Способ осветления реакционной смеси для фотометрического измерения биологических проб

 

Изобретение относится к биохимии , Касается способа осветления реакционных смесей. Цель изобретения - повышение степени осветления реакционной смеси. Для этого к реакционной смеси добавляют детергенты, представлякщие собой; а) одно или несколько ниэкомолекулярных органических соединений; б) один .или несколько прозрачно-растворимых детергентов, образующих с добавкой а) растворимый комплекс, и в заключение добавляют другой детергент до тех пор, пока осажденный комплекс не растворится. 2 табл.

СООЗ СОЕЕТСНИХ

СФ.В

РЕСПУБЛИК Щ(}ДЯДЯ

00ENlR3 1ЕХИ С

Б:. - "O"

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОбРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2746998/28-14 (22) 06.04.79 (31) P 2816229.0 (32) 14 04 ° 78 (33) DE (46) 07 ° 12.88. Бюл. Ф 45 (71) Берингер Маннхайм, ГмбХ (DK) (72) Зигмар Клозе, Херберт Бушек и Хельмут Шлумбергер (DE) (53) 6!6.07(088,8) (56) Патент ФРГ 11 2327894, кл. G 01 N 33/16, 1976, (54) СПОСОБ ОСВЕТЛЕНИЯ РЕАКЦИОННОЙ

СМЕСИ ДЛЯ ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ

БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ

SU ÄÄ 1443816 А 3 еп 4 С 01 N 33/48 (57) Изобретение относится к биохимии, касается способа осветления реакционных смесей. Цель изобретения— повышение степени осветления реакционной смеси. Для этого к реакционной смеси добавляют детергенты, представляющие собой: а) одно илн несколько ниэкомолекулярных органических соединений; б) один .или несколько прозрачно-растворимых детергентов, образующих с добавкой а) растворимый комплекс, и в заключение добавляют другой детергент до тех пор, пока осажденный комплекс не растворится, 2 табл.

1443816

Изобретение относится к биохимии, в частности к способу осветления ре"

-акционных смесей, мутность которых вызвана. испытуемым материалом, йре" имущественно, биологического характера, например сывороткой или плазмой.

Целью изобретения является повышение степени осветления реакционной смеси.

Известно, чта мутность некоторых исследуемых образцов сыворотки или плазмы (липемическая сыворотка или плазма) неблагоприятно влияет на точность проведения измерения при фотометрическам анализе.

Повышение степени осветления достигается путем добавки в реакционную смесь детергентов, которые представляют собой одно или несколько низкомолекулярных органических соединений и один или несколько прозрачно-растворимых детергентов, которые с добавкой укаэанных органичес- 25 ких соединений образуют растворимый комплекс в достаточных для начала осаждения комплекса количествах, затем добавляют другой детергент до тех пор, пока осажденный комплекс сно30 ва не растворится.

Применяемыми соединениями являются: ароматические (конденсированные и неконденсированные) спирты и амины, предпочтительно такие, которые сильно35 электроотрицательно замещены (предпочтительными электроотрицательными заместителями являются галогены), наПример бензиловый спирт, фенол, моно-, ди- и трихлорфенолы, дибром- и три- 40 бромфенолы, крезолы, нафтолы, дигидрооксинафтолы, анилин и хлоранилин, метиланилин; сложные эфиры ариловых кислот и алкиловых кислот, например этиловый эфир и-гидроксибензойной кисg5 лоты, этиловый эфир уксусной кислоты, бутиловый эфир уксусной кислоты, этиловый эфир пропионовой кислоты, этиловый эфир трихлоруксусной кислоты и т.п .; неразветвленные и циклические50 и разветвленные алифатические спирты с более чем 3 атомами углерода, например амиловый спирт, октанол, додеканол, циклогексанол и т.n, галогенированные алифатические соединения55 с короткой цепью атомов, например, дихлорэтан, трихлорэтилен, тетрахларметан, дихлорбутен, тетрахлордифторэтан и т.п.; алифатические кетоны, например бутанон-2, циклогексанон и т.п,; альдегиды, например коричный альдегнд или бензальдегид; карбоновые кислоты, например октановая кислота; простые эфиры, например 2-ме" токсифенол; бензол.

