Способ определения биогенных моноаминов

 

Изобретение касается физикохимических методов анализа и может быть использовано в медицине и фармакологии . Цель изобретения --повышение чувствительности способа. Биоспецифический катализатор с моноаминоксидазной активностью помещают на мембрану ячейки 8, которую размещают в сосуде 1 для измерений, до- . бавляют в сосуд боратный буфер и про

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (!1) (594 G 01 N 33 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3784944/28-14 (22) 25.08.84 (46) 07.01.87. Бюл Р 1 (71) Латвийский государственный университет им.П,Стучки и Институт эволюционной физиологии и биохимии им,Сеченова (72) Б.А.Гринберг, Е.Б,Никольская,,А,П.Бресткин, О.В.Ягодина, А.А.Прикулис, Д.Ю.Балцере и А.К,Аренс (53) 612,015 (088, 8) (56) Биохимия, 1982, Ф 2, с,290-295. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИО ГЕННЫХ

МОНОАИИНОВ (57) Изобретение касается физикохимических методов анализа и может быть использовано в медицине и фармакологии, Цель изобретения †.повышение чувствительности способа. Биоспецифический катализатор с моноамкноксидазной активностью помещают на мембрану ячейки 8, которую размещают в сосуде 1 для измерений, до- . бавляют в сосуд боратный буфер и про1282006 бу крови. Сосуд 1 закрывают, помещают капилляр 6 вводят в смесь едкий натв термостат, вкпючают магнитную ме- рий. После установления постоянного шапку и пропускают кислород. Затем значения потенциала на электроде запоток кислорода перекрывают и в за- писывают показания потенциометра. По крытом сосуде производя г перемешива- градуированной прямой находят значение. После инкубации я !ейку 8 выни- ние концентрации моноаминов. В примают. В сосуд добавля1от хлористый сутствии ацеклидина полученное знакалий, Сосуд охлаждают, закрывают чение соответствует сумме концентрапробкой 3 со стеклянным электродом 4. ций тирамина и бензиламина. 2 з.п.

Снова пропускают кислород и через ф-лы, 3 ил..и(гии, !

Сн(?Соб позволяет определить суммар»ое количество биогекных моноамино?з (cepoтоника, бензи!!амина, тирамина., триптамип», »орадре»алика и другl1:(мО»опмннон, к!?Оме аг(ре»али!1а) а также селективно определять серото»ин и бекзиламн» в смеси мокоаминов, 15 ! (е !ь изобрете»ия — »овышение чувст?эитель»ости (!!Особа, селективкое Опр(де?1ен1!е серотоника и бе»зиламина за счет использ(?На»»я биоспецифич(. ск(? О I(8 тали" aTop;l (. м(! ЯОлчинО 2 ксидаз»ой активностью и селективных и»гиб!, оров левак!11111!ро!1(?»ия мо»ОСпособ осуществляется следующим образом-.

0,5 г биоспецифического катализатора с мокоаминоксидазной (MAO) активностью помещают на мембрану ячейки 8 и промывают 0,01 M раствором боратного буфера (pH 7,6) и бидистилр лированкой водой. Ячейку 8 помещают в сосуц 1 для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда 2мл

0,1 М боратного буфера рН 7,6, 1 мл воды или раствор обратимого ингиби25 тора и 1 мл исследуемого раствора биогеккых моноаминов: серотонина, тирамика, бекзиламина или пробу кро-, ви. Измерительный сосуд 1 закрывают, о поме!дают в термостат при 35-45 С, З0 вкл!оча?от магнитную мешалку и 10 мин пропускают О без СО . Далее поток

0 перекрывают и герметически закры2 тый сосуд 1 выдерживают не менее

50 мин при 35-45 С и интенсивном перемешивакии. После инкубации ячейку 8 с IAO вынимают, в сосуд 1 добавляют

1,4 r КС1, охлаждают сосуд. 1 до 25 С, закрывают пробкой 3 со стеклянным рП-элекl ðîäîì 4, на поверхность кото-! и рого помещена капля 0,27-ного раствора тритона Х-305 в бидистиллироИз обpP T(.»1!P О:1 »ОсиTсЯ к физ HKОхимическим методам анализа, в частности к поте!1цио!!етрическому определению микроколичеств мокоаминов в биологиче(KH?(средах, H может быть использовано в медицине и фармакоаминов, П» фиг. 1-3 показано устройство

ДЛЯ ОП1?ОДе!1е»1!Я м(>»ОHìèll(?B .

