Способ конструирования плазмидной днк,штамм @ @ -продуцент эндонуклеазы рестрикции @ и способ получения эндонуклеазы рестрикции @

 

1. Способ конструирования плаз мидией ДНК, включающий обработку двух плазмид эндонуклеазами рестрикции , соединения фрагментов плазмид с помощью ДНК-лигазы фага Т-4, трансформацию клеток Escherichia coli смесью полученных фрагментов плазмид, отбор среди .трансформантов, устойчивых к ашшциллину клонов, обеспечивающих рестрикцию и модификацию 71 с последующим .йьщеленнем ЙАТг: iq :ii iir:: Тея-;5р ::,;л, iiS.i{or; i A соответствующей плазмидной ДНК, о т л а ю щ и и с я тем, что, с .целью получения рекомбинатной.плазмид .ной ДHK,pjLR у 7, кодирующей эндпнуклеазу рестрикции E.coRV, содержащей гены системы рестрикции и модификации E.coRV, которые находятся под контролем промотора фага Ti Р , в качестве плазмнд используют плазмиды 1 233 ирЬС 13 и соединяют фрагменты плазмид в условиях торцовой сшивки. 2.Штамм Escherichia coli BKMB-1450D (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР) - продуцент эндонуклеазы рестрикции E.coR V. 3.Способ получения эндонуклеазы рестрикции Ё.сoR,включающий выращивание штамма - продуцента, разрушеНия клеток, осаждение клеточных обломков и последующую хроматографию полученного раствора, отличаю41 О щийся .тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и по .вьшения степени очистки в качестве штамма - продуцента используют штамм . E.coli BKMB-1450D выpaшJiвaниe проводят до середины логирифмической фазы роста, а после осаждения клеточ-. ньк обломков пров.одят фракционирование раствора фермента на фосфоГцеллюлозе с последующей хроматографией на г идроксил апатите.

„„В0„„1О4О И А

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

4gly С .12 N 15/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (21) 3330201/30-15 соответствующей плазмидной ДНК, о т— (22) 30.07.81 л и ч а ю шийся тем, что, с (46) 07.02.85. Бюл .. Р 5 ., целью получения рекомбинатной. плазмид(72) А.А. Баев, А.Н. Кравец, .ной ДНК,p3LR V 7, кодирующей эндонукА.С. Солонин, Н.П. Кузьмин, А.Ф.Мороз, леазу рестрикции Е.coRV, содержащей

Л.И. Глатман и В.И. Таняшин . гены системы рестрикции и модифика(71) Институт биохимии и физиологии ции Е,coRV, которые находятся под микроорганизмов АН СССР и Научно- контролем промотора фага % Р, в каисследовательский институт эпидемио- . :честве плазмид используют плазмиды логии и микробиологии им,Н.Ф.Гамалеи, )Jl, 233 и р 4С1 13 и соединяют фрагАМН СССР менты плазмид в условиях "торцовой (53) 575. 113: 577. 15(088. 8) сшивки". (56) 1. Солонин А.С. и др. Всесоюзный симпозиум "Макромолекулы клетки, 2. штамм Escherichia структура, функции, взаимодействия", I ВКМВ-1450П (Всесоюзная коллекция

Тезисы докладов, Москва, 1979, с. 31, микроорганизмов при ИнститУте био- о

Cxlatman L. et al. VII Interna- химии и физиологии микрооргрнизмов

tional colloqium on 1ahoratory methods АН СССР) †продуцент эндонуклеазы

for epidemiologicaT+survei11ance, Рестрикции .coR Ч. С: р. 22, Vernigегоde, DDR, Mag. 1981 3. Способ получения зндонуклеазы (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ П" АЭМИД . рестрикции Е. coR 7, включающий выращиНОЙ ДНК, ШТАММ ЕЯСНЕКТСНТА СО .I-IIPP вание штамма — пРодУцента, РазРУшеДУЦЕНТ ЭНдОНуКЛЕАЭЫ РЕСТРИКЦИИ ния клеток, осаждение клеточных об- ®,@

Е.COR V И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКПЕ- ломков и последующую хроматографию в

АЗЫ РЕСТРИКЦИИ Е.COR V полученного раствора, о т л и ч а ю- р

"(57) 1. Способ конструирования плаз- шийся тем, что, с целью увели мидной ДНК, включающий обработку - -чения выхода целевого продукта и подвух плазмид эндонуклеазами рестрик- вышения степени очистки в качестве ции, соединения фрагментов плазмид,. штамма — продуцента используют штамм с помощью ДНК-лигазы фага Т-4, транс- . Е.coli BKMB-1450D выращивание про формацию клеток Escherichia coli водят до середины логирифмической смесью полученных фрагментов плазмид, фазы роста, а после осаждения клеточ. отбор среди .трансформантов, устой- . ных обломков проводят фракционирочивых к ампициллину клонов, обеспе- вание раствора фермента на фосфо- ф чивающих рестрикцию и модификацию - . целлюлозе с последующей хроматогра;1фв а. 3 с последующим"вьделением фией на гидроксилапатите.

