,ких свинок поочередно отмывают от

941882 крови путем пропускания физиологического раствора через легочную артерию в течение 2-3 мин под давлением 30 см вод.ст. Затем доступ. Физиологического раствора прекращают и в течение 3 (1-я морская свинка), 10 (2-я) или 30 мин (3-я) через легочную артерию в том же режиме пропускают Фиксирующе-красящую смесь, содержащую равные:объемы 3,6%-ного глутаральдегИда, 0,2 М какодилатного бу"10 фера рН 5,6-6,0 и О,ЗЪ-ного водного раствора проционового ярко-голубого H5GS. Далее материал обраба-1 тывают по схеме, приведенной в описании способа. 15

При электронно-микроскопическом изучении материала установлено, что трехминутная перфуэия легкого фиксирующе-красящей смесью является недостаточной, так как продукт реак- 20 ции на поверхности альвеолярного эпителия выявлялся нерегулярно, в отдельных йебольших участках срезов ткани. Этот недостаток устранен 1 при 10- или 30-минутной перфузии 25 легкого фиксирующе-красящей смесью, Причем между этими сроками перфузии не выявлено существенных раз, личий по степени выраженности и равномерности распределения про- 30 дукта реакции.

Поскольку при 30-минутной перфузии расходуется большее количество реактивов, что экономически менее выгодно, в качестве наиболее оптимального выбран время перфузии

10-20 мин.

Пример 2. Легкие морской свинки отмывают от крови путем пропускания физиологического раствора че- 40 рез легочную артерию в течение

2-3 мин под давлением 30 см вод.ст.

Затем доступ физиологического раствора прекращают и в течение 10 мин через легочную артерию в том же режиме пропускают Фиксирующе-красящую 45 смесь, содержащую равные объемы

3,6% глутаральдегида, 0.,2 М какодилатного буфера рН 5,6-6,0 и 0,3% водного раствора проционового яркоголубого 85GS.. Затем вырезают 50 несколько 5-6 си сегментов легочной ткани и помещают их s свежие порции фиксирукице-красящей смеси на

30 мин, 1 или 2,5 Ч. Далее весь Ма= териал обрабатывают по схеме, при- 55 веденной в описании способа.

При электронно-микроскопическом изучении материала установлено, что

30 мин не достаточно для полного проникновения фиксирующе»красящей 60 смеси вглубь 5-6 смэ кусочков ткани, так как продукт реакции отчетливо выявляется только на первых .ее срезах. При обработке 5-6 смЭ

Кусочков фиксирукице-красящей 65 смесью в течение 2,5 ч во многих клетках альваолярного эпителия обнаружено набухание митохондрий, что рассматривалось нами как артефакт фиксации, обусловленный длительным пребыванием материала в фиксаторе при комнатной температуре, необходимой для более быстрого проведения гистохимической реакции. При обработке 5-6 см кусочков в течение

1 ч фиксирующе-красящая смесь более равномерно проникает в толщу кусочков и не вызывает сильного набухания митохондрий в клетках. Поэтому

1-1,5-часовая обработка фиксирующекрасящей смесью кусочков данного размера выбрана как оптимальная.

П .р и м е р 3. Легкие морской свинки отмывают от крови путем про" пускания. Физиологического раствора через легочную артерию в течение

2-3 мин под давлением 30 см вод.ст.

Затем доступ физиологического раствора прекращают и B течение 10 MHH через легочную артерию в том же режиме пропускают фиксирующе-красящую смесь, содержащую равные объемы

3,6Ъ-ного глутаральдегида, 0,2 М какодилатного буфера рН 5,6-6,0 и

0,3%-ного водного раствора проционового ярко-голубого H5GS. Вырезают.

5-6 см сегментов легочной ткани и помещают в эту же смесь сначала на

1 ч, а-после дополнительного измельчения кусочков до 1-2 см еще

3 на.ЗО мин. Материал 10 мин промывают 0,1 М какодилатным буфером рН .

7,3-7,4 и разделяют на три части (по 3-4 кусочка в каждой) . Одну часть кусочков обрабатывают насыщенным водным раствором тиосемикарбазида 10 мин, другую — 30 мин, третью - 60 мин.

Дальнейшую подготовку материала для электронной микроскопии проводят по общей схеме, приведенной в описании способа. При электронно-микроскопи.ческом изучении материала установлено, что 10-минутная обработка кусочков тиосемикарбазидом не достаточна„ так как продукт реакции íà срезах выявляется главным образом в: виде следов. Необходимо увеличить время промывания материала в -какоднлатном буфере до 1 1,5 ч (3-4 смены по 20-25 мин). В противном случае, при погружении кусочков в Os, последний выпадает s осадок. Длительное.промывание материала после 60минутной обработки тиосемикарбаэидом не только увеличивает общую продолжительность предлагаемого способа выявления белков легочного сурфактанта под трансмиссионным электронным микроскопом, но и приводит к дополнительному расходу какодилата Na для буфера, что нежелательно. Поэтому время обработки кусочков тиосемикарбазидом

941882 сокращено до 20-30-мин. Оно достаточно для проведения гистохимической реакции хорошего качества и требует не более 15 мин для промывания материала в буфере.

Пример 4. В эксперименте использовано четыре крысы.

