Штамм @ @ м 35-продуцент @ -триптофана на этаноле
.Шта,мм Pseudomonas species М35 - (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов Института ВНИИГенетика, коллекционный номер ЦМПМ В-3038) - продуцент L-триптофана на этаноле.
СОКИ СОВЕТСКИХ
ММ ИЛИ
РЕСПУБЛИК
09) 09 (51) 4 С 12 P 13/22
ПОСУДЯРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ OCCP
flO ЯДАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTN
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
k AB TOP CI4ONIV CWNETElkC TRV
kjtfa Ep, (21) 3762427/28-13 ((22) 06.07.84 (46) 23.01.86.Áþë. Ф 3 (71) Белорусский ордена Трудового
Красного Знамени государственный .универсйтет им.В.И.Ленина (72) Н.П.Иаксимова, И.Н.Олехнович, Р,А.Æåëäàêîâà и Ю.К.Фомичев (53) 668.394(088.8) (56) Патент Японии В 55-46718> кл. С 12 P 13/22, опублик. 1980.
Патент США Ô 4271267, кл. С 12 P 13/22, опублик. 1981. (54) HITAMM PSEUDOMONAS SPECIES M 35ПРОДУЦЕНТ L-,TÐÉÏÒÎÔAHA НА ЭТАНОЛЕ (57).штамм Pseudomonas species И35— (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов Института
"ВНИИГенетика", коллекционный номер
ЦМПМ В-3038) - продуцент Ь-триптофана на этаноле. 1 2063
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма, продуцирующего L-триптофан.
Цель изобретения — получение штамма-продуцента Ь-триптофана, обеспечивающего увеличение выхода целевого продукта при использовании более простой по составу минеральной среды, содержащей этанол в качестве источ- 10 ника углерода и энергии.
Предлагаемый штамм Pseudomonas
species М35 — продуцент L-триптофана находится на хранении в Центральном музее промышленных микроорганизмов 15
Института "ВНИИГенетика" лод регистрационным номером В-3038.
Штамм Pseudomonas species M35 получают как мутант в результате
4-ступенчатой селекции на продуктив- 20 ность L-триптофана с использованием ! в качестве мутагена N-метил-N -нитро-N-нитрозогуанидина, а в качестве селектирующего фактора — структурный аналог L-триптофана — 5-метил-DL-триптофан. Исходным для получения мутанта служит штамм дикого типа
Pseudomonas species, выделенный из сточных вод Минского завода медпрепаратов. 30
На каждом этапе селекции клетки штамма в логарифмической фазе роста
t обрабатывают N-метил-N -нитро-N-нитрозогуанидином (100 мкг/мл в течение 30 мин при 28 С в цитратном буфере, рН 5,5) и высевают на агаризованную среду следующего состава,Х; Ма НРО (безводный) — 0,6; КН Р04 0,3;
NaC1 0,05; ИН4С1 0,1; СаС1 0,0015;
MgSO4 7Hz0 0,2; фруктоза 0,2, агар 40
1,5, рН 7,0. 5-Метил-DL-триптофан растворяют в спирте и добавляют в готовую среду перед употреблением, до конечной концентрации 100, 500, 1000 .и 10000 мкг/мл соответственно 45 при каждом последующем этапе селекции. Бактерии культивируют при 28 С в течение 5-7 дн. Выросшие колонии пассируют повторно на среде указанного состава и проверяют затем на продукцию L-триптофана, отбирая каждый раз наиболее продуктивные варианты. L-Триптофан определяют по известной методике.
В результате выделен мутант, от- 55 личающийся от дикого типа устойчи" востью к ингибирующему действию высоких концентраций, 5-метил"ЪЬ-трипто06 2 фана. В отличие от известного свойства нового штамма позволяют получить больший .выход L-триптофана при культивировании на более простой по составу минеральной среде (без витаминов и микроэлементов), содержащей в качестве источника углерода и энергии этанол.