1040791

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генетической инженерии, Фермент E .со R U используют в генетической инженерии в экспериментах по конструированию рекомбинант1 ных ДНК.

Известен способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК,который основан на клонировании фрагмен- 10 тов ДНК с полностью спаренными концами при помощи вектора pJL 233,обеспечивающего прямую селекцию реком1 бинантов. и сверхсинтез ферментов Я .

Известна плазмидная ДНК, кодирую- f5 щая синтез эндонуклеазы рестрикции

Е,coRV, известен соответствующий штамм E. coli — продуцент 1.со8 У и способ получения указанного фермента. (2J .

Способ получения фермента E.co RУ включает выращивание штамма — продуцента, разрушение клеток, осаждение клеточных обломков и последующую хроматографию полученного раст- 25 вора фермента.

Однако в известной плазмидной

ДНК р1$ 13 с размером 4,7 Ng не обнаружено дополнительных генети-, ческих маркеров. Уровень синтеза щ. эндонуклеазы рестрикции E. со Й V относительно невысок и равен — 50 х х 10 единиц на грамм сырого веса биомассы клеток.

Целью изобретения является получение рекомбинантной плазмидной ДНК

pÝ1,Я У 7, кодирующей эндонуклеазу. рестрикции Е.со. g V, содержащей гены системы рестрикции и модификацйи

Е.со g V, которые находятся.под конт- 0 ролем промотора фага 0 Г

Цель изобретения — получение штамма — продуцента E. co R У, увеличе, ние .выхода целевого продукта (фермен- та Е,С011 У и повышение степени его очистки).

Для достижения цели в способе конструирования плазмидной ДНК, вклю- чающем обработку двух плазмид эндонуклеазами рестрикции,. соединение 50 фрагментов плазмид с помощью ДНК-лигазы фага Т-4, трансформацию клеток

E..coli смесью полученных фрагментов плаэмид, отбор среди трансформантов, устойчивых к ампициллину клонов,55 обеспечивающих рестрикцию и модифика-,, ,цию фага c последующим вьделением, соответствующей плазмидной ДНК в качестве плазмид используют плазмиды р J4 233 и pLQ 13 и соединяют фраг

11 менты плаэмид в условиях торцовои сшивки".

Для получения штамма — продуцента используют штамм Escherichia

coli BKN В-1450 D (Всесоюзная Коллекция микроорганизмов при Институте биохимии и Физиологии микроорганизмов АН СССР) — продуцент эндонуклеазы рестрикции E.coR Ч .

Для достижения цели в способе получения эндонуклеазы рестрикции

E,co R Н, включающем выращивание штамма — продуцента, разрушение клеток, осаждение клеточных обломков и последующую хроматографию полученного раствора в качестве штамма — продуцента используют штамм E. coli BKM

В-1450 D, выращивание проводят до середины логарифмической фазы роста, а после осаждения клеточных обломков проводят фракционирование раствора фермента на фосфоцеллюлозе с последующей хроматографией на гидросилапатите.

Пример 1. Рекомбинатная плазмидная ДНК p JL R Vt с размером

7 т.п.о. )(схема плазмидной ДНК р31,RV7 представлена на фиг. 1) содержит гены системы рестрикции и модификации Е со и У, которые находятся под контролем промотора фага лямбда hp1 и состоит из

Bgl 11-Р ц 11 фрагмента ДНК

11 ЭЬ RU 7, содержащего сайты рестрикции Bgl 11,E. coR 1, Р 1, расстояние между которыми 0,4; 0,7 и 1,5 т.п..о. (фиг. 1, табл. 1) .

11-В 1 11-фрагмента ДНК плазцц миды р Lg 13, содержащего сайты рестрикции Рцц 11, Р 1., Bgl 11, расстояйие между которыми соответственно равно 1,4; 1,3 т.п.о. (Фиг. 1, табл. 1);

Bgl 11-фрагмента, состоящего из

Bgl 11-Нра1 фрагмента ДНК р l1» 233 с промотором р и Bgl 11 — P>> 11 фрагмента ДНК плазмиды р14 13 (фиг.1, табл. 1).

