Способ получения дрожжей в капсулированной форме

 

(72). Авторы изобретения

А. P. Манукян и В, И. Голубев

Институт биохимик и физиологии микроорганиз

13 .,;",: в АН,(gCg„ (7l ) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДРОЖЖЕЙ В КАПСУЛИРОВАННОЙ

ФОРМЕ

0,001

2,0

5,0

2,0

0,2

002

004

КН 1ро4

WgC1 6НтО сас12 2Н20

FeC1g 4Нт О

Изобретение относится к микробиологий; в частности к способам получения капсул у дрожжей, Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту . является способ (1) получения дрожжей в капсулированной фбрме, предусматривающий выращивание их в жидкой или на плотной питательной среде, содержащей источник углерода, источник азота, ьап еральные соли и витамины с последующей инкубацией, согласно которому.. дрожжи Cryptococcus neoformans культивируют при рН 7 на среде Литтмана следующего состава г/л дистиллированной воды:

Тиамин

Глютамат йа

Мальтоза

Сахароза (КН4)180411

МпС1з 4Н О 0 0015 йаМоо„ . 2Н 0 0,0015

Недостатком известного способа. является то, что он применим только к одному виду, дрожжей и не может быть распространен на друтие капсулообразующие дрожжи.

Цель изобретения — стимулирование капсулообразования.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения дрожжей в капсулированной форме, предусматривающему выращивание их в жидкой или, на плотной литательной среде, содержащей источник углерода, источник азота, минеральные соли и витамины с последующей инкубацией, в качестве источника углерода и азота используют маянозу и пелтон в количествах 20 — 40 и 1 — 4 г/л, при этом выращивание ведут при рН 5 — 6, а инкубнрованне проводят при 15 — 25 С.

Прн этом, выращивание дрожжей проводят на гипсовых блоках, помещенных в жидкую питательную среду.

Способ осуществляют следующим образом.

3 94517

Дрожжи культивируют при рН 5 — 6 на среде следующего состава, г/л дистиллированной воды

Манноза 20,0 — 40,0

Пелтон ° 1,0-4,0

КНЯ Р04 1,0-4,0

gSO4 0,005--0,03

Дрожжевом экстракт 0,5-2,0

Среду стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм 15 — 20 мин. Среда может быть использована в жидком виде, агаризованная (2% агар-агара) с накладыванием на поверхность стерильного целлофана, а также дпявы ащивания на гипсовых блоках. В качестве инокулята используют 2-3 суточные культуры дрожжей, выращенные на сусле-arape.

t5

Культивирование ведут при температуре на о

5 — 10 С ниже, чем оптимальная для роста иссле дуемых дрожжей, т. е..в большинстве случаев в диапазоне 15 — 25 С.

Максимальных размеров капсульr при росте 2о дрожжей в жидкой среде в периодической культуре достигают в фазе замедления роста— начале стационарной фазы, при росте на плотных средах — у 3 — б суточных культур.

Для выявления капсул используют препараты25 живых клеток в туши, приготовленной по

Литтману и светлбпольную микроскопию.

Пример 1. Готовят среду следующего состава, г/л дистиллированной воды.

Манноза 30,0 3п

Пелтон 3,0

КН Р04 2,0

MOSQUE 0,01

Дрожжевой экстракт М 35

Asap-GFap 20,0 Стерилнзуют при 0,5 атм 15-20 мин рН устанавливают 6,0. Расплавленную среду разливают по чашкам Петри или в пробирки и заквашивают . Засевают суспензией клеток дрожжей ао на 3 суточных культур дрожжей, выращенных на сусло-arape. Инкубируют при 20 С.

Средние размеры капсул у клеток дрохокей, выращенных на предлагаемой среде и, для сравнения, иа среде Литтмана, приведены в 45 табл. 1. (М вЂ” средняя арифметическая из 200—

300 измерений; о, — доверительные границы при P — 0,95) .

Из табл. 1 видно, что во всех случаях у . капсулообразующих организмов, в том числе и 5о у Cr. neoformans на предлагаемой среде кап2 4 супы образуются больших размеров, чем на среде

Литтмана, а у ряда культур образование капсул имеет место только на предлагаемой среде.

При этом следует учесть, что при выращивании на среде Литтмана используют пониженную темпе ратуру инкубации, поскольку при рекомендуемой

Литтманом температуре. (37 ) подавляющее большинство капсулообразующих дрожжей вообще не. растет.

Пример 2. Используют жидкую среду, состав которой приведен в примере 1. Ее разливают в стерильные чашки Петри, с установленными в них гипсовыми блоками, слоем около 5 мм. Гипсовые блоки готовят смешивая Х ч. гипса с 3 ч. воды.

Из полученной пасты изготовляют блоки цилиндрической формы или в виде усеченного конуса высотой 1 см. После затвердения блоки помещают в чашки Петри и стерилизуют сухим жаром 2ч при 110 — 1Ю С. На верхнюю поверхность блоков наносят суспензию клеток дрожжей иэ 2 — 3 суточных культур, выращенных на сусле-агаре. Инкубируют в течение недели при 20 С. В табл.Ъ представлены данные о численности капсулированных клеток и толпище у них капсул у штаммов. дрожжей, у которых не удается добиться капсулообразования при использовании других способов выращивания. В . отличие от. хорошо образующих капсулу культур дрожжей, у которых все клетки капсулированы, штаммы, указанные в табл. 2, имеют невысокое содержание капсузкированных клеток.