Среди образующих с названными соединениями слаборастворимые комплексы детергентов, которые, в свою очередь, представляют прозрачные растворы в реакционной смеси, встречаются неионагенные, ионогенные и амфотерные детергенты. Предпочтительными являются неионагенные аддукты полиэтиленоксида. Особенно хорошие результаты дают алкил-, аралкил- и алкилтиоэфиры, а также сложные алкил- и аралкилэфиры полиэтиленоксидгликолей. В этих детергентах алкильные группы обычно имеют от 8 до 22 атомов углерода, арильную группу представляет, преимущественно, фенильный остаток. В гликольном остатке этих детергентов имеется обычно от 3 до 25 единиц этиленоксида в конденсированном виде. Типичными примерами этих групп детергентов являются тезит, ганапол, тергитол, тритон Х100, лензадел и брий 35, Кроме тога, могут применяться также, ионные детергенты, в частности хлориды алкилдиметилбензиламмония. Вторичные алкилсульфаты, алкильные группы которых соответствуют названному определению, также пригодны. Иэ амфотерных детергентов пригоден N-лаурнлдиэтаноламид.

Способ осуществляют следующим образом.

Подбирают низкомолекулярное соединение в количестве 0,5-300 ММ, преимущественно 0,3-3,3 г/л, растворяют его в буферном или солевом растворе, приливают к этому раствору малыми порциями прозрачный раствор детергента в количестве 0,05-1Х, предпочтительно

1-30 г/л реакционной смеси, таким образом, чтобы при обработке испытуемого низкомолекулярнога соединения детергента произошло помутнение.раствоPB °

Если произошло помутнение (которое показывает, что могут быть использованы аба вещества), то полученную смесь прибавляют к анализируемой пробе в укаэанных количествах так, чтобы было заметно дополнительное помутнение. Затем прибавляют порциями тат же или другой детергент до тех

14438 пор, пока помутнение не исчезнет совсем. Обработанная таким образом исследуемая проба сыворотки или плазмы берется для анализа.

Предпочтительно использование 5 меньших количеств детергентов из-за ях возможного негативного влияния на активность ферментов, при этом рекомендуется применение по крайней мере одного или двух различных детер гентов.

Способ применим к видам измерений, при которых мутность может привести к искажению или помехам измерения,в частности в реакционных смесях, которые предназначены для фотометрических измерений. Такие реакционные смеси известны (Бергмайер Г,У. Методы ферментного анализа. - Химия, Вайнгейм/Бергштрассе).

В табл,1 и 2 (примеры 1-20) приведены типы низкомолекулярных соединений, их соответствующие концентрации, концентрации детергента тезит (Thi

sit) и величина рН. е

В примерах 21-36 в растворе, который содержит низкомолекулярное соединение (2,4-дихлорфенол) в определенной концентрации, варьируются раз 30 личные детергенты.

В примерах 37-39 даны концентрации реактивов определенного фотометрического теста, в которых помутнение сильно мешает и поэтому устране35 но добавками, содержащимися в реактиве.

Сущность способа состоит в том, что малорастворимый комплекс, который образуется сначала, снова растворяется при добавлении другого детергента и при этом также растворяется подлежащая устранению мутность в растворе анализируемой пробы. Причем при применении детергента, отличающегося 4 от первого, его используется меньше.

Пример ы 1-36. Осветляющие системы.

Предлагаемые комбинации в течение от .1 мин до максимально 2 ч удаляют 50 муть в системе: 2 мл испытуемой смеси +20 мкл молока жирностью 3,5Х при толщине слоя 1 см, для волны 546 нм, при 25 С.

Вариация юстировки. Используют

0,1 N «трис-НС1 буферный раствор с

2Х Mg$0 7Н О.

Вариация детергентов. В О, 1 M трис-НС1 буферном растворе (pH 8,0}

16

4 с 2 MgS04 7Í Î и 8 мм/л 2,4-дихлорфенола в качестве добавки с использованием детергентов, приведенных в табл.2, получают хорошее осветление смеси.

В табл.2 приняли следующие названия: теэит — гидроксиполиэтоксидодекан, тергитол NPX — 10,5-этоксинонилфенол, тритон Х100 - 9,10-этоксиоктилфенол, пегосперза — полиэтиленгликольлауриловый эфир, теепол 710 и лензодел АВ6 — смешанные вторичные алкилсульфаты (с Ср до С ), твин 2020-этоксисорбитанмонолаурат,. брий 35 полиоксиэтиленлауриловый эфир, гена-. пол Ох80 и генапол Х100 — полигликолевый эфир спиртов жирного ряда (с прямой цепью с С - до С, }, Пример 37, Реагенты для определения мочевой кислоты в сыворотке. Рецептура: 0,05 моль/л К4Р 0 „;

10 об,Х этанола; установлено НС1 на рН 8,5; 1 мг/мл ТПН (трифосфопиридиннуклеотид); 1 v/ìë алкогольдегидрогеназы ЕС 1.2,1,5; !000 ч/мл каталазы ЕС 1,11.1.6; 0,05 моль/л Иа щавелевой кислоты; 0,05 моль/л пиразола.

