Способ определения сократимости кардиомиоцита

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в кардиологии для диагностики состояния миокарда на клеточном уровне сердечно-сосудистых заболеваний и в фармакологии для определения механизмов действия лекарственных веществ. Цель изобретения - пс ыаение точности способа путем определения оценки сократимости кардиомиоцита за счет измерения параметров сокращения при физиологически нормальных условиях . Для его ферментативного выделения, прикладывания стимула и визуальной оценки сокращения после вьщеления кардиомиоцита к одному его концу прикрепляют закрепленный в держателе рычаг, к другому концу - стержень с осесимметричным телом на конце , заводят последнее в цилиндрический канал, а нагрузку на кардиомиоцит задают путем создания потока жидкости в канале, кроме того, прикрепление к кардиомиоциту рычага и стержня производят путем подведения к кардиомиоциту жестко закрепленного в микроманипуляторе рычага с развоенным концом и капелькой биологического клея внутри раздвоения с установкой просвета раздвоения над концом кардиомиоцита и последующим опусканием рычага и подведения через 3-5 мин к кардиомиоциту стержня с заполненньм клеем раздвоением на одном конце с осесимметричным телом на другом и с боковым отводом, закрепленным с возможностью освобождения в зажиме другого манипулятора, с установкой просвета раздвоения над другим торцом кардиомиоцита, с последующим опусканием стержня и его освобождением через 3-5 мин. Кроме того, рычаг и стержень изготовлены скручиванием из тонкой проволоки , 1 ил. i л с 00 vj со 00

СООЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

09) (И) (51)4 G 01 N 3 48

ГОСУДАРС ПЗЕННЬЙ НОМИТЕТ ССС.Р

re ДЕЛАМ ИЭОЮЕтЕНИй И ОТН1 ЦтИй

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABT0PCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3981422/28-14 (22) 2!.11.85 (46) 29.02.88. Бюл. У 8 (71) Институт проблем механики

АН СССР (72) Е. А. Годин, И. P. Иукумов и Е. Ш. Штенгольд (53) 616.015(088.8) (56) Tirri R. Vornanen M., et al.

Acta Physiol. Scand. V. 116, р. 257-263. (54) СПОСОБ ОПРЕИЕЛКНИЯ СОКРАТИМОСТИ. КАРДИОИИОЦИТА (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано в кардиологии для диагностики состояния миокарда на клеточном уровне сердечно-сосудистых заболеваний и в фармакологии для определения механизмов действия лекарственных веществ.

Цель изобретения - повышение точности способа путем определения оценки сократимости кардиомиоцита sa счет измерения параметров сокращения при физиологически нормальных условиях. Дпя его ферментативиого выделения, прикладывания стимула и визуальной оценки сокращения после выделения кардиомиоцкта к одному его концу прикрепляют закрепленный в держателе рычаг, к другому концу - стержень с осесимметричным телом на конце, заводят последнее в цилиндрический канал, а нагрузку на кардномиоцит задают путем создания потока жидкости в канале, кроме того, прикрепление к кардномиоциту рычага и стерж" ня производят путем подведения к кардиомиоциту жестко закрепленного в микроманипуляторе рычага с развоенным концом и капелькой биологического клея внутри раздвоения с установкой просвета раздвоения над одним концом кардиомиоцита и последующим опусканием рычага и подведения через 3-5 мин ккардиомиоциту стержня с заполненным клеем раздвоением на одном конце с осесимметричным телом на другом и с боковым отводом, закрепленным с возможностью освобожде» ния в зажиме другого манипулятора, с установкой просвета раздвоения над другим торцом кардиомиоцита, с последующим опусканием стержня и его освобождением через 3-5 мин.

Кроме того, рычаг и стержень изготовлены скручиванием нз тонкой проволоки. 1 нл.

1 577738

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики с остояния миокарда на клеточном уровне, и может быть использовано в кардиологии для диагностики сердечнососудистых заболеваний, в физиологии для исследования механизмов регуляции сократимости миокарда и в фармакологии для определения механизмов действия биологически активных веГ ществ.

