Способ определения гликозилированных белков крови
-Изобретение относится к медицине и может быть использовано для проведения биохимических анализов в клинике и эксперименте. Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение способа. Способ состоит в том, что в анализируемой пробе проводят отделение белков от избытка низкомолекулярных соединений, белковую фракцию разводят в 0,05 М Na-фосфатном буфере, рН 6,8, до конечной концентрации 10 - 10 М. Пробу последовательно обрабатьшают перйодатом калия, пиридоксамином и боргидридом натрия при молярном соотношении белка и химических реагентов соответственно 1:100:100:1000. Содержание гликозилированных белков определяют флуориметрически при длине волны флуоресценции 390-410 нм и длине волны возбузкдающего света 325-335 нм. Предлагаемый способ прост (время определения 2-3 ч) обладает высокой чувствительностью . 1 ил. (Л
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ÄÄSUÄÄ 1465766 А1 (51)4 G 01 N 33/48
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4166197/28-14 (22) 14.11.86 (46) 15.03.89. Бкп. У- 10 (71) Институт биохимии АН БССР (72) И.И.Степуро, Н.А.Ярошевич и Ю.M.Îñòðîâñêèé (53) 612.015(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
Ф 1363072 1986. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫХ БЕЛКОВ КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прове дения биохимических анализов в клинике и эксперименте. Цель изобретеиия— повышение чувствительности и упрощение способа. Способ состоит в том, 1
Изобретение относится к биохимии и медицине, касается количественногоопределения гликозилированных белков крови и может быть использовано при проведении биохимических анализов в лабораторной медицинской практике.
Цель изобретения — повышение чувствительности и упрощение способа.
На чертеже изображен предлагаемый способ..
Способ определения гликозилированных белков крови осуществляют следующим образом.
Готовят анализируемую белковую пробу, в которой необходимо определить концентрацию гликозилированиых белков. Производят отделение белков от избытков сахара и других низкомо" лекулярных соединений методом гельчто в анализируемой пробе проводят отделение белков от избытка ниэкомолекулярных соединений, белковую фракцию разводят в 0,05 М На-фосфатном буфере, рН 6,8, до конечной концентрации 10 — 10 И. Пробу последовательно обрабатывают перйодатом калия, пиридоксамином и боргидридом натрия при молярном соотношении белка и химических реагентов соответственно 1:100: 100:1000. Содержание гликозилированных белков определяют флуориметрически при длине волны флуоресценции 390-410 нм и длине волны возбуждающего света 325-335 нм. Предлагаемый способ прост (время определения 2-3 ч) обладает высокой чувствительностью. 1 ил.
2 фильтрации на колонке с сефадексом
G — 25. Собранную белковую фракцию разбавляют 0,05 М Иа-фосфатным буфером, рН 6,8, до конечной концентрации.
10 — 10 з M Концентрацию белка определяют спектрофотометрически. К белковой пробе добавляют 100-кратный избыток перйодата калия (KJ0 ) для (аЬ окисления углеводных остатков и вы" держивают 20 — 30 мин. При окислении глюкозы, связанной с белком, образуется остаток глюкозы, содержащий альдегидную группу. Затем добавляют фЬ
100-кратный молярный иэбьггок пиридоксамнна НС1, который формирует с альдегидной группой остатка глюкозы, основание Шиффа. Через 13 — 17 мин после формирования основания Шиффа добавляют 1000-кратный избьггок бор3 1465766 4 гидрида натрия (МаВН+), в результате, Пример 1. Сывороточный альбучего происходит восстановление не- мин человека фирмы Reanal (), стабильного аддукта (основания Шиф- концентрацией 10 М инкубируют в тефа), приводящее к ков л. ф ), к ковалентному связы- чение 5 сут при 37 С в водном раство5
-1 ванию пири о пиридоксамина с белком через ре Д-глюкозы концентрацией 10 M. остаток глюкозы. После инкубации отбирают аликвоты в
2 производят отделе- количестве 1 мл и на колонке с сефаЧерез 1 - ч пр ние избытка пиридоксамина НС1 и дру- дексом G — 25 производят отделение гих низкомолекуляр улярных соединений од- 10 свободной и лабильносвяэанной глюконим из известных м известных методов отделения эы. Собранную белковую фракцию раэсахаров от елков
p oB oT белков (г ельфи льтра ция, бавляют О, 05 Яа-фосфат ным буф ер ом
4 диализ, осаждение аждение ТХУ и т.д.) . .Соби" рН 6,8, до конечной концентрации 10
-4 рают белковую пробу и измеряют интен- 10 и 10 M. Концентрацию белка оп, сивности флуоресценции на. длине вол- 15 ределяют спектрофотометрически, учи ны 390 — 410 нм при длине волны воз- тывая, что 0,17.-ный раствор сыворо б св та 325 — 335 нм. буждающего света точного альбумина человека имеет опКонцентрация пиридоксамина, кова- тическую плотность 0,54 при 278 нм. лентно связанного с язанного с белком соответ- К белковой пробе последовательно доФ ствует концентрации глюкозы в ции глюкозы в соста- 20 бавляют 100-кратный избыток перйодата, ве макромолекулы при условии полного калия, выдерживают 25 мин, затем доокисления перйодатом калия углеводных бавляют 100-кратный избыток пиридокостатков и достаточно высоких концен- самина НС1 и через 15 мин (после формирования основания Шиффа) добавляют
25 избыток (2 мг) боргидрида натрия.
Так как флуоресценция пиридоксами- Через 1,5 ч производят отдепение иэ(° з на свободного и связанного с белком, бытка пиридоксамина Hcl и других ь существенно не различается, то для ниэкомолекулярных соединении на коопредепения концентрации глюкозы, лонке с с ефад екс ом G — 25 ° Собирают связанной с белком, строят калибро- 30 белковую пробу в концентрации 1 — 2" вочный график зависимости интенсив- «10 M, Измеряют интенсивность флуности флуоресценции свободного пири- оресценции на максимуме — 400 нм при доксамина от его концентрации. длине волны возбуждающего света 330 нм.
По оси абсцисс откладывают коли- Искомую концентрацию гликозилирован.чественные значения свободного пири- .ного белка в пробе определяют по кадоксамина НС1 в молях, а по оси орди- либровочному графику через интенсивнат - значения интенсивности флуорес- ность флуоресценции. ценции свободного пиридоксамина НС1, Пример 2, Плазму больных саизмеренные на спектрофлк ориметре харным диабетом получают иэ цельной
"Aminc o — Bomman (США) в относит ель- крови центрифугир овани ем при ных единицах. При этом используют 3000 об/мин. