Способ определения антиокислительной активности липидов
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
09) (и ) 4
G 01 N 33/45
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
И ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
-з. (21) 3357314/28-13 (22) 16.10.81 (46) 30.10,83 Бюл. М 40 (72) В.Н. Ушкалова, Г.Д. Кадочникова и В. Е . Соловьев (71) Тюменский государственный медицинский институт (53) 612.11(088.8) (56) 1. Харитонова А.А., Козлова З.Г., Цепалов В.Ф., Гладышев Г.П. Кинетика и катализ, 1979, 20,3,593-599.
2. Бурлакова Е.Б., Алексеенко А.В., Иолочнина Е.М., Пальмина H.Ï., Храпова Н.Г. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте, И., "Наука", 1975, с. 11- 15. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИПИДОВ, включающий воздействие на пробу липидов метилолеатом, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, воздействие метилолеатом проводят в растворе хлорбензола в присутствии динитрилазобис» изомасляной кислоты, определяют поглощение кислорода в пробе и контрольном образце и рассчитывают антиокислительную активность по формуле лп п< ин "ннА, 10Д— л Ы P ь вн, где АОА - антиокислительная активностьь; п время поглощения кислорода на 1 мл субстрата при окислении пробы; лк время поглощения кислорода на 1 мл субстрата при окислении контрольного образца;
Р - навеска липидов, мг.,1051428 и
"инд тнА
ЮВ= .М лк
QнД
К = —
Изобретение относится к медицине, биологии, фармации, пищевой технологии, к тем их разделам, где исследуют гомолитические свойства липидов, их активность в радикальных реакция, ведут подбор протекторов, антиоксидантов, Известен способ тестирования антиоксидантной активности сложных смесей с помощью модельной реакции ини- 10 циированного окисления кумола, сущность которого состоит в том, что определенный объем кумола (5-10 мл) окисляют в присутствии инициатора (динитрилазобисизомасляной кислоты) при 60-90 С в присутствии добавок липидов в количестве 5i к субстрату.
Результаты измерения обрабатывают графическим методом и находят количественную характеристику активности 2О ингибиторов, входящих в состав анализируемой сложной смеси, определяют константу скорости обрыва цепей flj .
Недостатками аналога являются большое различие свойств модельной систе- 25 мы и липидов, образование в процессе окисления кумола-фенола, который тормозит окисление и способен исказить результаты анализа.
Существенным недостатком аналога является использование большого количества липидов, что делает невозможным применение способа к биологическим объектам.
Наиболее близким к предлагаемому является способ определения антиокислительной активности липидов с помощью метилолеатной модели, сущность которого состоит в том, что определенный объем метилолеата хранят на воздухе, в присутствии смеси хлорида железа и аскорбиновой кислоты в качестве катализатора при 37 С. В процессе хранения путем отбора проб опре-1 дел яют время на ко плен и я I 0 1 0 моль/ r
rK перекисей (4<„<) B аналогичных условиях окисляют метилолеат в присутствии добавок липидов и фиксируют (2) . Антиокислительную активность (AOA) рассчитывают по формуле
on ng
АОА Инд "HHA
Р
Недостатками являются. большой расход метилолеата 10-20 мл, трудоемкость и длительность анализа (необ- Ы ходимое титрование 10-12,проб, вреMR анализа 10-20 ч). Кроме того, недостатком является большой расход ли2 пидов I500-1000 мг}, а также недосTdточная точность из-за низкой устойчивости перекисей, особенно в присутствии железа, когда распад перекисей становится трудно контролируемым, Цель изобретения - ускорение и повышение точности способа.
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения антиокислительной активности липидов, включающему воздействие на пробу липидов метилолеатом, воздействие метилолеатом проводят в растворе хлорбензола в присутствии динитрилазобисиэомасляной кислоты, определяют время поглощения кислорода в пробе и контрольном образце, и рассчитывают антиокислительную активность по формуле
ПП rim
0 м ""í"ä ""H* 1
МГ л) p
"ин где AOA — антиокислительная активност ь л цн - время поглощения кислорода на 1 мл субстрата при окислении пробы;
4н„* - время поглощения кислорода на 1 мл субстрата при окислении контропьного образца;
P - навеска липидов, мг.
Способ осуществляют следующим образом.