Цель изобретения - повышение точ,ности способа за счет воэможности исследования в физиологических усло- 15 виях.

Способ определения сократимости кардиомиоцита осуществляют следующим образом, Каплю суспензии ферментативно вы- 20 деленных кардиомиоцитов помещают в прозрачную перфузионную камеру 1 (фиг. 1), размещенную на предметном столике микроскопа. Выбирают неповрежденный кардиомиоцит, подводят к 25 одному его торцу закрепленный в микроманипуляторе 2 стержень 3 с раздвоением на конце и с капелькой биологического клея в просвете раздвоения, Раздвоение устанавливают над 30 торцом кардиомиоцита 4 и опускают стержень 3 с помощью микроманипулятора 2 так, чтобы клей в просвете раздвоения стержня 3 охватил торец кардиомиоцита 4. Через 3-5 мин, необходимых для надежной полимеризации клея, к другому торцу кардиомиоцита подводят второй стержень 5 с раздвоением на конце и с капелькой биологического клея в просвете раздвое- 40 ния. Стержни 3 и 5 могут быть изготовлены путем скручивания из тонкой проволоки диаметром не более

10 мкм. На конце стержня 5 имеется шарик 6, который проще всего изгото- 45 вить путем нанесения на конец стержня капельки клея. Диаметр шарика 6 составляет 5-10 диаметров стержня

5, а длина стержня 5 — 10-15 диаметров шарика 6. Стержень 5 .зажат в микрозажиме 7, закрепленном во втором микроманипуляторе 8. Раздвоение устанавливают над вторым торцом кардиомиоцита 4 и опускают стержень 5 c помощью,микроманипулятора 8 так, чтобы клей охватил торец кардиомиоцита 4. Через 5 мин после полимеризации клея освобождают микроэажим 7 и с помощью микроманипулятора 2 перемещают кардиомиоцит 4 со стержнями

3 и 5 влево таким образом, чтобы шарик б зашел в цилиндрический канал 9. Диаметр цилиндрического канала 9 составляет i 1-1,5 диаметра шарика 6. Затем по цилиндрическому ка.налу создают поток жидкости, обеспечивая усилие на кардиомиоцит. Чрезмерное растяжение кардиомиоцита предотвращается упором бокового отвода стержня 5 в стенку цилиндрического канала 9. Затем через платиновые электроды 10 и 11 производят электростимуляцию кардиомиоцита 4 импульсами длительностью 10-15 мс напряжением 30-50 В и частотой 0,1-0,6 Гц.

Процесс сокращения кардиомиоцита 4 регистрируют на кинопленку путем съемки через микроскоп.

Пример 1. Определение скоростной компоненты сократимости кардиомиоцита крысы.

Брали крысу линии Вистар весом

280 г, производили ее декапитацию, вскрывали грудную клетку и отсекали сердце на уровне дуги аорты и предсердий. Получение кардиомиоцитов производили по стандартной методике

Айзенберга. Проводили ретроградную перфузию изолированного сердца по методике Лангендорфа под давлением

80 мм рт.ст. бескальциевым раствором Тироде в течение 15 мин, подключив сердце к специальной перфузионной системе. В течение 15 мин пер+ фузировали сердце при том же давлении стандартным раствором Тироде с добавлением 0,1 коллагеназы. Сердце отсоединяли от перфузионной системы, рассекали на куски размером

2-4 мм, которые помещали в камеру с мешалкой и с нормальным раствором

Жроде плюс 0,1Х коллагеназы на

15 мин, затем сливали раствор с поврежденными при рассечении сердца кардиомиоцитами и наливали свежий. Через 30 мин полученный раствор сливали и центрифугировали при 10 g в течение 10 мин. Раствор сливали, а в пробирку с кардиомиоцитами наливали нормальный раствор Тираде без коллагеназы.

