Способ получения целлюлозолитических ферментов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ путем глубинного культивирования продуцента Trichoderma viride 44 на питательной среде, содержащей свекловичный жом, однозамещенный фосфат ка .лия, сульфат магния, сульфат аммония , сульфат хрома и воду, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целлюлаз , в культуральную жидкость на экспоненциальной стадии роста дополнительно вводят сульфат хрома в два приема: сначала на 24-32 ч культивирования в количестве 0,20 ,4 г/л и затем на 72-96 ч в количестве 0,3-0,5 г/л. 8

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPbITHA (21) 3449898/28-13 (22) 04.06 .82 (46) 15.02.84. Бюл. Р б (72) H.T.Øèíêàðåíêî, Н.A.Oñòðèêîâà, A.A.Ñêëàäíåâ, С.A ° Коновалов, Л.И.Голгер и Т.Б.Полосухина (71) Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (53) 577.15(088.8) (56) 1. Михлин Э.Д. и улезло И.В.

Стимулятор роста и целлюлозолитической активности продукта целлюлозы-гриба Trichoderma viride. Прикладная биохимия и микробиология..

Т.5, вып.б, с.673-677.

2. Авторское свидетельство СССР по заявке Р 3307216/28-13, кл. С 12 N 9/42 (прототип).

„.SU„„! 073282 A (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ путем глубинного культивирования продуцента

Trichoderma viride 44 на питательной среде, содержащей свекловичный жом, однозамещенный фосфат ка.лия, сульфат магния, сульфат аммо- ния, сульфат хрома и воду, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения активности целлюлаз, в культуральную жидкость на зкспоненциальной стадии роста дополнительно вводят сульфат хрома в два приема: сначала на 24-32 ч культивирования в количестве 0,20,4 г/л и затем на 72-96 ч в коли-. честве 0,3-0,5 г/л.

1073282 активность целлюлазы составила

8 ед.мл.

Однако в данном способе не учитываются оптимальные концентрации активатора на разных стадиях культивирования; актинация роста и развития Trichoderma viride 44 осуществляется недостаточно; кроме того низка ферментативная активно:ть.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности являются среда и способ получения целлюлоэолитических ферментов путем глу- 35 бинного культивирования продуцента

Trichoderma viride 44 на среде, содержащей свекловичный жом, одноэа- мещенный фосфат калия, сернокислый магний, сульфат аммония, сульфат хро-4() ма и лизаты дрожжей (21.

Культивирование ведут в течение

144 ч, активность ферментов

l0,4-11,2 ед/мл.

Недостатками известного способа являются низкая активность фермента и большая продолжительность культивирования.

Целью изобретения является повышение активности целлюлаз.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения целлюлоэолитических ферментов путем глубинного культивирования продуцента — Trichoderma viride 44 на питательной среде, содержащей свекловичный жом, однозамещенный фосфат калия, сульфат магния, сульфат аммония, сульфат хрома и воду, в культуральную жидкость на зкспоненциальной стадии роста дополни- 60 тельно вводят сульфат хрома в дна приема; сначала на 24-32 ч. культивирования в количестве 0,2-0,4 г/л и затем на 72-96 ч,в количестве

0,3-0,5 г/л. 65

Изобретение относится к фермент ной подотрасли микробиологической промышленности и может быть использовано для получения целлюлазы методом глубинного культивирования микроскопических грибов на жидких питательных средах.

Известен способ получения цел- . люлозолитических ферментов путем глубинного культивирования продуцента - Trichoderma viride 44, заключающийся в применении н качестве стимулятора роста и целлюлозолитической активности продуцента целлюлаэы экстрактов из биомассы, образованных при термофильном мета- . новом брожении мелассо-зерновой, ацетонабутиловой барды, которые содержат вещества, обладающие способностью ускорять рост и увеличивать накопление мицелия и повышать С1 20 и С> гриба Trichoderma viride f l).

Сущность способа заключается н следующем.