Ь1а-ген, ответственный за синтез

В-лактамазы, гены системы рестрикции и модификации E,co(У и репликом плаэ. миды р 611 322.

Сущность способа конструирования указанной плазмиды состоит в

;том, что ДНК плазмиды p J g 233 одновременно расщепляют эндонуклеазами

3 1040 рестрикции Нра1 и Рщ 11, смешивают с р 11 фрагментами p LR 13 и соедиUQ няют ДНК-лигазой фага Т-4 в условиях торцовой "сшивки". Полученной смесью трансформируют клетки P.coli и отбирают клоны на селективной агаризованной среде с ампициллином. среди полученных трансформантов по устойчивости к ампициллину отбирают клоны, обеспечивающие рестрикцию и модифи- 10 кацию фага., из полученных клонов выделяют искомь|е рекомбинатные плазмиды.

Штамм — продуцент эндонуклеазы рестрикции E.,со ц 3, полученный транс- 15 формацией плазмиды р 3LR М 7 в штамм

E.coli 3C 5183, обеспечивает синтез эндонуклеазы рестрикции Еco ВМ в количестве не менее 2 х 10 единиц

Ь на грамм сырого веса клеток. Штамм 2р

Escherichia coli 5C 5183, содержащий плазмиду р 3L R М 7, депонирован в Всесоюзной Коллекции Микр.оорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером

ВКМ В-1450 Д. 25

Штамм Е.coli ЗС5183, содержащий плазмиду р 3LR 9 7, характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клет- 0 ки прямые, палочковидной формы, 1,2 — 1,6 х 2,0 х 6,0 мкм, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамм-отрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Хорошо 35 растут на простых питательных средах. При росте на.мясо-пептонном агаре, питательном агаре "Дифко" колонии гладкие, круглые, прижаты, блестящие, серые, край ровный, мут- 40 ные. При росте в жидких средах: мясопептонном бульоне, L5 -бульоне образуют ровную интенсивную муть, Физиолого-биохимические признаки. Растут в пределах от 4 до 45 С 45

О при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности g -глюкозу, g. -фруктозу, галактоэу, араби- 50 нозу, лактоэу, трегалозу. Не .усваивают ацетат, аданит. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической фор- 55 ме в виде пептона, аминокислот. Нит-: раты восстанавливают до нитритов.

Желатину не разживают. Уреазная активность не обнаруживается. Индол не о бр а з уют .

Устойчивость к актибиотикам.Проявляют устойчивость к ампициллину.

Предлагаемый способ получения специфической эндонуклеазы Е, со R9 включает в себя выращивание биомассы клеток штамма-продуцента, содержащего плазмиду р JLR 7 7, в жидкой питательной среде до середины логарифмической стадии роста, разрушение клеток ультразвуком, осаждение клеточных обломков центрифугированием, фракционирование на фосфоцеллюлозе, используя =тупенчатое повышение ионной силы буферного раствора с последующей очисткой активных фракций фермента на гидроксилапатите, Пример 2. При конструиро— вании рекомбинатной плаэмиды р JL Р 7 донором служила ДНК плазмиды р Lct 13, а реципиентом — ДНК плазмиды р 3Ь 233.

Для выделения плазмидной ДНК LG,13 штамм 3 С5183 содержащий плазмиду, подращивают до титра 5 10 кл/мг в 1,2 л среды В (Среда LB содержит

10 r бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г Na01, рН 7,4 на ! л воды) .

Клетки осаждают центрифугированием при 6000 g, 4 С и ресуспендируют в 40 мп 25%-ной сахарозы в 0,05 М трис-НС1 буфере, рН 8,0. Лизис проводят при 0 С. Для этого к суспензии добавляют 4 мл раствора лизоцима (5 мг/мп), через 10 мин — 16 мл раствора ЗДТА, рН 8,0 и через 5 мин, осторожно перемешивая, смесь 5 М раствора NaC1 до конечной концентрации

1И с 10%-ного раствора додецилсульфата натрия д о ко н еч ной к онце нтр ации

1 %-ной. Полученный таким образом лизат инкубируют при +4 С 12 ч. Лизат "осветляют" центрифугированием при 22500 g (+2 С, 60 мин). ДНК концентрируют добавлением 50%-ного раствора полиэтиленгликоля 6000 до конечной концентрации 10%-ной и 5 М раствора цо конечной концентрации

0,5 М, смесь выдерживают 6 ч при

+4 С. Образовавшийся осадок собирают центрифугированием при 2000 g, 4 С (5 мин) и ресуспендируют при 4 С в

16 мл ТЭН-буфера (30 мМ трис-НС1, рН 8,0, 2,5 мИ ЗДТА, 50 мИ NaCl) .

