Способ получения нуклеозидов

 

(1947186

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6I ) Дополнительное к авт. свил-ву (22)Заявлено 04 07.8р (21) 2950163/28-13 с прнсоелинением заявки М (23) Приоритет (51)M. Кл.

С 12 Р 19/38 (С 12 Р 19/35

С 12 R 1/04) (53) УЙ К 663. .1(088.8)9кударатееяявй коиятет

СССР

l0 делаи язееретеяяй я отарытяй

Опубликовано 30. 07. 82 . Бюллетень Рй 28

Дата опубликования описания 30. 07. 82

Т.В. Шанова, Г.И. Хомякова, Т.Ф. Фридман, Й..М.. Малеи, С.А. Коновалов, М.P. Шнитко, У.Я. Микстайо, К.А. Калунянц:" т и М.A. Гайлума (72) Авторы изобретения

Научно-производственное объединение "Биохимреактив" и Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОЗИДОВ

Изобретение относится к биохимии, а именно, к способу получения нуклеоэидов, которые применяются в медицине и научных исследованиях.

Известен способ получения нуклеозидов, предусматривающий гидролиз

РНК ферментными препаратами, содержащими нуклеаэы и фосфатазы, при нагревании (1). то

В качестве ферментных препаратов используют внутриклеточные ферменты, что усложняет процесс их получения.

Кроме того, необходима активация ферментов, разрушающих нуклеозиды. Выход нуклеозидов составляет 514.

Цель изобретения - увеличение выхода нуклеозидов и упрощение процесса.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения нуклеозидов, предусматривающем гидролиз РНК ферментными препаратами, содержащими нуклеаэы и фосфатазы, при нагревании, в качестве ферментного препарата используют внеклеточные ферменты микроорганизма Actinomyces coelicolor

А-18, при этом гидролиэ ведут при

37-400С, рН 8-9,1 в присутствии хлористого магния в концентрации 1 10

5 -10 M. Штамм Act i nomyces соеl i color

А-18 зарегистрирован во "ВНИИгенетика" под коллекционным номером

"ЦМПМ Б-464" и имеет следующие морфологические и физиологические характеристики.

На твердой среде, содержащей осахаренные амилазой пшеничную муку и крахмал, соли, мицелий имеет вид очень тонких разветвленных гид. Стенки клеток мицелия прямые. Ширина клеток мицелия 0,71-0,93 ммк. Спороносцы спиральные, с 1-3 завитками, нередно с примитивными спиралями, расположенными моноподиально, одиночные. Споры.овальнйе, шаровидные, с ггадкой оболочкой.

947186 4

Эо

50

Колонии неправильной округлой формы, края неровные, воздушный мицелий слабый, колонии серого или розовато-красного цвета. Диаметр гигантской колонии на 10-е сут роста l0- 12 мм. Среда не буреет, пигмент в среду не выделяется.

На агаризованной среде Чапека с 33 сахарс рост слабый, растет тонкой, почти прозрачной пленкой.

Колонии круглые, поверхность ровная, воздушный мицелий слабо развит, свет ло-розового цвета, диаметр колонии

6-7 мм.

На крахмал-аммиачной среде рост слабый, тонкой пленкой, среда не окрашена, диаметр колонии 3-4 мм.

На МПА образует небольшие колонии неправильной формы диаметром

7 8 мм„ растет в виде тонкой морщинистой пленки, в центре колонии слег ка выступающей над поверхностью агара.

Края колонии неровные, воздушный мицелий скудный, неокрашенный, сре, да не буреет.

На сусло-агаре растет хорошо в виде мощной морщинистой пленки кремового цвета. Воздушный мицелий отсутствует, колонии круглые, края волнистые, диаметр 12-15 мм.

На картофельно-пептонном агаре рост хороший, колонии в виде морщинистой пленки, окрашенные в красновато-розоватый цвет. Края колонии волнистые, диаметр 6-7 мм, воздушный мицелий скудный белого цвета.

На синтетической среде растет хорошо в виде небольших колоний диаметром 6-7 мм. Колонии гладкие, в центре слегка морщинистые, края неровные, колонии бесцветные или слегка розоватые.

На ломтике моркови рост слабый в месте укола; на ломтике картофеля рост слабый, в верхней части столбика в виде морщинистой пленки кремового цвета; мясо-пептонную желатину не разжижает; молоко хорошо пептонизирует на 10-е сут. Нитраты не восстанавливает.

Оптимальная температура роста

37oC — рост хороший в нижней части косяка в виде морщинистой пленки.

При 50"С вЂ” рост отсутствует.

Отношение к углеводам: крахмал гидролиэует, сахара употребляет с подкислением среды.

П р и и е р 1. 5 л культуральной жидкости, полученной в результате культивирования микроорганизма

Actinomyces coelicolor А- 18 подвергают сепарации. Получают 4 л с пернатанта с активностью нуклеазы

170 ед/мл.

100 r рибонуклеиновой кислоты растворяют в 1 л воды при подщелачивании водным раствором аммиака до рН 9,1. К полученному раствору

PHK добавляют 4 л фильтрата культуральной жидкости и снова доводят рН реакционной смеси до 9,1. Затем добавляют 5 г хлористого магния и устанавливают температуру реакционной среды 39оС. Выдерживают 10 ч при 37-40 С и 8,9-9,1 при постояно ном перемешивании рН поддерживают добавлением раствора аммиака . После окончания ферментативной реакции гидролизат содержит, г: гуанозина

18,0, аденозина 15, цитидина 9,1, уридина 14

Общее количество нуклеозидов, определенное методом ионообменной хроматографии, составляет 56,13 от .

PHK.

l1 р и м е р 2. Используют супернатант, полученный как в примере 1, с нуклеазной активностью 300 ед/мл.

100 r рибонуклеиновой кислоты растворяют в 1 л воды при подщелачивании 2Н гидратом окиси натрия до рН 8,7, добавляют 4 л супернатанта культуральной жидкости, полученному, как в примере 1, с активностью 300 ед/мл и снова доводят рН реакционной среды до 8,7.

Затем добавляют 5 г хлористсго магния и выдерживают 6 ч при 37-40 С и рН 8,5-8,7 при постоянном перемешивании рН поддерживают добавлением

2Н раствора гидрата окиси натрия.

После окончания ферментативной реакции гидролизат содержит, г: гуанозина 18,8, аденозина 16,, цитидина

9,2, уридина 14,7. Общее количество нуклеозидов 58,7i от PHK.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход .нуклеозидов, упростить процесс получения и сократить его длительность.

Формула изобретен я

Способ получения нуклеозидов, предусматривающим гидролиз PHK ферментными препаратами, содержащими нуклеаэы и фосфатазы, при нагрева5 947 нии, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода нуклеоэидов и упрощения процесса, в качестве ферментного препарата используют внеклеточные ферменты микроорга.низма Actinomyces coelicolor А-18, при этом гидролиз ведут при 37-40оС, 186 6 рН 8,0-9,1 в присутствии хлористого магния в концентрации 5 ° 10 Э- 1-1(Г м.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Японии Ф 47-27037 кл. 16 F 611.2, 1972.

Подписное

Заказ 5527/39 Тираж 505

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Рауаская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, Составитель Т. Мелентьева

Редактор П. Макаревич Техред М. Надь Корректор Г. Решетник