Пробу метилолеата (0,5-2,5 мл) смешивают 1:1 с хлорбензолом 0.,52,5 мл, в пробу вводят в качестве инициатора динитрилазобисиэомасляной кислоты в количестве 0,5-4 мг/мл раствора, пробу насыщают кислородом при 60 0,2 С, затем измеряют время поглощения 25 мм кислорода на l мл метилолеата. В аналогичных условиях окисляют пробу в присутствии 1-3 мл липидов, определяют время и г 3 поглощения 25 мм кислорода на мл метилолеата. Рассчитывают антиоксидантную активность AOA липидов по формуле
Пример 1, Тестирование антиоксидантной активности рыбных липидов.
Липиды выделены бинарным растворителем хлороформ-метанолом из мышечной ткани пеляди Coregonus peled (Ymelin).
Л«п<
"инд "юнр, Бб-40
"инд
Очевидно, что в указанных пределах
А0А липидов не зависит от концентрации инициатора. Преимущество анализа в примере 2 состоит в большей точнос-50 ти измерения периодов индукции.
Пример 3. Тестирование айтиоксидантной активности липидов эритроцитов крови. 55
ВНИИПИ Заказ 8656/43 ((етилолеат (2, 5 t1i1) с ма««1в,s, t хлорбензолом в соотношении I;I объему с инициатором в количе<..tве
4 мг/мл, вводят навеску липидов в расчете 1 мг/мл метилолеата. Пробу насыщают кислородом при 60+0,2"С.
Измеряют период индукции (< „„д ), с 25 мм кислорода на 1 мл метилолеага, и составляет 5,8 мин. I<) Аналогичным образом измеряют нериод индукции (<„"н„) в пробе без добавки липидов, который составляе i 4,2 мин. Антиоксидантнуа активность (АОА) рассчитывают по формуле пя л<, "инд "ни* 5,В -4,Л A0A * <- (Ot4 "ИНД < 5,8 - 4 2 1 = 0 4 20 ,2 Пример 2, Тестирование антиоксидантной активности рыбных липидов при меньших скоростях инициирования. Использованы те же липиды, что в примере 1. Метилолеат (1 мл) смешивают с раствором инициатора в хлорбензоле в соответствии 1:1 по объему, кон30 центрация инициатора в пробе 2 мг/мл раствора или 0,5 мг/мл метилолеата. Пробу насыщают кислородом при 60 + +0,2 (;..Измеряют время поглощения 25 мм кислорода на 1 мл метилолеата (ttt Аналогичным образом измеряют период индукции окисления пробы с добавкой 1 мг/мл липидов ((.„н „ ), он составляет 56 мин. Рассчитывают ан-. тиоксидантную активность липидов по 4О формуле ««онеаг (I мл) < мешивают с хлорб - -<:««м н соотношении 1: 1, вводят и ициаг< р в количестве 1 мг/мл расти<<ра, пробу насыщают кислородом при 6() (I.2" < . Определяют <- „«он составляет 40 мин . Аналогичным образом окисляют мегилолеат в присутствии навески липидов, выделенных на 2 ип цельной крови, навеска липидов равна 1 5 мг/мл л П 1 / ф определяют г<„„д, он составляет 80 мин. Рассчитывают AOA липидов Л «k (NHQ (. инд 72- 40 A0A =— = 0,56 л< 40g "инд На вес ку липидов необходимо контролировать, она должна составлять 1-3 мг на 1 мл метилолеата, при небольшом отклонении, до 0,5 или 2-3 мг/мл необходимо вводит ь поправочный коэффициент 1 К = — P где P - навеска липидов, мг, Преимущества предлагаемого способа состоят в том, что он прост в исполнении, требует малых количеств реагентов и липидов, применим к любым биологическим объектам, позволяет количественноо охарактеризоват ь антиоксидантную активность (AOA) различных липидов и сравнить ее с соответствующимм параметром дру гих ор ганических веществ. В предлагаемом способе снижен расход метилолеата и липидов по сравнению с известным в 20-30 раз, время анализа - в 20-100 раз. Чувствительность предлагаемого способа выше чувствительности прототипа в 10100 раз с учетом только разницы в чувствительности иодометрического титрования и манометрических измерений, чувствительность повышается в предлагаемом способе также за счет исключения ошибок при распаде перекисей. Способ может быть использован в клинической медицине, биофизике, биофармации, пищевой технологии, где оценивают антиокислительную ак" тивность липидов, а также рекомендован для тестирования антиоксидантной, протекторной активности различных органических соединений, Ти(5аж 873 Подписное филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул ° Проектная, 4