Препарат экстрагируют один раз хлороформом. Фазы разделяют центрифугированием при 9000 g, 4 С, 10 мин.

1040791

Верхнюю фазу,. содержащую ДНК, диализуют в течение 16 ч против ТЭН-буфера, при трехкратной смене буфера (+4 С). K раствору добавляют бромид этидия до конечной концентрации

300 мкг/мп и CsC1 плотности 1,3925, после чего препарат центрифугируют при 96000 g 40 ч (+15 С) . Отбирают зону содержащую плазмидную ДНК, У

10 шприцем, проколом пробирки сбоку.

Полученный препарат экстрагируют изо амиловым спиртом до полного удаления этидия, после чего диализуют при

+4 С против ТЭ-буфера. Затем ДНК экстрагируют фенолом, насыщенным

50 мМ трис-НС1, рН 8,0. От фенола избавляются экстракцией равными объемами эфира 5 раз. На завершающем этапе ДНК концентрируют добавлением трех объемов охлажденного

96%-нога этанола при -20 С. После

6 ч при -20 С осадок собирают центрифугированием при 6000 (-10 С, 15 мин.), высушивают в 500 мкл

ТЭ-буфера.

Для выделения плазмидной ДНК

233 клетки с плазмидой выращивают в 500 мл бульона 1,5 . Клетки собирают центрифугированием при

6000 g 15 мин +4 С. Осадок суспен- ЗО дируют в 4 мл 25%-ной сахарозы в

50 мИ трис-НС1 рН 8,0. Начиная с . этого этапа, все последующие операции проводят на холоду (О С). К суспензии клеток добавляют 1,2 мл З5 лизоцима (5 мг/мл), через 10 мин в инкубационную смесь вносят 2,6 мл

0,25 M ЭДТА, рН 8,0. Полученный лизат центрифугируют 1 ч при 48000 g, +3 С. К супернатанту добавляют бро- 40 мид этидия до конечной концентрации

300 мкг/мл. CsC1 до плотности

1,3925 и центрифугируют при 96000

40 ч. +15 С. Отбирают зону, содержащую плазмидную ДНК шприцем, про- 45 колом пробирки сбоку. Бромид этидия удаляют экстракцией изоамиловым спиртом. Раствор ДНК диализуют 24 ч против ТЭ буфера при четырех. сменах буфера. 50

Полученные препараты ДНК плазмиды

pLG 13 и р34 233 используют для конструирования рекомбинантной р 3L R V 7.

ДНК 1, 13 (3 мкг) инкубируют с эндо- нуклеазой рестрикции Р > 11 в буфере 55

А: 20 мИ трис-НС1 рН 7,6, 10 мМ дитиоэритритола, а ДНК р3 233 (1 мкг) с эндонуклеаэой рестрикции Нра1 и

11 — в буфере В: 50 мИ трис-НС1, 1рН 7,6, 50 мИ КС1, 10 мИ MgC1.. Гидролиз проводят 1 ч при 37 С, после чего гидролизаторы прогревают до

65 С 10 мин. Полноту гидролиза нро-> веряют электрофорезом в 0,9%-ном агарозе в ацетатном буфере. В дальнейшем ДНК р 13 (2 мкг) смешивают с ДНК 1, 233 (0,2 мкг) и осаждают тремя объемами 96%-ного этанола (-20 С, 4 ч) . Осадок собирают центрифугированием при 10 000 g 4 мин, высушивают и растворяют в 5 мкл буфера С: 50 мИ трис-НС1, рН 7,4, 50 мМ, 10 мИ Мя. Добавляют дитиоэритритол и

АТФ до конечной концентрации 10 мИ и 100 мкИ соответственно и 5 мкл лигазы для торцовой ошивки. Общий объем лигируемой смеси — 12 мкл. Лигирование проводят при комнатной температуре (18-22 С), 36 ч, Через двенадцатичасовые интервалы отбирают аликвоту. (2 мкл), разводят до 50 мкл дистиллированной водой и трансформируют Са+ -клетки Е. coli.

Получение компетентных клеток и трансформацию проводят по Cohen

S.N. А.С.U.Chang (1972. PNAS, USA, 69: 2110-2114) .

Трансконъюганты высевают на селек-. тивную среду с ампициллином . (30 мкг/мп) . Выросшие клоны тестируют на наличие плазмидной ДНК с ожидаемым молекулярным весом (5И0) методом

Т.Ес. kchard (1978, Plasmid, 1, 548-558).