Готовят питательную среду, содержащую, вес.%:

Свекловичный жом 1,5-8,0

Дрожжи кормовые 0,3-1,0

Однозамещенный фосфорнокислый калий 0,2-0,4

Аммоний сернокислый 0,2-0,5

Магний сернокислый 0,02-0,05

Сульфат хрома 0,02-0,04

Вода Остальное

Питательную среду. готовят путем последовательной загрузки всех компонентов при постоянном перемешивании,рН среды доводят ортофосфорной кислотой до 4,6,вводят дополнительно. до стерилизации сульфат хрома в количестве 0,2-0,3-0,4 г/л, стерилиэуют острым паром l ч при 0,8 ата.

Охлажденную до 37 С питательную среду эасеивают посевным материалом

Trichoderma viride 44 и культивируют глубинным способом при постоянной аэрации культуры воздухом из расчета 1 об/об среды, По истечении

24-32 ч роста культуры н ферментер вводят вторично сульфат хрома из расчета 0,2-0,3-0,4 г/л в виде стерильного раствора на стадии активного потребления питательных веществ;

Третий раз сульфат хрома вводят на стадии актинного синтеза целлюлазы на 72-96 ч роста продуцента в количестве 0,3-0,4-0,5 г/л также в виде стерильного раствора.

Пример 1 (контроль). В ферментер объемом 50 л при коэффициенте, заполнения 0,5 загружают питательную среду с оптимальными соотношениями компонентов, мас.%: свекловичный жом 1,5.; дрожжи кормовые 0,3;. (NHg) 2 ЯО+ О, 2, КН РО О, 2, M@SO

0,02.

Все компоненты питательной среды последовательно загружают в ферментер при перемешивании (180 об/мин), аэрировании воздухом из расчета

1 об/об среды, рН среды доводят ортофосфорной. кислотой до 4,6, и всю питательную среду стерилизуют острым паром 1 ч при 0,8 ата. Охлажденную до 37 С питательную среду засенают посевным материалом Trichoderma viride 44. Глубинное культивирование ведут 144 ч. Максимальная ферментативная активность составляет

12 ед./мл (метод Сомоджи-Нельсона).

Пример 2. Подготовку питательной среды производят аналогично примеру 1. Состав питательной среды вводят дополнительно 0,2 г/л или

5 кг сульфата храма до стерилизации. Стерилизацию и засев посевным

1073282

Составитель Е.Воробьева

Редактор Н.ШвЫцкая Техред И.Лсталош Корректор A.Èëüèí

Заказ 272/23 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 материалом проводят аналогично примеру 1.

После 24 ч роста культуры вводят еще 0,2..г/л или 5 кг сульфата хрома в виде стерильного раствора. В третий раз сульфат хрома вводят 5 иа 72 ч роста продуцента из расчета

0,3 г/л или 7,5 кг в виде стерильного раствора. Процесс глубинного культивирования ведут.до максимального синтеза фермента, т.е. до 10

108 ч роста. Ферментативная актив ность целлюлаэы в этом случае составляет 14 ед./мл, (метод тот же).

П р и м Е р 3.. Подготовку пита- 35 .тельной среды производят аналогично примеру 1. В состав питательной среды до стерилизации вводят суль.фат хрома иэ расчета 0,3 г/л или

7,5 кг. Стерилизацию и засев пита- 20 тельной среды производят аналогично примеру 1. На 28 ч роста культуры Trichoderma viride 44 вводят вторично 7,5 кг сульфата хрома в виде стерильного раствора, третий 25 раз сульфат хрома вводят. на 84 ч роста культуры из расчета 0,4 г/л или

10 кг в виде стерильного раствора.

Глубинное культивирование заканчивают на 108 ч роста культуры. Ферментативная активность целлюлазы в этом случае равна 15 ед./мл (метод тот же) .

Пример 4. Подготовку питательной среды производят аналогично примеру 1. В состав питатель» ной среды до стерилизации дополнительно вводят 10 кг сульфата хрбма из расчета 0,4 г/л. Стерилизацию и засев питательной среды .производят

;аналогично примеру 1. На 32 ч роста продуцента вторично вносят 10 кг сульфата хрома иэ расчета 0,4 г/л в виде стерильного раствора. На

96 ч роста продуцента в третий раэ: вносят сульфат хрома в количестве

12,5 кг иэ расчета 0,5 г/л в виде стерильного раствора. Глубинное культивирование продолжают до мак- . симального накопления фермента с активностью 15,5 ед./мл на 1 18 ч роста продуцента.

Таким образом, реализация изобретения позволяет повысить активность целлюлаз.