Штамм Pseudomonas species M35 характеризуется следующими признаками. .Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы с округлыми концами, 0,6 2 — 3, подвижные с 2-4 монополярными жгутиками, грамотрицательные, спор не образуют.
Культуральные признаки. Колонии на агаризованных питательных средах (мясо-пептонном агаре, Кинг В araре) гладкие, плоские, круглые, край ровный, серовато-белые. Через 24 ч, о выращивания при 28 С образует:колонии размером 1-2. мм. Рост по уколу в МПА умеренный, в основном на поверхности среды. В жидких питательС ных средах образует интенсивную муть. Хорошо растет на минеральных средах простого состава, не требует ростовых факторов.
Физиолого-.биохимические признаки.
По отношению к кислороду — облигатный аэроб. Оптимальная температура роста 28-30 С, рН среды 6,8-7,3.
Азот утилизирует в виде солей аммония, мочевины, нитратов.
Пигменты. Образуют желто-зеленый водорастворимый флюоресцирующий пигмент на среде Кинг В. Внутриклеточного пигмента не образует.
Реакция на оксидазу и каталазу положительная. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная; Индол не образует. Аммиак образует. Сероводород не выделяет. На питательных средах, содержащих 57.-ный раствор сахарозы, леван не образует. Тест на анаэробную денитрификацию отрицательный. Реакция на аназробную аргининдегидролазу положительная. Лецити назная активность отсутствует.
Не гидролизует крахмал, желатину, Твин-80.
В качестве источникрв углерода
У использует: глюкозу, глицерин, сахарозу, галактозу, мальтозу, фруктозу, этанол, метанол, тирозин, фенилаланин, орнитин, глицин, лейцин, глютаминовую кислоту, аспараги-
1206306
0,3
0,05
Составитель Н.Афанасьева
Редактор Н.Яцола Техред З,Палий Корректор С.Шекмар
Заказ 8651/26 Тираж 490 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5
Филиал ППП "Патент", r.yæãoðoä, ул.Проектная, 4
Э новую кислоту. Не утилизирует: арабинозу, маннозу, ксилозу, лактозу, маннит, раффинозу, дульцит, сорбит, целлобиозу, инозит, серии, антраниловую кислоту, ацетамид, лизин, триптофан.
Идентификацию бактерий штамма
Pseudomonas species М35 производят согласно Bergey.
Пример 1. С косяка петлей делают посев культуры штамма Pseudomonas арестes М35 в пробирки с ами-нопептидным бульоном (рН 7,0, объем 2-3 мл). Посевной материал выращивают при 28 С в течение 18 ч. Готовый посевной материал вносят в количестве 3-5Х (по объему) в пробирки (20 мл в диаметре, высота 10 см), содержащие 5 мл ферментационной среды. Ферментационную среду стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин.
Перед употреблением добавляют этанол и затем разливают по пробиркам. Состав ферментационной среды следующий, (Х:
Na " 4Р04 (безводный) NaC1 МН С1 0,1 СаС1 0,0015 М@804 7Н О 0,2 Этанол 1,5 После 72 ч выращивания (рН 7,0) на качалке (240 качаний/мин) при о 28 С в культуральной жидкости накап ливается 0,3 г/л Ь-триптофана. Пример 2. Выращивание по10 севного материала, а также состав ферментационной среды как в примере 1. Засев посевного материала в количестве 3-57. (по объему) делают в колбы Эрленмейера .(емкостью 250 мл), содержащие 50 мл фермента- . ционной среды. После 72 ч выращивания на качалке (240 качаний/мин) при 28 С в культуральной жидкости накапливается д» 0,63 г/л L-триптофана. Использование штамма Pseudomonas species М35 позволяет в 20 раз увеличить выход L -триптофана по сравне" 25 нию с известным штаммом Pseudomonas species 5NT при культивировании на простой по составу минеральной среде (без витаминов и микроэлементов), содержащей в качестве источника углерода и энергии этанол.