Для анализа физической структуры плазмидную ДНК выделяют ускоренным методом (Klein Р.L. etal, 1980, Plasmid, 8, 88-93) .

Рестрикционный анализ проводят с помощью эндонуклеаз Р -1, Bg 1 11, 11. Отобранные. клоны проверяют на присутствие системы рестрикциимодификации EcoRV. Для этого сравнивают эффективность посева (э.п.) фага | „;„ Q на клетках, содержащих рекомбинантные плазмиды, а также штаммах иС 5183 (гq -mj. ) и ) С5183

5 | || 5 ) с плазмидой 01 13 На личие в клетках модификации устанавливают при снижении э.п. методом (Т. Arai, A.Aoki, J.Bact 5, 18, 1962) . Полученные данные представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, штамм

3C5183/ l. 13 на четыре порядка ограничивает размножение фага Ъ |„ 0

1040791 по сравнению со штаммом С5183 (Г я ), не несущем плазмиду р 13. Наиболее высоким уровнем ограничения обладает штамм,1 C5183/

/р JL R Ч7 (в 5 раз более высоким по 5 сравнению со штаммом $ C5183/ P 4 (j 13) .

Фаги, выращенные на клонах с реком.бинантными плазмидами, дают одинаковый титр на штаммах 3C 5183 и 3C 5183/

/pLGi3.

Таким образом, рекомбинантная плазмида р 3 R V 7 содержит гены системы рестрикции-модификации

Есо g g, ген беталактамазы, определяющей резистентность к ампициллину, 15 а также, как показано на фиг. мощный промотор фага 9,p . Плазма

P3LRV 7 состоит из Нра1-1 „-11 фрагмента плазмиды р Jl 233 с размером

2300 пар оснований и Pvu 11 фрагмента плазмиды 1,С 13 с размером в

3700 пар оснований. Общий размер плазмиды — 7 000 пар оснований, В

ДНК плазмиды р 3 LR V 7 имеется два сайта эидонуклеазы 1 1, два сайта 25 эндонуклеазы В gl 11 и по одному сайту эндонуклеаз Р„ц 11 и Е,co R 1.

Расстояние между сайтами даны в табл. 1. Фаговый промотор pg расположен на Bgl 11-Bgl 11 фрагменте плаэмиды $ 1LRV 7 и удален на 300 пар оснований от начала фрагмента р Ч > 11 плазмиды р 3(13. Следовательно, фаговый промотср максимально приб4 лижен к генам системы рестрикциимодификации E.со $V и обеспечивают их .активность. Релликация плазмиды

pgL$ Ч 7 осуществляется за счет репликона плазмиды р BR 322.

Пример 3. Для получения, 40 штамм-продуцента эндонуклеаэы рест-. рикции Е, со R V рекомбинатную плазмидную ДНК P )LRV 7 трансформируют в штамм Е. coli 3C5183. Фенотип штам- ма 3C5183-ExoV Erdo 1-Ехо V III 45 (" Молекулярная биология", т.1, ч.II, с. 77, 1980), что позволяет его ис-.. пользовать в качестве хозяина, обладающего минимальным уровнем примес- ных ферментативных активностей. : 50

Клетки штамма g С5183 подращивают до титра 2-3 10 мкл/мл, после

8 чего осаждают при 6000 g 15 мин, 0 С. Клетки суспендируют в равном . объеме О, 1М хлористого кальция и 55 вьдерживают при 0 С 1 ч, после чего повторно осаждают при 6000 g>

0 С и ресуспендируют в 1 мл О, 1М хлористого кальция В 50 мкл ДНК, полученной после лигазной обработки, добавляют !О мкл компетентных клеток. Смесь вьдерживают 20 мин при

0 С, затем 2 мин при 42 С и 10 мин при комнатной температуре, добавляют 1 3 мл среды L 8, ийкубируют

2 ч при 37 С с аэрацией. Суспенэию высевают на чашки с ампициллином (30 мкг/мл) . Трансформанты отбирают по методу, описанному в примере

Сконструированный штамм Е.coli

JC5183 с плазмидой р1 цk Ч 7 и . штамм E. coli 3 С5183 с плазмидой

p L G 13 проверяют на продукцию рест- риктазы Е, co) "° Для этого обе культуры подращивают в 1 л среды L 6 до титра 5 х 10 клеток 1 мл. Клетки

8 осаждают центрифугированием при

6000 g 15 мин, после чего по 0,9 r сырого веса биомассы каждого штамма суспендируют в 6 мл буфера 50 мМ трис-НС1, рН 7,6, 0,2 М NaC1 3 мМ -, меркаптоэтанола 100 мкг/мл лизоцима и выдерживают 40 мин при 0 С. Клетки разрушают ультразвуком. Полученный экстракт центрифугируют при 48000 g

2 С ч. Супернатант используют для определения активности фермента ..

