Способ приготовления тест-культуры для микробиологического испытания стерилизующей способности фильтров

 

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ТЕСТКУЛЬТУРЫ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИСПЫТАНИЯ СТЕРИЛИЗУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ФИЛЬТРОВ, предусматривающий выращивание бактерий Pseudomonasdiminuta АТСС 19146 на агаризованной питательной среде, приготовление посевного материала, инокуляцию жидкой питательной среды и инкубацию до начала стационарной фазы развития культуры в условиях аэрации и перемешивания, отличающийся тем, что, ,с целью улучшения качества тест-культуры и упрощения способа ее получения , в качестве агаризованной питательной среды используют мясопептонный агар, приготовление посевного материала осуществляют путем смывания клеток 1,5-2,0 объемами физиологического раствора по отношению к объему агаризованной среды с последующей фильтрацией через стерильный бз мажный фильтр, инокуляцию посевным материалом производят в объемном соотношении к питательной среде 6-10:90-94, при количестве вносимых клеток на 100 мл, равном -10 , а в качестве жидкой питательной среды используют солевой раствор следующего . состава, мас.%: Двузамещенньй фосфорносл кислый натрий0,5-0,7 Однозамещенный фосфорно0 ,2-0,4 кисльш -калий 0,01-0,03 Сернокислый магний 0,04-0,06 Хлористый натрий о , 09-0,11 Хлористый аммоний 0д Дистиллированная со со Остальное вода 00 00 2. Способ по п,. 1, отличающ и и с я тем, что пох:ле смывания физиологическим раствором инокулят .предварительно разводят мясопептонным бульоном до содержания клеток в 1 мл 10 -10 , а инокуляцию проводят в количестве 0,6-1% к объёму питательной среды.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (() 4 С 12 N 1/00, 1/20 (С 12 R 1: 38, С 12 Ы 1/00) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ тельной среды используют мясопептонный агар, приготовление посевного материала осуществляют путем смывания клеток 1,5-2,0 объемами физиологического раствора по отношению к объему агаризованной среды с последующей фильтрацией через стерильный бумажный фильтр, инокуляцию посевным материалом производят в объемном соотношении к питательной среде 6-10:90-94, при количестве вносимых клеток на

100 мл, равном 6 ° 10 -10, а в качестве жидкой питательной среды используют солевой раствор следующего состава, мас.%:

Двузамещенный фосфорнок и слый н атрий

0 5-0,7

0,04-0,06

0,09-0,11

Хлористый натрий

Хлористый аммоний

Дистиллированная вода

Остальное

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю шийся тем, что после смывания физиологическим раствором инокулят .предварительно разводят мясопептонным бульоном до содержания клеток в 1 мл 10 — 10, а инокуляцию про<3 водят в количестве 0,6-1% к объему питательной среды.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬП ИЙ (21) 3589732/28-13 (22) 10.05.83 (46) 30.07.85. Бюл. Р 28 (72) Г.Я. Кивман, В.П. Афанасьева, Н.С. Снегирева и Е.С. Яворская (71) Филиал по разработке готовых лекарственных средств Научно-исследовательского института по биологическим испытаниям хнмических соединений (53) 663. 11 (088. 8) (56) Дубяга В.П. и др. Полимерные мембраны. M., Химия, 1981, с. 50-70.

А.R. Rety and Т.I. Leaty Lifter

Validotion Symposium III. Validation of Bacterially retentive figtersЪу bacterial passage testing. А.R.

"J. Par. Drug. Assoc. 1979, 335, 260-264. (54)(57) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ТЕСТКУЛЬТУРЫ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИСПЫТАНИЯ СТЕРИЛИЗУЮЩЕИ СПОСОБНОСТИ

ФИЛЬТРОВ, предусматривающий выращивание бактерий Pseudomonas diminuta

АТСС 19146 на агаризованной питательной среде, приготовление посевного материала, инокуляцию жидкой питательной среды и инкубацию до начала стационарной фазы развития культуры в условиях аэрации и перемешивания, отличающийся тем, что,,с целью улучшения качества тест-культуры и упрощения способа ее получения, в качестве агаризованной питаОднозамещенный фосфорнокислый калий 0,2-0,4

Сернокислый магний О, 01-0, 03

988

1,4-1,6

0,01-0,03 0,04-0,06 З0

0,09-0,11

Сернокислый магний

Хлористый натрий .

Хлористый аммоний

1 1169

Изобретение относится к микробиологии и касается получения бактериальной культуры, пригодной для микробиологического испытания стерилизующей способности фильтров. 5

Целью изобретения является улучшение качества тест-культуры и упрощение способа ее получения.

Способ осуществляют следующим образом. l0 Тест-культуру бактерий Pseudomonas diminuta АТСС 15146 первоначально выращивают в косяках на мясопептонном агаре в течение 24 ч при

30 С. Выросшую культуру заливают а

1,5-2,0 объемами физиологического раствора (О, 9 изотонический раствор хлорида натрия) по отношению к агаризованной среде и взбалтывают.

