Способ получения карбоангидразы

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

«i> 95593() (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 06.03. 81 (21) 3257488/28-13 ф511М. Кп.з с присоединением заявки №A 61 К 35/78

Государствеииый комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 070982. Бюллетень ¹ 33

Дата опубликования описания 0709.82

ДЗ) УДК 577. 158 (088 ° 8) (72) Авторы изобретения

Н.Г. Доман и Ю.И. Комарова (71) Заявитель

Институт биохимии им. A.Н. Баха (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОАНГИДРАЗЫ

Изобретение относится к технике производства очищенных ферментных препаратов из растений, в частности к получению карбоангидразы, и может быть использовано в научных mc. следованиях различных направлений биохимии, генетики, а также в медицине для физиологических исследований.

Известен способ получения карбоангидразы путем экстрагирования надземной части растений с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония и гельфитрацией:

его на сефадексе. По известному способу высокоочнщенную карбоангидразу получают из листьев гороха, петрушки, шпината, при этом листья соответствующих растений гомогенизируют в подходящем буфере, гомогенат центрифугирувт при 20000-30000g-полученный супернатант принимают за исходный экстракт и подвергают фракционному осаждению сульфатом аммония, диализу, затем последовательной хроматографии на ДЕАЕ - целлюлозе, ДЕАЕ-сефадексе, гель-фильтрации на биогеле или агарозе или сефадексе ультрафильтрации. Причем -метод ультрафильтрации применяется также между отдельными этапами очистки с целью концентрирования ферментного раствора С13.

Недостатками известного способа являются длительность и многостадий". ность процессов, применение дорогостоящих редких импортных реактивов (биогелей, ДЕАЕ-сефадексов, Ультрафильтров). Быход карбоангидразы невысок и составляет 1-20% по активности и 1% по белку.

Целью изобретения является расширение сырьевой базы и повышение выхода целевого продукта.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения карбоангидразы путем экстрагирования надземной части растений с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония и гельфильтрацией его на сефаЛексе в качестве источника сырья иопользуют листья бобов сорта "Черные русские", экстракцию проводят в трисульфатном буфере и после гель«

25 фильтрации целевой продукт элюируют последовательно растворами 20, 40, 60 М сульфата натрия в 0,01 М-триссульфатном буфере, далее полученный ферментный раствор концентрируют

30 сульфатом аммония.

955930

1300

9,2

Известный

1,0

100

Получение экстракта из листьев гороха

24,6

46, 2

2,7

603, 1

Фракциониронанне сульфатом аммония

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве исходного сырья используют листья бобов сорта "Черные

pvcñêèå".

Растения выращивают в деревянных ящиках с почвой.

300 r снежеотобранных листьев (?8 дневных ) фиксируют жидким азотом ,и растирают н фарфоровой ступке с

300 мл 0,1 М три сульфатного буфера (рН 8,0), содержащего 0,1 М,)3- меркаптоэтанола и 0,001 М зтилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА)-буфер A.

Растертую массу фильтруют через дноГ.ной слой капрона, Фильтрат цент- 15 рифугируют при 22000 g 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую 1400 мг белка, принимают за исходный экстракт.

В экстракт добавляют твердый суль-20 фат аммония до концентрации 40% насыщения. Осадок белков, полученный при этом насыщении, отделяют центрифугированием при 10000g 20 мин и отбрасывают. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 55% насыщения. Осадок собирают центрифугированием (10000g.20 мин) и растворяют в 20 мл буфера А.

Полученную фракцию, содержащую

500 мг белка, наносят на стеклянную хроматографическую колонку (размером Зх100 см ) с сефадексом Г-200, уравновешенную 0,01 Я трис-сульфатным буфером, .содержащим 0,001 М ЭДТА и

0,05 М P --меркаптоэтанола - буфер В. З

После выхода 200 мл пустого объема сбор фракций по 10 мл осуществляют на коллекторе фракций,со скоростью

1 мл-мин. Во фракциях промеряют белок по поглощению при 280 нм я ак-. 40 тивность карбоангидразы колориметрическим методом по Вилбур и Андерсон в модифнкации Рикли. Наиболее активные фракции с объемами выхода от 280 мл до. 360 мл объединяют, по- 45 лученный объем составляет 80 мл и содержит 250 мг белка.