С этой целью делают серийные разведения экстракта: 1/100, 1/500, i /1000, 1/25. 000, 1/50000 (см.фиг. 2) .

По 1 мкл на каждого разведения инкубируют 1 ч при 37 С с 1 мкг

ДНК фага % в 30 мкл инкубационной смеси с 50 мМ трис-НС1 р Н 7, 6, 50 мМ ИаС1, 10 мМ МдС1,, 6 мИ В-меркаптоэтанолом. Электрофореграмма продуктов гидролиза представлена на фиг. 2. Как видно, уровень активности фермента эндонуклеазы рестрикции

Е.со f Ч в бесклеточном экстракте сконструированного штамма Е. col i

BKN В-1450Q более чем в 5 раэ выше уровня активности этого же фермента в штамме Е. coli J С5183/PL/ 13 и составляет в пересчете на 1 г сырого веса биомассы около 3 000 000 ед активности фермента E. co R Ч, Пример 4. Вьщеление специфической эндонуклеазы рестрикции 5 .со1з..

Клетки Е. col i J С5183, содержащие рекомбинантную плазмиду р3 1, R V7, выращивают при 37 С, с обильной аэрацией до середины логарифмической стадии роста в среде LS . Выход биомассы составляет около 2 ч на литр среды.

1040791

Биомассу клеток штамма-продуцента собирают центрифугированием прн

6000 g 30 мин. Полученную биомассу клеток хранят при -20 С.

10 граммов (по сырбму весу биомас- 5 сы клеток суспендируют в 50 мл буферного раствора А: 50 мМ калий †фасфатного буфера, рН 7,0 1 мМ ЭДТА, 1 мИ

NaN,, 7 мМ В-меркаптоэтаыола, содер— жащего 400 мМ НаС1,добавляют лизоцим до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубируют (О C) 15 мин.

Полученные после обработки бактериальных клеток лизоцимом сферопласты разрушают ультразвуком на дезинтегра — 15 торе типа "M Е" 30 с х 20 раз с интервалом в 90 с ° При разрушении тем-. пература суспензии не должна превышать +8 С. Клеточный дебрис убирают центрифугированием при 75000.в тече в 20 ние 90 мин +4 C. В полученном экстакте определяют активность фермента

E.со Й Vвразведении 1: :10,,1: :100, 1:500 и 1:100. 1:10000 (разводят буферным раствором А до конечной концентрации NaCI 200 мМ) .

Разведенный экстракт наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (2х25 см, "Mhatman" Р1!), уравновешенную буфером А, содержащем 200 мИ ИаС1.

Колонну с фосфоцеллюлозой после нанесения экстракта клеток промывают 2-3 объемами колонки буферным раствором А, содержащим 200 мМ NaCI и фермент элюируют тремя порциями 35 буфера А, содержащего 400 мМ, 600 мМ и 800 мМ ЫаС1. Активные фракции фермента элюируются в 1/3 объема фракции 400 мИ NaCI и 2/3 объема фракции 600 мМ NaCI. Активность фер — 4О мента E.cо g V определяется в разведениях элюата в 1:10, 1:100 и 1:500 раз. Активные фракции фермента

E.со К V объединяют вместе и разводят холодным (+4 С буферным раствором А 45 без NaCI в два раза, и наносят на колонку (2 х 5 см) с гидроксиланати- том и элюируют фермент 200 мл линейного градиента концентрации калийфосфатного буфера рН 7,0 от 50 до 50

500 мИ (см. Фиг. 3) . Активность фермента E.ño RV определяют во фракциях в разведении 1: 10, 1: 100, 1: 200,.

1:500. 20 мп элюата с гидроксилапати" та, обеспечивающие полный гидролиз 55

1 мкг ДНК фага Q в разведении 1:200, диализованные при двухкратной смене через 4 ч против буферного раствора содержащего 10 мМ калий-4>oc@aTного буфера рН 7,0, 1 мМ ЭДТА, 1 mM NaN,, 2 мМ В-меркаптоэтанола

oKончательно концентрируют диализом против буферного раствора Ь, содержащего 50Х (об/об) глицерина.