Получают взвесь клеток — инокулят, 20 для засева жидкой питательной среды следующего состава, мас. :

Двузамещенный фосфорнокислый натрия

Однозамещенный фосфорнокислый калий 0,2 — 0,4

Вода дистиллированная Остальное

В случае, если суспензия содержит

10 — 10 клеток в 1 мл, для приго- 35 ю товления инкубационной смеси используют 6-10 об. инокулята и 90-94 об.X солевого раствора. Если инокулят содержит большее количество клеток, то его разводят мясопептонным бульо- <0 ном до содержания 10 -10 клеток

I3 в 1 мл и для приготовления инкубационной смеси используют 0,6-.1,0 об. разведенного инокулята и 99-99,4 об. солевого раствора. 15

Культуру в инкубационной смеси выращивают в условиях аэрации и перемешивания на качалках (130-200 качаний в 1 мин) при 30 С в течение времени, необходимого для достижения начала 50 стационарной фазы развития тесткультуры. Это время определяется количеством инокулята и интенсивностью качания. Инкубация в указанных условиях гарантирует исключение 55 образования агломератов микробных .клеток и получение популяции клеток густ-культуры с размером, колеблющимся в узком диапазоне (0,2-0,4 мкм по диаметру и 0,4-0,8 мкм по длине), причем максимум приходится на клетки размером (0,2-0,3)x(0, 4-0,6) мкм.

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Тест-культурой из бактерий Pseudomonas diminuta

АТСС 19146, хранящейся при 4 С в полужидком (0,2 ) мясопептонном агаре, засевают 4 пробирки, содержащие по

5 мл скошенного твердого (2 ) мясопептонного агара (микробиологическая петля на 1 пробирку). Засеянные про- . бирки выдерживают в термостате при

30 С в течение 24 ч. Пробирки с вью росшей культурой заливают стерильным

0,9 изотоническим раствором хлорида натрия (10 мл раствора на 1 пробирку), содержимое пробирок тщательно взбалтывают. Полученную взвесь клеток фильтруют в асептических условиях через стерильный фильтр из фильтровальной бумаги (фильтр обеззоленный, красная лента). Профильтрованную взвесь клеток — инокулят, содержащую

10 клеток в 1 мл, в количестве !

10 об.X добавляют в 3 колбы с 90 мл солевой среды. Засеянные колбы инкубируют в условиях качания (130 кача" о ний в 1 мин) при 30 С. Через каждые

3 ч отбирают пробы, в которых определяют число. клеток, а также распределение их в популяции по размерам. Строят кривую роста тест-культуры и график распределения клеток по размерам. Из кривой роста определяют время достижения начала стационарной фазы развития тест-культуры (в условиях эксперимента это время было равно 9 ч), а из графика — диапазон колебаний размеров клеток в популяции (в условиях эксперимента в 9-часовой популяции это колебание составляло

0,2-0,4 мкм по диаметру и 0,4 — 0,8мкм по длине) . Полученная после 9 ч инкубации суспензия содержала 10 кле!

5 ток тест-культуры в 1 мл.

Пример ы 2 и 3. Осуществляют аналогично примеру 1 за тем исключением, что для засева солевой среды используют, соответственно, 6 и 8 об. инокулята. Полученные в результате клетки тест-культуры имеют размеры, находящиеся в интервал (О, 2-0, 4) мкм по диаметру (О, 40,8) мкм по длине.

Пример 4. Осуществляют аналогично примеру 1, однако для засев

1169988

Пример 7. Микробиологическое испытание стерилизующей способности фильтров..

Составитель 3. Фалунина

Редактор M. Недолуженко Техред А,Бабинец Корректор М. Максимишинец

Заказ 4673/23 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 солевой среды используют 5 об.7. инокулята. При этом наблюдали слабый рост культуры.

Пример 5 (сравнительный).

Осуществляют аналогично примеру 1, но для засева солевой среды используют 11 об.7 инокулята. Полученные в результате клетки тест-культуры имели размеры, колеблющиеся в пределах 0,3-,0,4 мкм по диаметру 0,5 — 10

0,7 мкм по длине.

Пример 6. Инокулят, полученный по примеру 1 и содержащий 10 клеток в 1 мл, разводят в мясопептонном бульоне до содержания 10 кле- 1g

Я ток в 1 мл. Этим разведенным инокулятом в количестве 1 об.7. засевают

3 колбы с 99 мл солевой среды. Далее все операции те же, что и в примере 1. Через 9 ч инкубации суспен- 2п зия содержала 10 клеток в 1 мл и состояла из клеток, размеры которых колебались в пределах 0,2-0,4 мкм по диаметру и 0,4-0,6 мкм по длине, а максимум приходился на клетки раз- 2S

-мером (0,2-0,3)х(0,4-0,6) мкм.

По 10 мл взвеси клеток тест-культуры, полученной по примеру 1, помещают на 5 фильтров фирмы "Миллипор" типа GSWP, используемых для стерилизации фильтрованием растворов, в том числе лекарственных средств, 5 фильтров той же фирмы типа PHWP, используемых для стерилизации фильтрованием вязких сред и имеющих несколько больший размер пор, чем

GSWP, и на 5 фильтров этой же фирмы типа HAWP, не являющихся стерилизующими. .Создают вакууметрическое давление (66 2) кПа (0,67 кгс/см ) и проводят фильтрование. В полученных фильтратах определяют присутствие клеток тест-культуры. Фильтраты после стерилизующих фильтров типа

GSWP были стерильными, а после стерилизующих фильтров типа PHWP в

3 случаях содержали клетки тесткультуры. Фильтраты после нестерилизующих фильтров типа HAWP содержали клетки тест-культуры во всех 5 случаях.

Пример 8. Осуществляют аналогично примеру 7, но для испытания используют тест-культуру, полученную по примеру 6. Результаты аналогичны указанным в примере 7.