Способ выделения простагландинсинтетазы

 

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ПРОСТАГЛАНДИНСИНТЕТАЗЫ из везикулярных желез барана путем гомогенизации желез в буферном растворе, отделения ферментсодержащего экстракта, фильтрования от жира и осаждения фермента из фильтрата, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса , осаждение фермента осуп1ествляют с помощью смеси солей - хлористого кальция и хлористого магния в концентрации каждая 5-10 мМ. О) с

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН з(ю С 12 N 9100

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

110 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3498465/28-13 (22) 23.07.82 (46) 15.06.84. Бюл. У 22 (72) Л.A. Якушева, Г.И. Мягкова, О.В. Демина, P.Ï. Евстигнеева, А.Т. Мевх и С.Д. Варфоломеев (71) МГУ им. М.В. Ломоносова и Московский ордена Трудового Красного

Знамени институт тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (53) 577 ° 15(088.8) (56) 1. "Biochim. Biophys. Acta", 1971, v. 231, р. 445.

2. F. Q. Vander Ouderaa et al

Purification and Characterization

of Prostaglandin Endopегоxide Synthetasa from Sheep Vesicular Geande.

"Biochim, Biophys Acta". 1977, ч 487, У 2,,р. 315.

„SU„„.1097672 А (54) (57) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ПРОСТАГЛАНДИНСИНТЕТАЗЫ из везикулярных жепез барана путем гомогенизации желез в буферном растворе, отделения ферментсодержащего экстракта, фильтрования от жира и осаждения фермента из фильтрата, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, осаждение фермента осуществляют с помощью смеси солей — хлористого кальция и хлористого магния в концентрации каждая 5-10 MM.

1097672

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам выделения простагландинсинтетазы — фермента, используемого для промышленного синтеза простагландионов. 5

Известен способ выделения простагландинсинтетазы из везикулярных желез1 барана путем гомогенизации желез в растворе, отделения ферментсодержащего экстракта, фильтрования от жира и осаждения лимонной кислотой при рН 4,8-5,0 с последующим отделением осадка фермента 1 1 2.

Однако полученные таким образом препараты простагландинсинетазы в условиях ферментативного синтеза простагландинов имеют довольно высокую неспецифическую окислительную способность, что приводит к образованию побочных продуктов окисления субстрата и не позволяет получать простагландины с высоким выходом.

Известен способ выделения простагландинсинтетазы из везикулярных желез барана путем гомогенизации желез в буферном растворе, отделении ферментсодержащего экстракта, фильтровании от жира и осаждения фермента из фильтрата высокоскоростным центрифугированием (105000-130000 в тече- З0 ние 60-90 мин) 1 2 ).

Этот способ позволяет получать фермент более высокого качества, выход простагландина Е, до 67Х.

Недостатком способа является не- 35 обходимость использования мощных высокоскоростных центрифуг, что делает способ дорогостоящим и низкопроиэводительным, а следовательно практически не пригодным для синтеза 40 простагландинов в промышленных условиях

Цель изобретения — упрощение процесса.

Указанная цель достигается тем, 45 что согласно способу выделения ростагландинсинтетазы из везикулярных желез барана путем гомогенизации желез в буферном растворе, отделения ферментсодержащего экстракта, филь- 50 трования от жира и осаждения фермента из фильтрата осаждение фермента осуществляют с помощью смеси солей хлористого кальция и хлористого магния в концентрации каждая 5-10 лИ.

Полученный осадок обычно отделяют центрифугированием и суспендируют в буфере, используемом для синтеза простагландинов.

Полученные описываемым способом препараты простагландинсинтетаэы характеризуются высоким содержанием белка, определяемого по Лоури, и удельной оксигеназной активностью, определяемой полярографически по поглощению кислорода в реакционной смеси с использованием в качестве субстрата арахидоновой кислоты.

Пример 1. Исходное сырье (100 r везикулярных желез барана) гомогенизируют в буфере с рН 8 (200 мл 50 мМ трис-НС 1) и центрифугируют при 10000-13000 15 мин. К супернатанту, тщательно фильтрованному череэ 3-4 слоя марли от жира, прибавлящт при 4 С 1 л раствора хлористого кальция (8 мИ) и хлористого магния (5 мМ). Смесь перемешивают о

30 мин при 4 С. Выпадающий за это время осадок микросом отделяют центрифугированием при 10000- 13000©

Осадок суспендируют 680 мл трис-НС1 буфера. Содержание белка (по Лоури)

2 г.

Полученный препарат имеет удельную активность 0,24 мкмоль арахидоновой кислоты/мг белка в мин, т.е.

его удельная активность сравнима с препаратами микросом, получаемыми способом дифференциального центрифугирования, а выход по белку в 1,52 раза выше.

Сравнительная характеристика препаратов простагландинсинтетазы, полученных известными и предлагаемым способами из везикулярных желез барана (в расчете на 100 г исходных желез), представлены в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ вляется более простым, более технологичным и обеспечивает получение целевого продукта с высокой активностью.

1097672

Удельная активность, мкмоль арахидоновой к-тыlмг белка в мин

Способ получения простагландинсинтетазы

Общая активность

Белок в препарате, г

480

0,24

2,0

Осаждение солями

Дифференциальное центрифугирование

0,3-0,4

370-500

1-1, 5

330

0,74

0,45

Прототип

2,3

0,017

Цитратный

Заказ 4152/24 Тираж 522

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель О. Скородумова

Редактор Л. Веселовская Техред И.Асталош Корректор A. Тяско