После концентрирования фермента при диализе против 50Х-ного глицерина, объем раствора фермента E .co xi оставил 4.,8 мл с удельной активностью 1,2х10 ед/мл (3 000 000 ед/мг белка) . Это составляет 6 000 000 ед или 20Х от суммарной активности в неочищенном экстракте (см. табл. 3) .

За единицу активности специфической эндонуклеазы E.co R V принимают минимальное количество фермента, необходимого для полного расщепления 1 мкг ДНК фага ф в течение ч при 37 С.

Полученный фермент Г.со1 7 разводят буферным раствором, содержащим

10 мМ трис-НСI, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, i мМ МаИ, 10 мМ ДТТ, 200 мкг/мл желатина и 50Х (об /об) глицерина в

100, 500 и 1000 раз и определяют активность.

Для этого к 3 пробам объемом по 30 мкл, содержащим 1 мкг ДНК

Фага Я С 852, 50 мМ трис-НСI, рН

7,5, 50 мМ NaCI и 10 мМ И@С12, добавляют 1 мкл разведенного в 100, 500 и 1000 раз фермента соответственно, инкубируют 1 ч при 37 С и.5 мин при 65 С и охлаждают в ледяной бане.

Полученные таким образом пробы анализируют электрофорезом в пластинчатом 0,8Х.-ном агарозном геле (90 мМ трис — боратный буфер, рН 8,3) . !

Пригодность полученного фермента для структурных исследований ДНК и опытов по конструированию in vitro рекомбинантных молекул ДНК определяют следующим образом: а) инкубируют ДНК плазмиды р."П, 233, не содержащей сайта расщепления эндо- нуклеазы Е.со 3l, с 10-кратным избытком фермента.в течение 2 ч, при последующем анализе электрофорезом не наблюдают перехода ковалентнозависимой суперскрученной формы плазмидной

ДНК в релаксированную и линейную формы, что указывает на отсутствие примесей неспецифических эндонуклеаз в препарате фермента; б) пригодность препарата фермента E.cot(V для генно-инженерных работ определяют по способности вос—

104079!

12 соединения E. со В ) фрагментов ДНК бактериофага лямбда с. помощью ДНК-лигазы бактериофага Т-4 с последующим электрофоретическим анализом продуктов реакции (см. фиг. 4),. 5

Таким образом, предлагаемые объекты позволяют получать высокоочищенHbIH препарат эндонуклеазы рестрикции

E.coR7, с высоким выходом.

Предлагаемые изобретения позво- 10 ляют получить штамм Е.coli продуцент эндонуклеазы рестрикции Е.соа> .Уровень содержания фермента в предлагаемом штамме E . coli ВКМ В 1450 D не менее 3 х 10 единиц на 1 r сырого -15 веса биомассы клеток, что в пять. раз превосходит по уровню синтеза исходной штамм 3 С5183/ Ь913. Данные для сравнения приведены на фиг. 2.

: Рекомбинантная плазмида,11, R 7 7 содержит маркер резистентности клеток к ампициллину, что дает возможность стабильного культивирования клеток с

/ рекомбинантной плазмидой.

Схема очистки активного фермента 25 эндонуклеазы с. со 3 М

I. НЕОЧИЦЕННЫЙ ЭКСТРАКТ

П. Фракционирование на фосфоцеллюлозе Р11 30 (0,4 М, 0,6 М, 0,8 М NaC1)

Точки элюции фермента

0,4 и 0,6 М NaC1

Й. Хроматография на ГАП (0,05 М- З5

0,5 И

К+-фосфатного буфера рН 7,0

Точка элюции фермента

О, 23 М К фосфатного бу- 40 фера

1У. Концентрирование фермента (диализ против 50Х глицерина

Признак является особенно существенным при подготовке посевного 45 материала для засева больших объемов в условиях промышленного производства фермента, так как позволяет созранить популяцию клеток с системой модификации и рестрикции E.coÂÌ . 50

Кроме того, наличие в плазмиде маркера резистентности к ампициллину открывает перспективы дальнейшего конструирования различных штаммов: 55

E.coli с увеличенным синтезом конечного продукта и с пониженным содержанием интерферирующнх ферментов.

Предлагаемый способ конструирования рекомби нант ной пла эмидной ДНК обеспечивает высокое содержание плазмиды в клетках за счет многокопийности вектора и приближенность мощного фагового промотора и генам, кодирующим синтез,рестриктазы и метилазы E.coé V, что в сумме увеличивает дозу гена и повышает эффектив нос т ь тр а нс кр илции .