Заданная длина волны измерения и относительно большой необходимый расход проб обусловлены тем, что при липемически мутном испытуемом материале измерение затрудняется или становится вообще невозможным.

Для удаления мутности вводят следующие добавки, Х: бутиловый эфир уксусной кислоты 2, тезит (добавка A)

1,5; дихлорэтан 0,5; гексанол 0,5; генапол Х-0 (изотридеканолполигликолевый эфир) 5; генапол Х-100 (изотридеканолполигликолевый эфир) 9; тезит (добавка Б) 6.

Условия опыта: 2 мл реагента (с добавками А или Б),. 0,1 мл пробы, старт с 0,6 ч уриказы ЕС ).7,3.3.

Измерение прово,„ят . при давлении 340 нм и 25"С в конечной точке.

Указанные добавки способствуют тому, что значительно повышенные липемически мутным испытуемым материалом начальные экстинкции быстро уменьшаются. Мутность от экстинкции 2,0 примерно за 10 мин уменьша" ется до стабильного уровня экстинк" ции порядка 0,2 относительно показа-. теля холостого опыта, Пример 38. Реагенты для определения холестерина в сыворотке.

1443816

Рецептура . 2,54 г/л KHzPO, 31,60 г/л KzHPOq; 8 г/л N

200 мг/л 4-аминоантипирина 282 мг/л фенола; рН 7,90, 3 v/ìë холестеринэстеразы ЕС 3.1.1,!3; 0,3 v/Më холест риноксидазы ЕС 1.1,3.6, Этот реагент является смесью, полученной в одном аппарате одностадийной смесью, и поэтому может применяться ся без изменения показателя "холостого" опыта. Выполнение этого требования обеспечивается следующими добавками (и для липемически очень мутного испытуемого материала). Освет:ляющие добавки: 815 мг/л 3,4-дихлорфенола, 4 г/л генапола Ох-!00„и

3 г/л дезоксихолата натрия; 2 г/л гептанола и 8 г/л тезита; г/л этилового эфира уксусной кислоты и 20

7 г/л тезита; при рН 7,0 в 80 мМ

K /Na -фосфатном буфере; 1,5 г/л этилового эфира парагидроксибензойной кислоты и 4 г/л тезита; при рН 7,50 в 0,2 М калийно-. фосфатном буфере. 25

Дополнительно к необходимым для образования цвета 3 ммоль/л фенола применяют 35 ммоль/л фенола; 1,5 г/л генапола Ох-100; 1,5 г/л твина 20;

1, 0 г/л хола та на трия, 30

Условия опыта: 2 мл реагента +

+ 20 л пробы, 546 нм, 25 С, Вызванная испытуемым материалом мутность экстинкции 1 1,5 в течение необходимого для реакции промежутка времени удаляется полностью или до величины, которой можно пренебречь.

Н р и м е р 39. Реагенты для определения глюкозы в сыворотке.

Рецептура . !4,9 г/л NazHPO<, 40

13,2 г/л КН РО, 8,0 г/л Ха ЯО, 30 v/ìë глюкозооксидазы ЕС !.1,3„4;

1,8 v/ìë пероксидазы ЕС 1.11,1.7;

0,2 ч/мл эстеразы EC 3.1.1.13

470 мг/л фенола, 156 мг/л 4-аминоантипирина, при рН 7.0.

Осветляющие добавки: 8!4 мг/л

3,4-дихлорфенола, 3,6 г/л генапола

Ох-100 и 3,0 г/л таурогликохолевой кислоты; 814 мг/л 3,4-дихлорфенола, 2,5 г/л тезита и 3,9 г/л таурогликохолевой кислоты, В 0,2 М калийно-фосфатном буфере, рН 7,0, дополнительно

1,35 г/л фенола, 489 мг/л 3,4-дихлорфенола, 3,0 г/л генапола Ох-100 и

2,8 г/л холата натрия.