УсTpoH(E D(? JIJISI Определения коли<1 p c ? в а i>I(? 11(? I ill! » (? 1? в б г! Ол О I и ч е с к их среда х с 0 i! (Ij??EEE (. T(lк. .IЯ»ный сосуд 1 со шпифом ((?бъе! Сосуда 17,7 мл) .

Сосуд герметично закрывают стеклянной трубкой со шлифом 2, Б трубку вставляется резиновая пробка 3 со стеклянным рН-э?Лектродом. 4, электролитическим мостиком 5 1! игла!!и-капиллярами 6, Конец электролитическо? го мостика 5 выведен на чувствительну".о поверхкость рБ-электрода 4. Для большей 1!адежпост!1, герметичности резиновую пробку 3 заливают герметизиру!ощим слоем парафина. Иглы-капилJlEIpbI 6 использу!от для добавления»еобходимых компонентов в реакционную смесь 7 (обье!!Ом 4 мл) и пропускания кислорода. через газовый зазор. В стеклянный сосуд 1 помещают ячейку 8 с биоспецифическим катализатором с моноаминоксидазной активностью.

Ячейка 8 (фиг.2 и 3) содержит два кольца 9 и 10, прилегающих друг к другу и скрепленных полупроницаемой мембраной. В одном из колец вмонтирован магклтик 11 для магнитной мешалки.

3 12820 ванной воде, снова пропускают О без

СО и затем через капилляр б вводят в реакционную смесь 0,2 мл 1 М NaOH (рН раствора ) 12) для полного высвобождения NI. . После установления

3 постоянного значения потенциала (рН), т.е, через 20 мин, на электроде записывают показания потенциометра (рН-метра). Находят по градуировочной прямой значение концентрации мо- 10 ноаминов, соответствующее значению

Ю потенциала, В присутствии (2,5-.5) 10 М ацеклидина полученное значение соответствует сумме концентраций тирамина и бензиламина при концентрации ацеклидина и метацина (1 8) 10 " М соответствует концентрации бензиламина, Чувствительность способа

2 10 М.

06 4 специфического катализатора с МАОактивностью прибавляют 0,5 мл 0,0 1 М

I<-фосфатного буфера рН 7,6.

Содержание аминов в крови рассчитывают как разность между общим количеством аммиака и фоновым количеством аммиака.

Получают, что общее количество моноаминов в крови человека 0,36 мкг/мл крови.

Пример 2. 0,5 r биоспецифического катализатора с 1АО-активностью помещают между мембранами ячейки 8 и промывают 0,01 М раствором боратного буфера (рН 7,6) и бидистиллированной водой. Ячейку 8 помещают в сосуд 1 для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда 1 мл крови крысы в 0,15 M растворе КС1 (1:1), 1,7 мл К-фосфатного буфера рН 7,6, 0,32 мл 5 10 M раствора серотонина, 0,24 мл 5 10 M б раствора тирамина и 0,24 мл 5 ° 10 М раствора бензиламина, Таким образом, концентрации в реакционной смеси се7 "7 ротонина 4 "10 М, триамина 3 10 М, 7 бензилалына 3-10 М. Общая концентрация моноамипов в реакционной смеси

1 10ьМ, Измерительный сосуд закрывают, помешают в термостат при 45 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают О без СО . Далее поток О перекрывают и герметически закрытый сосуд 1 выдерживают 50 мин при 45 С и интенсивном перемешивании. Далее проводят все операции аналогично примеру 1.

Находят по градуировочной прямой значение концентрации моноаминов

-б

1 10 М, соответствующее значению потенциала. Имеющееся количество моноамипов B разбавленной крови ничтожно и на результат не повлияет. !

Пример 1. 0,5 г биоспецифического катализатора с МАО-активностью помещают между мембранами ячейки 8 и промывают 0,01 М раство-. ром боратного буфера (рН 7,6) и би- 25 дистиллированной водой. Ячейку 8 помещают в сосуд 1 для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда. 3 мл 0,15 М раствора КС1 или

NaC1 и 0,5 мл исследуемой крови че- Зр ловека. Измерительный сосуд закрывают, помещают в термастат при 35 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают О без СО, Далее поток

0z перекрывают II I ерметически закрытый сосуд 1 выдерживают 60 мин при

О

35 С с интенсивным перемешиванием.

