Способ получения анатоксина @ @

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения биологически активных веществ.Цель изобретения -снижение токсичности целевого продукта за счет модификации метода выделения и детоксикации. Из культуральной жидкости после отделения мицелия осаждают смесь токсинов. Осадок разбавляют буферным раствором. При необходимости полученную смесь дополнительно концентрируют. Затем выделяют экзотоксин, обрабатывают его раствором формальдегида и полученный целевой продукт подвергают ультразвуковой обработке. Вакцинацию проводят триждьт с интервалом 2-8 недель. Через 127 18 месяцев после последней инъекции детям вводят еше раз зту вакцину. СО см

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

12 А5 (191 (21) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР пО ДелАм изоБРеТений и ОткРытий

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ /,;

H flATEHTY (21) 3235495/28-14 (22) 23.01.81 (31) 127825/80 (32) 12.09,80 (33) JP (46) 15.03.87. Бюл,У 10 (71) Такеда Кемикал Индастриз, Лтд. (ТР) (72) Юкио Сиукуда, Хидео Ватанабе и Сигео Мацуяма (JR) (53) 612.017(088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАТОКСИНА

B0RDETELLA PERTUSSIS (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается получения биоло159 4 А 61 К 39/IO, С 12 Р 1/02//

С 12 P 1/02, С 12 R 1:01 гически активных веществ. Цель изобретения — снижение токсичности целевого продукта эа счет модификации метода выделения и детоксикации, Иэ культуральной жидкости после отделения мицелия осаждают смесь токсинов. Осадок разбавляют буферным раствором. При необходимости полученную смесь дополнительно концентрируют. Затем выделяют экзотоксин, обрабатывают его раствором формальдегида и полученный целевой продукт подвергают ультразвуковой обработке. Вакцинацию проводят трижды с интервалом 2-8 недель. Через 1218 месяцев после последней инъекции

И детям вводят еще раз эту вакцину. Я

1297712

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения биологически активных веществ.

Целью изобретения является сниже— ние токсичности целевого продукта 5 за счет модификации метода выделения и детоксикации, Способ иллюстрируется следующими примерами.

П ри ме р .Штамм Тохамафазы

1 Borcletella pertussis засевают в среду Бурде-Генгу, приготовленную иэ картофеля, пептона, хлорида натрия, агара и бычьей крови, и.инкубируют при 35 С в течение двух дней. Затем о 15 отбирают полупрозрачные круглые колонии, определяют активность к К-агглютинирующей сыворотке и отбирают культуру в качестве посевной. Производственную среду получают путем автоклавирования жидкой среды КохеВилера, содержащей: растворимый крахмал 225 г, хлористый натрий

375 г, двузамещенный фосфорнокислый калий 75 г, гексагидрат хлористого магния 750 мл (8 вес/об.% жидкости), хлористый кальций 75 мл {2 вес,/об,7 жидкости), пентагидрат сернокислой меди 112,5 мл {О,1 вес.. /об..% жидкости), глютамат натрия 30 г, нико30 тинамид 4,5 r казаминовая кислота

1800 r, хлоргидрат цистина 4,5 r, трис-буфер 12,5 л. Компоненты среды разбавляют дистиллированной водой до 150 л, устанавливают рН 7,0-7,? 35 и стерилизуют, затем добавляют глу— татион (восстановленная форма) 50 мл (1 вес./об.7 жидкости) и Fe50 7Н О

50 мл (1 вес./об,7. жидкости при

121 С в течение бО мин с последующим 40 о быстрым охлаждением примерно до 40 С. о о

Среду хранят при 37 С, Посевную культуру вносят в питательную среду до конечной концентрации 45

200-300 млн, клеток/мл, тщательно перемешивают, высевают по 0,2 л в бутыли Роукса и помещают посевы в о термостат при 37 С, Максимальное количество клеток получают на 5 — и день.