Этот ферментный раствор наслаивают на колонку (размером 6. 30 см) с .ДЕАЕ-целлюлозой (номинальная 50 емкость 0,60-0,80 мзкв/г, факс:.> набухаемости 9,0 мл/г сухого ан ; . нта, фирма "Реанал" Венгрия), уравь,. нешенную буфером Б, содержащим

20 мМ сульфата натрия, и неадсорбировавшийся белок вымынают тем же буфером (около 500 мл ), получая фракцию 1. Затем целлюлозу промывают 300-500 мл раствора 40 мМ сульфата натрия в буфере Б, получая фракцию II. Промгвание в обоих случаях проводят до полного исчезновения поглощения белка в злюате при 280 нм; указанных буферных объемов достаточно для достижения этого результата. Затем активную по карбоангидраэе фракцию получают проьынанием ДЕАЕ-целлюлозы раствором 60 мМ сульфата натрия в буфере Б, при этом сбор фракций по 10 wr осуществляют на коллекторе фракций со скоростью

10 мл/мин. Во фракциях промеряют булок по поглощению при 280 нм и активность карбоангидразы. Наиболее активные фракции -с объемами выхода от 60 до 180 мп объединяют. Объем полученных фракций составляет

120 мл и .содержит 112 мг белка.

Полученный ферментный раствор концентрируют сульфатом аммония при

70% насыщения, центрифугируют при

22000g 20 мин и хранят в виде осадка под сульфатом аммония при -20 С. Акd тивиость карбоан гидраэы сохранялась в течение 6 месяцев. .Полученный препарат гомогенен, при исследовании в аналитической центрифуге Spinco модель Е (США) получается единственный пик с коэффициентом седиментации 15,8 (скорость вращения ротора—

48660 об/мин, интервал съемки—

8 мин, концентрация белка 3,5 мг/мл), при аналитическом диск-электрофорезе в 7,5% полиакриламидном геле получается одна полоса.

Результаты очистки и выделения карбоангидраэы из листьев бобов ,приведены в таблице, где для сравнения приведены также результаты

-очистки карбоангидразы из листьев

ropoxa no известному способу.

9559 30

Продолжен.: - s ahzHi!i,i

3 4

46,2

2,7

Гель-фильтра- 169,9 . 50,2 ция на сефадексе Г-200

0,16

200,1

2,1 1847,7

Препаративный диск-электрофорез в полиакриламидном геле

Предлагаемый

100

1,0

1400 140

Получение экстракта из листьев бобов фракционирование сульфатом аммония

35,7

7,8

500 1100

17,9

30,7

Гель-Фильтра- 250 4300 ция на сефадексе Г-200

112 22300

159, 3.

8,0

Ионообменная хроматография на

ДЕЛЕ-целлюлозе

ФоРь ула изобретения

Способ получения карбоангидразы путем экстрагирования надземной части растений с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония и гельфильтрацией его на сефадексе, отличающийся тем, что, .с целью расширения сырьевой базы и повышения выхода целевого продукта, в качестве источника сырья используют листья бобов сорта Черные русские, 4© экстракцию проводят в трис-сульфатном буфере и после гельфильтрации целевой продукт элюируют последовательно растворами 20, 40, 60 мИ сульфата натрия в 0,01 M-триссуль45 фатном буфере, далее полученный ферРезультаты таблицы показывают, что предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет повысить активность гомогенной карбоангидразы в

12 раз и выход (в процентах от общего растворимого белка листьев) в

20 раз.

Таким образом, использование предлагаемого способа получения фер.менra карбоангидразы иэ растений упрощает технологию получения целевого продукта и ускоряет процесс выделения фермента в 4 раза за счет применения ионообменной хроматографии на ДЕЛЕ-целлюлозе вместо препа-. ративного электрофореза, прэволяет . получить высокоочищенный фермент за счет подбора оптимальных условий проведения всех стадий выделения и очистки карбоангидразы, повысить выход и активность гомогенной карбо" ангидразы стабильной при хранении в 20 раз за счет использования в качестве источника сырья листьев бобов сорта "Черные русские" с высоким содержанием фермента (8% от растворимого белка листьев);

Отпадает необходимость в покупке препарата карбоангидразы зарубежных Ф.- рм.

Отечественный препарат карбоангидразы может найти широкое применение в научных исследованиях по установ4р лению физиологической роли карбоангидразы в растениях и фотосинтезирующих организмах, а также может полностью заменить препарат животной карбоангидразы, выпускаемой зарубежны45 ми фиРмами и применяемый в медицине в физиологических исследованиях.

955930

Составитель A. Бражникова.

Редактор О. Филиппова Техред С.Мигунова Корректор A. Ференц

Заказ 6857/3 Тираж 714

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий, 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал UtttT "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 ментный раствор концентрируют сульфатом аммония.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Atk!ns С.А. Patterson В.0.

Graham D. "Plant carbonic anhydrases

II. Preparation and Some properties

of dicolydon.enzyme types". Plant ,Physiol 1972, 50, Р 2, р.р, 218-223.