После инкубации ячейку 8 с МАО вынимают, в сосуд 1 добавляют 1,4 г КС1, охлаждают сосуд до 25 С, закрывают 40 пробкой 3 со стеклянным рН-электродом 4, на поверхность которого помещена капля 0,3Z-ного раствора тритона Х-305 в бидистиллированной воде, снова пропускают О беэ СОд и затем 45 через капилляр вводят в реакциопную смесь 0,2 мл i М NaOH (рН раствора

712) для полного освобождения NH

После установления постоянного потенциала (рН), т,е. через 20 мин 50 на электроде записывают показания потенциометра (pH-метра), Находят по градуировочной прямой значение концентрации общих л оноаминов, соответствующее значению потенциала. 55

Для контроля содержания аммония в крови (фоновое содержание NH ) проз водят описанный опыт, только в состав реакционной смеси вместо 0,5 г био1I р и м е р 3. 0 5 г биоспецифического катализатора с МАО-активностью помещают между мембранами ячейки 8 и промывают 0,01 М раствором боратного буфера (рН 7,6) и бидистиллированной водой. Ячейку 8 помещают в сосуд 1 для измерений с Iaзовым зазором, добавляют туда 1 мл крови крысы в 0,15 М растворе КС1 (1:1), 1,5 мл К-фосфатного буфера рН 7,6, 0,32 мл 5 10 М раствора серотонина, 0,24 мл 5 10 М раствора триамина, 0,24 мл 5 10 М раствора бензиламина и 0,2 мл 5 10 М раствора

5 12820 ацеклидина (концетрация ацеклидина в реакционной смеси 2,5 10 M).

Измерительный сосуд закрывают, о помещают в термостат при 45 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают О. беэ СО>. Далее поток О перекрывают и герметически закрытый сосуд 1 выдераживают 50 мин при 45 С и интенсивном перемешивании. Далее проводят все операции аналогично при- lO меру 1.

Находят по градуировочной прямой значение концентрации моноаминов (6,05 ° 10 M). В примере 2 получена общая концентрация моноаминов 1 10 N 15 можно найти концентрацию серотонина:

1 10 -6,05 10 =3,95"10 M (в ана7 лизе концетрация серотонина 4 10 М) .

Пример 4.. Определение ведут аналогично примеру 3, однако конеч- 20

-5 ная концентрация ацеклидина 5" iO — 6 и 3,75:10 N. Находят концентрацию

-т серотонина соответственно 4,75 10 и 4,05 10 М.

Пример 5, 0,5 r биоспецифического катализатора с NA0-активностью помещают между мембранами ячейки 8 и промывают 0,0 1 N раствором боратного буфера (pH 7,6) и бидистиллированной водой. Ячейку 8 помещают в сосуд 1 для измерений с газовым зазором, добавляют туда 1 мл крови крысы в 0,15 M растворе КС1 (i:1), 0,9 мл К-фосфатного буфера рН 7,6, 0,32 мл 5 ° 10 M раствора се- 35 ротонина, 0,24 мп 5"10 М раствора триамина, 0,24 мл 5 .10 М раствора

6 бенэиламина и 0 8 мл 5 10 M раство4 ра ацеклидина (концентрация ацеклидина в реакционной смеси 1 10 М) . 40

Измерительный сосуд закрывают, поо мещают в термостат при 45 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают О без СО . Далее поток 0> перекрывают и герметически закрытый сосуд 1 выдерживают 50 мин при 45 С и интен06 6 сивном перемешивании. Далее проводят все операции аналогично примеру 1.

По градуировочной прямой определяют концентрацию моноаминов 2,95

-.г

" 10 М, что соответствует концетрации бензиламина в реакционной смеси.

В примере 3 получена общая концентрация тирамина и бензиламина

6,05" 10 M, можно найти концентрацию тирамина: 6,05- 10 -2,95 -10 =3,1

10 7N.

Пример 6. Определение ведут аналогично примеру 5, но концентрация ацеклидина 2, 10 " и 8-lO " M соответственно. Находят концентрацию бензиламина 2,95: 10 7и 2,80 10 M.

Формула изобретения

1. Способ определения биогенных моноаминов путем их дезаминирования при помощи моноаминоксидазы с последующим потенциометрическим определением образовавшегося аммиака при помощи рН-электрода, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве моноаминоксидаэы используют биоспецифический катализатор с моноаминоксидазной активностью, деэаминирование проводят в течение не менее

50 мин, а определение аммиака ведут с в присутствии насыщенного раствора хлористого калия при рН не менее 12.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью селективного определения серотонина в смеси моноаминов, деэаминирование

-5 проводят в присутствии 2,5 ° 10

-5 .10 М ацеклидина.

3. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью селективного определения бенэиламина в смеси моноаминов, дезаминирование

-4 -4 проводят в присутствии 1 10 -8 10 М метацина или ацеклидина.

1282006

Составитель Н.Гуляева

Техред Л.Сердюкова Корректор С.Черни

Редактор И.Николайчук

Заказ 7259/42

Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4