Капшо суспензии кардиомиоцитов помещали в специальную прозрачную перфузйонную камеру, размещенную на предметном столике микроскопа фирмы

"Карл Цейс". Выбирали неповрежденный кардиомиоцит (кардиомиоцит считался

1377738

20 неповрежденным, если отсутствовали

его спонтанные сокращения и нарушения формы) длиной 75 мкм и шириной

18 мкм. Подводили к торцу кардиомиоцита жестко закрепленный в микроманипуляторе рычаг с раздвоенным концом, изготовленный скручиванием из медной проволоки диаметром 10 мкм с капелькой биологического цианакрилатного сосудистого клея внутри раздвоения. Раздвоение устанавливали над торцом кардиомиоцита и опускали рычаг с помощью микроманипулятора так, чтобы клей охватывал кардиомиоцит. Через 5 мин клей полимеризовался, после чего к другому торцу кардиомиоцита подводили стержень с раздвоением на конце, в котором помещали капельку биологического клея..

Стержень изготавливали из медной про-. волоки диаметром 10 мкм путем скручивания таким образом, чтобы образовать боковой отвод на расстоянии 200 мкм от разветвления длиной 100 мкм. За отводом стержень имел длину 1200 ìêì.

На конце стержня имелся шарик диаметром 75 мкм, полученный путем нанесения капельки эпоксидного клея. Боковой отвод размещали в зажиме, установленном на микроманипуляторе. Раздвоение устанавливали над свободным концом кардиомиоцита и опускали стержень так, что клей охватывал торец кардиомиоцита. Через 5 мин после затвердевания клея подводили сбоку цилиндрический канал внутренним днаметром 100 мкм так, чтобы от торца канала до бокового отвода было расстояние 200 мкм. Затем разжимали зажим, освобождая боковой отвод, и удаляли зажим из поля зрения микроскопа с помощью микроманипулятора. К цилиндрическому каналу подавали разрежение нужной величины. Шарик стержня предварительно был откалиброван таким образом, что было известно, какое усилие на кардиомиоцит создается при создании заданного разрежения. Калибровка шарика проводилась с помощью торсионных весов.

Устанавливали разрежение, достаточное для того, чтобы боковой отвод прикоснулся к торцу цилиндрического канала. Оно равнялось 4,2 мм рт.ст.

Затем подавали через платиновые электроды, расположенные на расстоянии 50 мкм от кардиомиоцита, электрические импульсы длительностью 15 нс

55 напряжением 36 В и частотой 0 5 Гц.

Одновременно цилиндрический канал перекрывали ниже шарика по потоку так, что усилие, приложенное к кардиомиоциту, становилось равным нулю.

Происходило сокращение кардиомиоцита, которое регистрировалось на киноплен- ку- камерой "Красногорск". Максимальная скорость сокращения кардиомиоцита равнялась 2,1 l/c (180 мкм/с), что свидетельствует о хорошей ско- ростной компоненте сократимости миокарда (максимальная скорость сокращения папи ьчярной мышцы крысы в норо ме при 22 С равняется 1,7 + 0,2 l/c).

Пример 2. Определение силовой компоненты сократимости кардиомиоцита крысы.

Брали крысу линии Вистар весом

260 r. Ферментативное выделение кар

\ диомиацита производили аналогично йримеру 1. Был выбран кардиомиоцит длиной 67 мкм и шириной .16 мкм. Прикрепление кардиомиоцита производили аналогично примеру 1.

Устанавливали разрежение

3,4 мм рт.ст. до касания боковым отводом торца цилиндрического канала, прикладывали электрические импульсы длительностью 10 мс, напряжением 42 В и частотой 0,5 Гц.и наблюдали сокращения.

Затем устанавливали заведомо большое разрежение 120 мм рт.ст. так, что клетка не могла сократиться. После этого постепенно уменьшали разрежение до появлении первых признаков перемещения мышцы, которое наблюдалось при разрежении

56 мм рт.ст. Это соответствовало усилию 0,047 мг и напряжению

0,23 г/мм, что соответствует о хорошей силовой компоненте сократимости миокарда. (Напряжение, развиваемое папиллярной мышцей крысы в норме, составляет 0,1-0,15 г/мм )..