В отличие от известных способов конструирования в предлагаемом изобретении в качестве вектора использовалась плазмида PBL 233, которая позволяет прямую селекцию клонов с рекомбинантными плазмидами при интеграции чужеродных фрагментов с полностью спаренными концами. Применение данной системы клонирования обес. печивает введение чужеродных генов под контроль мощного промотора фага

Ъ р< без дополнительного синтеза uccd) còâåHHbõ "липких концов, которые могут нарушать транскрипцию на границе вектор-чужеродный фрагмент.

Штамм E.coli ВКИ В-14502 как продуцент специфической эндонуклеазы

Е.со обладает следующими преимуществами: а) повышенный синтез конечного продукта; б) пониженное содержание неспецифических нуклеаз (например,E. со Ю/), что позволяет существенно упростить способ очистки фермента; в) отсутствие ауксотрофных митаций позволяет получать биомассу клеток на синтетических средах в резистентностью к ампициллину и обеспечивает стабильное культивирование штамма-продуцента. Перечисленные свойства данного штамма позволяют его использовать в качестве продуцента как в лабораторных условиях, так и на промышленных установках, что особенно важно в связи с отсутствием этого фермента и его изошизо меров в коммерческих каталогах иэостранных . фирм.

Предлагаемый способ выделения ,специфической эндонуклеазы рестрикции E.ño R 7 позволяет сократить время получения фермента в 2-3 раза и увеличить выход конечного продукта в

10 000 раз по сравнению с базовым

1объектом. Полученный таким образом препарат эндонуклеазы E. со ЙМ не .содержит интерферирующих активностей, 1040791, 24 !

Полученный таким способом препарат фермента специфическая эндонуклеаэа рестрикции Е. со К 9 превосходит луч шие образцы зарубежных коммерческих

5 препаратов (например, фирмы "Бэрингер" ФРГ и "BRL" США) — ферментов данного класса по удельной активности и соответствует им по степени очистки.

13.Т абли ца 1

Bgl 11-EcoR 1

Есо к 1- Р< 1 р t 1 .Phyll 11

Рз

Pst 1-Bgl 11

0.7

1,5

1,4

1,3

Bg1 11-Bgl 11

1,7

Таблица 2 тепень ограничения фага Ъ „;р, выращенного на штамме .col JC5183, несущем плазмиду р Ь 13 и рекомбинантные плазмиды

Штамм Е.coli

2С5183

I 5 %1 р 2.Q13 ДДН7

pJi RV 2 р 2,К 3 32.R V 4

0,8 10

5, 2 10

1,6 10 .1,0 10 что позволяет его использовать в структурных исследованиях ДНК и опытах по получению рекомбинантных молекул ДНК.

За базовый объект следует принять способ, описанный в качестве прототипа. Выход целевого продукта предло женным способом составляет не менее

20Х или 6 х 10 единиц на г биомассы (сырой вес), что в 10 000 раз 10 больше по сравнению с базовым объектом, Полученный таким образом фермент имеет удельную активность 1,2 х

«10 ед/мл (или 3 х 10 ед/мг белка), что в 2000 раэ больше, чем при при- 15 менении базового объекта) .

Препарат фермента, полученный этим способом, не содержит неспецифических эндонуклеаэ, на что указывает полное сохранение суперспираль- 2р ной структуры плазмидной ДНК р 3L 233, не содержащей сайтов, узнаваемых эндо .нуклеазой рестрикции E .со при стократном избытке фермента и длительной инкубации. Полученный препарат фер- 25 мента полностью лишен эндонуклеаз и фосфатаз, так как Е .со О -ферменты ДНК способны соединиться с помощью ДНК-лигазы.

Все вышесказанное указывает на 30 то, что данный препарат фермента может быть использован в экспериментах по генетической инженерии и структурнык исследованиях ДНК.

Расстояние между участками узнавания эндонуклеазами рестрикции (сайтами) на ДНК

Фрагмент Сайт рестрикции Расстояние

ДНКрЗЬR V 7 между сайтами в т.п.о. ф ) т.п. о. — тыс. пар. оснований.

1040791

Табли ца 3

Очистка эндонуклеаэы рестрикции F. co k) Этап

100

40

12

70

3,8

7,5

300

1У

Общая активность фермента (в единицах х 10}

Удельная активность фермента в единицах/мг х 10)

Удельная активность фермента (в единицах/мг

1 04-) Выход фермента, % t040791

puz. 2 ч

I ь

1l

1 с

Ю fg

1 ь с

ИР

° с

Ф Ь

ZN w .

Ф

/б Гр

0bbee(N сия) 1040791

Редактор О. Юркова

Корректор Е.Сирохман

Техред Т.Маточка

Подпис ное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Заказ 3111.1 Тираж 525 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035,. Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5