Культуральные жидкости из бутылей объединяют, центрифугируют и к надосадочной жидкости добавляют

20,2 вес,/об. сульфата аммония. После тщательного перемешивания смесь выдерживает при 4 С. Через 7 дней надосадочную жидкость сливают и осадок собирают и центрифугируют при

8000 об/мин в течение 1О мин. Надocaäo÷Hóþ жидкость отбрасывают, к осацку добавляют 1/10 объема смеси

1М раствора хлористого натрия и

0 05М фосфатного буфера (рН 8,0) и смесь тщательно перемешивают. Смесь о вновь выдерживают при 40 С в течение 7 дней, после чего вновь центрифугируют и собирают надосадочную жидкость (экстракт 1) .

Экстракт 1 содержит фибрин,лейкоцитозпромотирующий фактор (ЛПФ), гистаминиммунизирующий фактор 1,ГИФ) и эндотоксин, микробные клетки отсутствуют. Экстракт 1 подвергают повторной концентрации, добавляют к нему равный объем насыщенного раствора сульфата аммония (рН регулируют аммиаком) и выдерживают смесь при о

4 С в течение 7 дней. Сульфат- аммониевую фракцию центрифугируют при !

0000 об/мин в течение 20 мин, осадок отделяют и добавляют !/300 объема жидкой смеси 1М раствора хлористого натрия и 0,05М фосфатного буфера (рН 8,0), После тщательного перемешивания смесь помещают в диализную трубку с полупроницаемой мембраной для удаления сульфата аммония и диализ проводят против IM раствора хлористого натрия (рН 8,0) . Диализированный концентрат затем центрифугируют при градиенте плотности сахарозы, Предварительно простерилизованный ротор центрифуги емкостью 1700 мл и запаянный агрегат вращают с малой скоростью, с помощью градиентного насоса подают 1300 мл 5-30 вес,/об,X растворов сахарозы, Затем подают

100 мл диализованного концентрата и вводят среду покрытия (0,5М раствор хлористого натрия, рН 8,0), Ротор вращают при К „о„89400 ) в течение

18,5 ч.

После центрифугирования при малой скорости подают 34 вес,/об.7 раствор тростникового сахара и жидкость из ротора собирают фракциями по 50100 мл. Сбор фракций начинают со стороны низкой плотности сахарозы и получают фракции с высокой гемагглютинирующей активностью (не менее

20 ед./мл, предпочтительно не менее

500 ед./мл) и обедненные эндотоксином. Наличие эндотоксина определяют в тесте на кроликах. Каждый образец о фракции выдерживают при 100 С в течение 3 мин и разбавляют до содержания

1297712

20 гемагглютинируюя|их ед./мл фи..иологического раствора. Разбавленную пробу вводят кроликам внутривенно в дозе 1 мл/кг живого веса. Фракции, не вызывающие жара у кроликов в те- 5 чение 3 ч, собирают и объединяют в качестве целевого продукта (экзотоксин1 .

Собранные фракции, содержащие экзотоксин, разбавляют М/250 фосфатным буфером рН 7,0 до содержания белка в пределах 50 мг/мл, Добавляют желатину, Твин-80 и тимерозол до конечной концентрации 0,02 вес./об.X

0,05 об./об.7. и 0,01 вес./об. соот- 15 ветственно. К смеси без добавления какой-либо основной аминокислоты добавляют формалин до концентрации

0,2 об./об. в термостате при 39 С и

1 после тщательного перемешивания 20 смесь дополнительно инкубируют в том же термостате. Через 2 дня добавляют формалин до концентрации

0,3 об./об. и после тщательного перемешивания смесь дополнительно 25 инкубируют при той же температуре, Через 2 дня повторяют добав— ление формалина до концентрации

0,4 об./об. и после перемешивания продолжают инкубирование в течение 30

5 дней, Можно обрабатывать смесь

0,1 об./об.X формалина при инкубировании при 42 С в течение 14 дней, о либо 0,6 об,/об.7 формалина при

35 инкубировании при 32 С в течение о

14 дней.

Полученную су спек зию хл оп ь евидной массы анатоксина диализуют

0,01 об. /об. формалин-физиологическим раствором, идентичным среде покрытия, Диалиэ осуществляют в диализной трубке с мембраной при 12,5кратном отношении объемов внУтренней 45 жидкости и диализирующего раствора при 4 С в течение 2 дней, при этом диализирующий раствор постоянно перемешивают, Через два дня этот раствор заменяют свежим раствором и диализ повторяют. Отдиализированную хлопьевидную суспензию анатоксина подвергают различным испытаниям, применяемым в отношении сырца вакцины коклюша.

