Способ получения коньюгата

 

СПОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЬЮГАТА на основе.иммуноглобулина или его фрагмента, ковалентно связанного с 1.-5 группами формулы

(91 (11) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОЛИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

0Н

---С Н

2 5 — СК

Н 0

СН3

ОН

Н3 (21) 3378149/23-04 (22) 11 ° 01.82 (31) 8100847 (32) 12.01.81 (33) Великобритания (46) 23.01.84. Бюл. Р 3 (72) Джордж Фердинанд Роулэнд и Робин Джордж Симмондз (Великобритания) (71) Лилли Индастриз Лимитед (Великобритания) (53) 547.94.07(088.8) (56) 1. Гринштейн Дж., Виниц M. Химия аминокислот и пептидов. M., "Мир", 1965, с. 446. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЬ(ОГАТА на основе имиуноглобулина или его фрагмента, ковалентно связанного с

1-5 группами формулы

3(59 С 07 Р519 04 A 61 К 31

N . 0H

1 0(»СП3 отличающийся тем, что им-(9 муноглобулин ggG или его фрагмент подвергают взаимодействию с соответствующим молярным количеством азида дезацетилвинбластиновой кислоты при рН 8,5-9,5 и температуре 5-25 С.

1069628

Изобретение относится к способам получения нового коньюгата на основе иммуноглобулина, обладающего противораковой активностью.

Известна реакция ацилиронания пеп. тидов аз1дамикислот 513 . 5

Цель изобретения — получение нового иммуноглобулинового коньюгата, обладающего ценными, противораковыми снрйстнами.

Поставленная цель достигается 10 тем, что согласно способу основанному на реакции получения коньюгата на осноне иммуноглобулина IgG или его фрагмента, коналентно связанного с

1-5 группами формулы 15

ОН вЂ” -egHy

20 о-сн, 30 иммуноглобулин IgG или его фрагмент подвергают взаимодействию с соответ-. ствующим молярным количеством азида деэацетилвинбластиноной кислоты при рН 8,5-9,5 и 5-25 С. 35

При проведении реакции раствор азида в подходящем растворителе, таком как диоксан, медленно по каплям добавляют к буферному раствору иммуноглобулина, например в 0,35 М i 40 боратном буфере при рН 9. Коньюгат выделяют методом геленой фильтрации и хранят в насыщенном растворе сульфата аммония, который можно легко вернуть в исходное состояние путем 45 диализа с помощью боратного буфера, или его можно сохранить в холодильнике при 44С или в,замороженном состоянии, например при — 20 С. B результате происходит образование ковалентной связи между одной или более винса-фрагментами и свободным аминогруппами иммуноглобулиновой молекулы, например аминогруппами лизиновых остатков. Число присоединенных фрагментов зависит от концентрации реагентов и продолжительности -реакции, однако обычно оно составляет величину порядка 1,2-5.

Азидный реагент может быть легко 60 получен иэ винбластина, сульфата нинбластина или иэ деэацетилвинбластина путем предпочтительного гидразинолиэа С -эфира с последующим диаэоз тированием. Гидраэинолиэ винбластина 65 при умеренных температурах в растворе метанола протекает с образованием преимущественно моногидразида, и реакция такого продукта при 0-10 С с соляной кислотой и нитритом натрия в подходящем водном растворителе дает желаемый азид деэацетилвинбластиновой кислоты.

Указанный азид может быть получен при температурах ниже 5 С согласно указанному и без выделения азида,рН устанавливают равным 9 и добавляют смешивающийся с нодой растворитель, например такой как диоксан. Затем добавляют иммуноглобулин в боратном буфере, имеющем рН 9, и температуре реакционной смеси дают повышаться до комнатной. Избыток азида разрушают разбавленным аммиаком, и коньюгат очищают гель-фильтрацией, они могут находит применение в лечении животных, а также в контрольных и аналитических экспериментах.

В качестве исходных иммуноглобулинов могут служить следующие вещества:

IgG коз и овец, иммунизированных карционозмбрионным -антигеном, IgG острой лимфобластической лейкемической антисыноротки кроликов, IgG из антисыворотки различных приматов, предназначенной против ост рой лимфобластической лейкемии, острой миелобластической лейкемии, хронической лимфобластической лейкемии и хронической гранулоцитоксической лейкемии, IgG rroa и овец, иммунизированных веществом, вызывающим рак легких; моноклональный IgG из гибридомассы мышей., секретирующей античеловеческие карциномные антитела; .моноклональны IgG иэ гибридомассы мышей, секретирующей античеловеческие меланомные антитела; моноклональный .IgG,гибридомассы мышей, секретирующий антитела, реагирующне с клетками человеческой лейкемии; моноклональный IgG гибридомассы мышей, секретирующий антитела, реагирующие с человеческими нейробластомными клетками; моноклональный.IgG гибридомассы мышей, секретирукщий антитела, реагирукияие с человеческими грудными раковыми антителами: моноклональный ?ц6 гибридомассы мышей, секретирукщий антитела, реагирующие с яичниковыми раковыми клетками человека; моноклональный 1д6 гибридомассы выпьей, секретирующий антитела, реагирующие с остеосаркомными» раковыми ,Клетками людей.

Как указывалось,-предлагаемый .коньюгат может быть также получен с

1069628 помощью иммуноглобулиновых фрагментов, таких как I:аВ, ГaB или Г(aB)< или IgM мономер, полученный из антитела, например путем протеолитического энзимного расщепления. Такие вещества и методы их учения хоро. 5 шо известны.