Под гекссаналовым наркозом вскрывают грудную клетку животного. Легкие отмывают от кровки путем перфузии физиологического раствора через легоч- 10 ную артерию в течение 2-3 мин. Затем доступ физиологического раствора прекращают и в течение 10-15 мин через легочную артерию пропускают одну из двух фиксирующе-красящих (5 смесей. Фиксирующе-красящая смесь

9 1 содержит равные объемы 3,6Ъ-ного глутаральдегида, 0,2 M какодилатного буфера рН 5,6-6,0 и 0,2-0,3%-ного водного раствора нроционового ярко- Z0 голубого H5GS (проперфузированы

2 крысы). Фиксирующе-красящая смесь

9 2 в качестве красителя содержит

0,33-ный водный раствор проционового ярко-голубого RS (проперфузированы 2 крысы). Вся дальнейшая обработка материала подводится в соответствии с предлагаемым способом.

При просмотре материала под трансмиссионным электронным микроскопом у крыс, легкие которых обрабатывают фиксирующе-красящей смесью 9 1, в составе сурфактантного альвеолярного комплекса выявлен мелкогранулярный продукт реакции, обладающий высокой электронно-оптической плотностью. В том случае, если легкие обрабатывают фиксирующе-красящей смесью 9 2, продукт реакции под трансмиссионным электронным микроскопом не выявляется. 40

Пример 5.укрысиморских свинок с экспериментально вызванньм альвеолярным липопротеинозом вскрывают грудную клетку. Через надрез в предсердии в легочную артерию вводят иглу с наболдашником и в течение 2-3 мин через малый круг кровообращения под давлением 25-30 см вод,ст. пропускают физиологический раствор. После того как легкие отмы- 50 ты от крови, доступ физиологического раствора прекращают и в течение 1015 мин через легочную артерию пропускают фиксирующе-красящую смесь, содержащую равные объемы 3,6% глутаро- 55 вого альдегида, 0,2 М какодилатного буфера рН 5,6-6,0 и 0,2-0,3Ъ водного раствора проционового ярко-голубого, Вырезают 5-,.6 см сегменты легочной ткани и помещают их в фиксирующе- 60 .красящую смесь сначала на 1 ч, а ,после дополнительного измельчения кусочков до 1-2 см, еще на 30 мин

Ъ при комнатной температуре. Материал, 10 мин промывают 0,1 М какодилатным 65 буфером рН 7,3-7,4, помещают на

30 мин в насыщенный водный раствор тиосемикарбазида, затем вновь 15 мин промывают этим же буфером и в течение 30 мин дофиксируют 1%-ным OSO на 0,1 М какодилатном буфере рН 7,37,4 при комнатной температуре. Кусочки легочной ткани в течение 1 ч обезвоживают в ацетонах восходящей концентрации, -окиси пропилена и после 1,5 ч пропитки в смеси окись пропилена+эпон-аралдит (1:1) при

37 С заключают в эпон-аралдит изо вестным способом. В течение 24 ч материал находится в термостате на 60 С для полимеризации эпоксидной смолы. Затем получают ультратонкие срезы толщиной 50-60 нм, которые просматривают в трансмиссионном электронном микроскопе без дополнительного контрастирования.

Предложенный способ позволяет определить на поверхности альвеолярного эпителия продукт гистохимической реакции проционового ярко-голубого Н5СБ в виде мелкогрануляр-i,":. ного материала, обладающего высокой электронно-оптической плотностью.. Появление крупных скоплений продукта реакции в просветах альвеол свидетельствует о развитйи альвеолярного липопротеиноза, а частота их встречаемости в легком позволяет оценить степень выраженности заболевания у животного. По сравнению с известным, предлагаемый способ является более простым и позволяет сократить время, необходимое для определения поверхностных белков легочной ткани под трансмиссионным электронным микроскопом с 3 месяцев до 2-3 . сут. упрощение и повышение точности способа обеспечивает хорошую воспроизводимость результатов в эксперименте, приводит к уменьшению экономических затрат на исследование и может применяться в клинике для диагностических целей.

Формула изобретения

Способ определения поверхностных белков легочной ткани путем ее фиксации перфузией в легочные сосуды с последующим окрашиванием и электронно-микроскопическим изучением, отличающийся тем, что, с целью повышения точности сйособа, фиксацию и окрашивание проводят в среде следующего состава: 0,2-0,3%ный проционовый ярко-голубой. H5GS

3,64-ный глутаровый альдегид, 0,2 М какодилатный буфер рН 5,6-6,0, вз ятых в соотношении 1:1:1, при этом перфузию проводят в течение

10-15 мин под давлением 25.-30 см вод

941882

Составитель Ю.ллмаэов

Редактор Н.Пуыненкова ТехредЖ. Хастелевич . .Корректор в Вутяга

В 4 hiO °

Эакаэ 4827/32 Тираж 887 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

IIo делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35„ Рауыская наб,, д. 4/5 филиал ппП патент, r. Ужгород, ул. проектная. 4 ст., далее легочную ткань выдержи-. вают s том же составе в течение 1,5"

2,0 ч и затем в насыщенном растворе тиосемикарбаэида в течение 20-30 мин °

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе. 5

1. Sueiski K., Tanaka Т,, Oda T., Immunouftrastruetural study of surfactant system, destribution of

specific protein of surface active

material in rabbit-fund. Labor.

Inyestiä, 1977, Ч 37, р. 130