H p и м е р 3. Определение силовой компоненты сократимости кардиомиоцита крысы после ишемического повреждения.

Брали крысу весом 250 г.ферментативное выделение и прикрепление кардиомиоцита производили аналогично примеру 1, однако после перфузии бескальциевым раствором производили остановку перфузии на 10 мин для созсоэдания ишемии. Был выбран кардио-. миоцит размером 72х18 мкм.Измеряли

1377738 максимальное изометрическое .напряжение аналогично примеру 2, которое оказалось равным 0,019 мг, что соответствовало напряжению 0,08 г/мм

Это свидетельствует о том, что ишемическое повреждение существенно снизило сократительную способность кардиомиоцита.

Пример 4. Определение дис- 10 персии сократительных свойств кардиомиоцитов крысы.

- К крысы линии Вистар весом 270 r в соответствии с примером 1 получали кардиомиоциты. Измерения максимального изометрического усилия кардиомиоцитов проводили s соответствии с примером 2, Было определено, что напряжение, развиваемое кардиомиоцитами крысы, равно 0,18 + 0,01 г/мм . 20

Это говорит о малом разбросе сократительных свойств кардиомиоцитов крысы в норме.

Пример 5. Определение влияния биологически активных веществ 25 на сократимость сердечной мышцы крысы.

У крысы весом 2бО г был получен . кардиомиоцит длиной 76 мкм и шириной

20 мкм в соответствии с примером 1.

Прикрепление кардиомиоцита и измерение максимального изометрического усилия производили аналогично примеру 2. Измеренное усилие равнялось

0,038 мг, Затем.в раствор добавляли раствор дигоксина иэ расчета 5 х х 10" г/л, после чего вновь измеряли максимальное изометрическое уси лие, которое оказалось равным

0,051 мг, т.е. на 37 больше. Это говорит о существенном положительном изотропном влиянии дигоксина на сократительную активность кардиомиоцита крысы.

Дисперсии измеряемых характеристик45 уменьшаются по сравнению с прототипом. Если.при работе по известному способу среднеквадратичный разброс максимальной скорости сокращения больше 20, то при использовании предлагаемого способа этот разброс не превышает 5% Повышение точности достигается также за счет того, что в предлагаемом способе кардиомиоцит сокращается в физиологических условиях, под нагрузкой, составляющей 25-30 . от максимального изометрического усилия, в то время как нагрузка на кардиомиоцит в известном способе равна нулю.

Формула иэ обретения

Способ определения сократимости кардиомиоцита путем его ферментативного выделения, закрепления в камере, заполненной буферным раствором, электрической стимуляции с последующей регистрацией сокращения, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет воэможности исследования в физиологических условиях, при закреп» ленни кардиомиоцита к одному его торцу подводят стержень с раздвоением на конце и каплей биологического клея в просвете раздвоения, выдерживают в течение 3-5 мин, к другому торцу кардиомиоцита подводят фиксированный в зажиме стержень с раздвоением на одном конце и каплей биологического клея в просвете раздвоения и шариком на другом конце, вновь вы- держивают в течение 3-5 мин, освобождают второй стержень, перемещая первый стержень, вводят шарик в ци"линдрический канал, затем дополнительно создают нагрузку на кардиомиоцит потоком раствора, пропускаемого в камере через цилиндрический канал, при этом диаметр шарика составляет

5-10 диаметров второго стержня; диаметр цилиндрического канала - 1,11,5 диаметра шарика, а длина второго стержня - 10-15 диаметров шарика.

1377738

Составитель Н. Гуляева

Редактор Э, Слиган Техред Jf.олийнык Корректор А. Обручар

Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

ll3035, Москва, Ж 35, Раутская наб., д. 4/5

Заказ 865/40

Производственно-полиграфическое предприятие,- r . Ужгород, ул. Проектная, 4