Коньюгаты, получаемые по предлагаемому способу, могут найти применение в лечении раковых опухолей, Коньюгаты эффективны в широком диапазоне доз и могут применяться для лечения взрослых пациентов в дозе 1-10 мг/кг (виденсиновый фрагмент), обычно в интервале 3-9 мг/кг, Пример 1. Получение овечье- 15 го виндесин-антикарциноэмбрионного антигенного коньюгата.

Гидразид дезацетилвинбластиновой кислоты (6 мг) растворяют в 1N растворе НС1 (340 мл) и полученный раствор охлаждают до 4 С. 60 мкл водного раствора нитрита натрия, имеющего концентрацию 10 мг/мл,, добавляют к получениой смеси и ее перемешивают при 4 С. Через 5 мин при интенсивном перемешивании добавляют 1N раствор .Na0II (300 мл) и диоксан (120 мл), после чего вносят 280 мл раствора овечьего антикарциноэмбригенного анткгена, имеющего концентрацию

21,3 мг/мл,в среде боратного буфера с концентрацией 0,34 M-при рН 8,6.

Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2ч,. поддерживая рН 9 с использованием

0,1N раствора МаОН, Избыток азида разрушают путем добавления 1N раство-ра аммиака (60 мл) п >и перемешивании в течение часа. Полученный продукт выделяют методом гель-фильтрации на колонке размерами 1к25,5 см (20 мл) 40 с био-гелем Р-6, уравновешенным фосфатным буферным физиологическим раствором. Исключенный пйк собирают (2,66 мл) и определяют в нем содержание протеина по методу Лоури и со- 45 держание виндесина методом разностной спектроскопии. Полученный таким образом коньюгат содержит 4,6 моль винденсина на моль IgG.

Пример 2. Получение мышиного винденсин-моноклонального антикарционоэмбрионного антигенного коньюгата. ! I

Гидраэид дезацетилвинбластиновой кислоты (10 мв) растворяют в 1N соляной кислоте (0,56 мл) и полученный раствор охлаждают до 4 С. 100 мкл раствора нитрита натрия с концентрацией 10 мг/мл добавляют к реакцион- 60 .ной смеси и последнюю, перемешивают при 4 С. Через 5 мин при интенсивном перемешивании добавляют 1N раствор едкого натра (0,5 мл) и диоксан (0,2 мл), после чего добавляют 0,5мл 65 раствора мышиного моноклонального антикарционо-эмбрионного антигена, имеющего концентрацию 15,6 мг/мл в растворе 0,34 боратного буфера при рН 8,6. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, поддерживая при этом рН

9 путем добавления 0,1N раствора едкого натра. Избыток азида разрушают добавлением 1М раствора гидроокиси аммония (0,1 мл) и перемешиванием еще в течение часа. Продукт реакции выделяют методом гель-фильтрации на колонне размерами 1х27 см (21 мл) с био-гелем Р-6, уравновешенным фосфатным буферным физиологическим раствором. Исключенный пик собирают (4,07 мл) и определяют содержание в нем протеина и виндесина методом спектроскопии при 270 н 280 нм..tloлученный таким образом коньюгат содержит 2,1 моль виндесина на моль

1gG.

Пример 3. Получение кроличьего виндесин-противомышиного IgG коньюгата.

Гидразид деэацетилвинбластиновой кислоты (12 мг) растворяют в 1N соляной кислоте (0,67 мл) и полученный раствор охлаждают до 4 С. Добавляют

120 мкм раствора нитрита натрия с концентрацией 10 мг/мл и реакционную смесь перемешивают при 4 С. Через

5 мин при интенсивном перемешивании добавляют 1N раствор едкого натра (0,6) и диоксан (0,24 мл), после чего добавляют 1,0 мл раствора кроличьего антимышиного IgG с концентрацией 11,7 Mr/мл в 0,34 M растворе борат. ного буфера при рН 8.6. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, поддерживая при этом рН 9 с использованием

0,1N раствора едкого натра. Избыток азида разрушают добавлением 1N раствора гидроокиси аммония (0,12 мл) и перемешиванием в течение часа. Продукт реакции выделяют методом гельфильтрации на колонке размерами

1,5-26 см (46 мл) с био-гелем Р-6, уравновешенныМ,.фоофатным буферным физиологическим раствором. Исключенный пик собирают (6,22 мл) и определяют в нем содержание протеина и виндесина методом спектроскопии при

270 и 280 нм. Полученный таким образом коньюгат содержит 3,2 моль виндесина на моль 1дС.

Пример 4. Препарат клеток, выращенных в культуральной среде, переливают в тарелки с микротитрованной культурой, содержащей 10" клеток на стенку ° После укоренения клеток в течение 24 ч отогнутые стенки обрабатывают различными концентрациями коньюгата или контрольным соединением. Через 6 дн. культивирования чис1069628 в молярном соотношении, равном

2,1 моль виндееина. на моль IpG (коньюгат примера 2), и цитостатический эффект измеряют путем подсчета клеток.

Число клеток в расчете на сте*ку через 6 дн. (среднее значение + стандартное отклонение)

4 повторения

Концентрация коньюгированного вещества (виндесин,мкг/мл) %, по отношению к контролю

16,3 4,8 10

13,84 2,5 10

1 2, 6+- 1, 9 . 10

10,8 3,9 10

1,9 0,6 -10

100

0,08

84,6

0,40

77,4

2,0

66,7

11,9

10,0

Составитель А.Орлов

Редактор В.Данко Техред T.Èàòo÷êà Корректор В.Бутяга

Заказ 11509/60 Тираж 414 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.удгород, ул.Проектная, 4 ло клеток, находящихся на стенках, оценивают непосредственным подсчетом с использованием видового анализатора, присоединенного к микроскопу.

Семейство аденокарционных клеток толстой кишки человека обрабатывают виндесином, связанным с моноклональным антикарцинозмбрионным антигеном

Результаты опытов приведены в таблице.