Далее суспензию хлопьев анатоксина подвергают ультразвуковой обработке (частота 20-50 кГц, 5 мин} и фильтруют через грубый фильтр—

400 меш, в результате чего получают жидкий анатоксин коклюша.

В качестве контроля ставят опыт обработки жидкости, содержащей экзотоксин, формалином с добавлением

0,05М 1 †лизи и далее обработку проводят по описанной выше методике, Опытную и контрольную жидкости порознь обрабатывают по методу Левина. Каждую жидкость разбавляют

M/250 фосфатным буфером рН 7,0 до содержания белка 20 мкг/мл и меньше, добавляют хлористый алюминий до кон— центрации 0,18 вес./об.7.. Смесь тщательно перемешивают, регулируют рН до 7,0 соляной кислотой или гидроокисью натрия и отделяют осажденную вакцину, I

Проведенные опыты показали следующее: ЛПФ не должен превышать эквивалент 0,5 ЛПЕ (лейкоцитозпромотирующих ед.)/мл; ГИФ не должен превышать эквивалент 0,8 ГСЕ (гистаминсенсибилизирующих ед.) / ri; эффективность защиты мышей приемлема, когда она равна ЯМЕ (заражение через три недели после иммунизации) на 1 мл, Средняя эффективность защиты по

14 последовательным партиям составляет .13,5 ME/ìë, В контроле (с добавлением L -лизина) серия из 23 партий показывает полную приемлемость вакцины только в 237 е

Пример 2. Полученный в примере 1 жидкий анатоксин коклюша, жидкий анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка осаждают в соответствии с примером 1 и получают очищенную поливакцину против коклюша — дифтерии — столбняка, Состав вакцины: анатоксин коклкг. ша — содержание белка около 15 мг/мп, анатоксин дифтерии — примерно

30cCf/мл; анатоксин столбняка — примерно 5xf/мл; алюминия — примерно

0,2 мг/мл; тимерозол 0,01 вес./об.X.

Поливакцина обладает следующими основными свойствами: концентрация водородных ионов 7,0; пирогенность для кроликов (50 †кратн разбавление и внутривенное введение из рас чета 1 мл/кг живого веса) отрицательная; потеря в весе не превышает допустимую норму; активность промоти-. рования лейкоцитоза у мышей не более чем эквивалент 0,5 ЛПЕ/мл; активность гистаминсенсибилизации не более чем эквивалент 0,8 ГСЕ/мл; эффективность

129771 анатоксина коклюша эквивалентна

8 МЕ/мп, анатоксина дифтерии—

45 МЕ/мп, анатоксина столбняка—

30 МЕ/мл.

Вакцинацию проводят по следующей схеме.

Составитель Г. Смирнова

Редактор Л. Веселовская Техред М. Ходанич Корректор Л.Патай

Заказ 799/64

Тираж 596 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная,4

Детям 3-48-месячного возраста подкожно вводят 0,5 мл каждой вакцины трижды с интервалом 2-8 недель. 10

Через 12-18 мес. после последней инъекции подкожно вводят еще 0,5 мл вакцины.

Формула изобретения 15

Способ получения анатоксина BorCetella pertussis путем культивирования бактерий в первой фазе в пита2 6 тельной среде с последующим отделением биомассы, выделением токсина из культуральной жидкости и его детоксикацией, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью снижения токсичности целевого продукта, из культуральной жидкости после отделения мицелия осаждают смесь токсинов, осадок разбавляют буферным раствором с добавлением хлористого натрия, полученный концентрат при необходимости дополнительно концентрируют обработкой сульфатом аммония н диализом, выделяют экзотоксин, обрабатывают его раствором формальдегида в соотношении 1".0,1-0,6 об./об.7. и полученный целевой продукт подвергают ультразвуковой обработке при частоте 10-50 кГц.