Независимо от типа уплотиителя больших размеров капсулы -у дрожжей формируются на плотной среде, чем при росте в жидкой то же состава. При этом обнаружено, что максимальной толщины капсулы образуются при использовании метода выращивания дрожжей иа гипсовых блоках. Этот метод рекомендуется прн работе со штаммами, характеризующимися очень слабой способностью к капсулообразоваиию. С помощью его удалось добиться образования капсул у некоторых штаммов, не образующих их при росте в жидкой среде или на агаризованной среде.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа по сравнению с известным заключается в том, что он пригоден для выращивания всех кансулообразующих дрожжей и позволяет получить культуры в более капсулированной

1 форме, чем при использовании способа Лиггмана

Таблица 1

945172

0,0

4,2+0,3

: 3,3+0,1, l,1+0,1

2,5 0,1

0,0

0,0

1,69),1

5,1Я1,2

4.64;0.2

2,9+0,2

3,6+0,2

3,6+О 2

0,0

0,0, 0,0

0,7+0,1

0,0

0,0

0,0

2,5+0,1

0 9$0,1

0,0

2,7Ц),2

З,Щ0,1

ОЩ3,1

1„Щ),1

1,7Щ1

3,6),0,1

45Я1,2

4,0 0,2

6,7й0,1

4,8фЭ,2

ЗЩ),2

1„Щ),l

4,0Ц),2

2,2 0,1

О,Щ),1

2,0+0,1

0 &0,1

2,8Ю,2.

l &k0,1

3,2Ю,1

0,0

Виды и разновидности штаммов

Bu11era a1ba ВКМ Y — 676

В tsugae ВКМ вЂ” — 1280»

Candida me1ibiosophi1a (Сг. me1ibiosum) а CBS 2102

Cryptococcus a1bidus var.

aerius (=Сг. terricolus) CBS 4517

Cr.a1bidus var. aIbidus ИГУ 525

Cr.àIbidus МГУ 1555

Cr.a1bidus var. a1bidus ИГУ 2030

Cr. a1bidus var. diff1uens МГУ 176

Cr. a1bidus var. 6Ж1мепа ВКМ Y — 1592"

Cr.a1bidus чаг. 0Ж1пепа (Cr.bhutanensis)

CCY 17 — 15 — 1

Сг. e1inovii CBS 7051»

Cr. Лавв АТСС 10656»

Сг. gastricus CBS 1927

Сг. himalayensis ССУ 17.— 14 — 1

Cr. kuetzingi i CCY 17 — 11 — 1

Cr. 1aurentii МГУ 1805

Cr. laurentii var. f1avescens BKM У -1595» Сг. magnus var. magnus МГУ 637

Сг. magnus чаг.ater BKM У вЂ” 1534"

Сг. neoformans (=Т.neoformans var.sheppei)

ГИДУВ 350/753.

Cr. neoformans серотип А ГИДУВ 228/151

СгЛеггеоа CBS 1895

Fi1ibasidium capsu1igenum тип спариванияс(BKM Y — 1439"

F. f1oriforme диплоид

CBS 6240

F. ftoriforme тип спаривания А

CBS 6241

Средняя толщина капсул, мкм

Предлагаемая среда Среда Липмана

Mf Ь МЙА

3,2+0,2

2,8 0,1

2,2+0,2

3,2 0,2

2,4Ц),1

945172 8

Продолжение табл. 1

Средняя толщина капсул, мкм

Виды и разновидности штаммов

Предлагаемая среда

М д

Среда Литтмаиа

М».

F.Èoriforme тип спаривания a(.

C83 6242

° 3 (H0,1

F, uniguttu1atum тип спаривания 1730 а С88 !1730

0,0

0,0

0,0

Hansenu1a capsulate ИБФМ У вЂ” 783

Lipomyces 1ipofer МГУ 133

1,7+0,1

0,7+0,1

0,0

0,0

1,9т0,1

0,9+0,1

0,0

2,0Ц),1

" Типовые штаммы видов, Таблица 2

Толщина капсул, мкм, М+ g

Относительное

Виды и разновидности щтаммов содержание капсулированных клетоку %

Cr. a1bidus var. бИт1оепа (Cr. bhutanensis ) CCY 17 — 15 — 1

0,9+0,1

Сг f1avus ATCC 10656"

0,9+0,1

0,1

F. uniguttu1atum С88 173У

2,2+0,5

Формула изобретения и пелтон в количествах 20 — 40 и 1 — 4 г/л, при этом выращивание ведут при рН 5 — 6, а

1. Способ получения дрожжей в капсулирована. инкубирование проводят при 15 — 25 С. ной форме, предусматривающий выращивание < 2. Способ по п. 1, отличающийся их в жидкой илн на плотной питательной сре- 1 тем, что выращивание дрожжей проводят на де, содержащей источник yrmpopa, источник гипсовых блоках, помещенных в жидкую азота, минеральные соли и витамины с после- питательную среду. дующей инкубацией, о т л и ч а ю щ и I с я Источники информации, тем, что, с целью стимулирования капсулооб- принятые во внимание экспертизе разования, в качестве источника углерода и 1. Патент США Р 3010879, кл. 195 — 83, азота используют, соответственно, маниоэу опублик. 1961.

ВН ИПИ Заказ 5260/34 Тираж SOS Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

1 tetrasporus МГУ 116

tetrasporus МГУ 40

Rhodotoru1a graminis МГУ А-281

Rh. rubra МГУ 691

0,8+0,1

3,3т0,2

1,7Ю,1

O,3Ю,1

0,4+0,1