Измерение осуществляют при давлении 578 нм, Аналогично примеру 38 используемые добавки способствуют тому, что вызванная испытуемым материалом мутность в данных условиях опыта уменьшается в кратчайшее вфемя, Приведенные примеры включают такие, при которых применяют: один или несколько прозрачно-растворимых детергентов, которые с добавкой могут образовывать слабее растворимый комплекс, и такие, при которых дополнительно к указанным применяют по крайней мере один детергент, который не может с добавкой в реакционной смеси образовать слабее растворимый комплекс (отмеченный знаком"). формула и з о б р е т е н и я

Способ осветления реакционной смеси для фотометрического измерения биологических проб путем внесения в пробу детергентов, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения степени осветления, дополнительно вводят низкомолекулярное соединеиие, выбранное из группы: фенол-2,3 или 2,4-дихлорфенол,или 2,4,6-трихлорфенол, 2,4дибромфенол, 1,5- или 1,7-,или 2,7дигидрооксинафтол, гидрохинон, анилин, 2-хлоранилин, о-толуидин, хлороформ, бензол, гваякол, бензельдегид, коричный альдегид, циклогексанон,при рН 7,1-8,0 и натриевую соль октановой кислоты при рН 5,0, которые вносят в количестве 0,3-3,3 г/л реакционной смеси, далее вносят один или два детергента, выбранных из группы: гидроксиполиэтоксидодекан, !0,5- этоксинонилфенол, полигликолевый эфир спиртов алифатического ряда с числом углеродных атомов в прямой цепи от 12 до !5, 9,10- этоксиоктилфенол, полиэтиленгликольлауриловый эфир, смесь вторичных алкилсульфатов с числом углеродных атомов в алкильном фрагменте от 8 до !8, 20-этаксиссрбитанмонолаурат, палиоксиэтиленлауриловый эфир, которые «or-ользую; в количестве 1,2-30 г/л реакционной смеси, 1443816

Концентрация

Пример

Вещество г Концентрация детер гента Х

8,0

8,0

2,8 аз

3,3

7 0

4,5

8,0

4 Фенол

8,0

7,) 8,0

8,0

8,0

3,5

8,0

8,0

2Х

2,1;5 1 об.Х 15

8,0

0,8 об.Х

1;0 5 об.X

2,0 об,Х

0,4 об.Х

8,0

8,0

8,0

8,0

0,75 об.Х 30

8,0.1 .об.X

1 об.X

0,5 об.Х

8,0

1,4

8,0

8,0

1,2

3 об,X

5,0

2,5

1Х

5 6

17

2/2

Брий 35

Твин 20

2/1

2,4-Дихлорфенол

2 2,3-Дихлорфенол

У

2,4-Дибромфенол

5 2, 4, 6-Трихлорфенол

6 1, 7-Дигидрооксинафтол

7 2, 7 "Дигидрооксинафтол

8 1,5-Дигидрооксинафтол

9 Гид рохинон

10 Анилин

11 2-Хлоранилин

12 о-Толуидин

13 Пентанол

14 Хлороформ

15 Бензол

16 Гваякол

17 Бензальдегид

18 Коричный альдегид

19 Циклогексанон. (с 6,0Х

К 04 и 2,5Х генапола

Ох-80) в 0,5 М калийнофосфатном буфере

20 Натриевая соль октановой кислоты

21 Тезит

22 Тергитол PX

23 Тритон Х100

24 Пегосперза

25 Тезит

26 Тезит

Таблица ) 8,6,4мМ 5,6

8,6,4мМ

8, 4мМ

)Х, 0,5Х

24,) 2,8 мИ

3,4 мИ

8,4 мМ

8,6,4 мИ

Таблица 2

1443816

Продолжение табл.2

27 .j Тезит

28 Теепол 710

Бензальхлорид

Брий 35

29 Лензодел Авб Брий 35

30 Тезит в

Цетилтриметилбромид аммония

31 . Твин 20

8/2

32 Брнй 35

10/2

3/1 б

„33 Генапол Ох80

34 Твин 20

35 Генапол Ох 80. Твин 20

36 Генапол Ох100

Составитель Л. Конвхов а

Техред М. Ходанич

Редактор О.Юрковецкая

Корректор С.Черни

Заказ 6404/59

Тираж 847

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. ужгород, ул. Проектная, 4 б ис- (2-Гидроксиэтил)-амин лауриновой кислоты бис-(2-Гидроксизтил)-амин лауриновой кислоты

Додецилсульфатнатриевая соль (в присутствии катионов) Цетилтриметилбромид аммония

Додецилсульфатнатриевая соль

3, 5/0,8

5/7

5/1 2

4/1

7,5/1

l/3,5

6/3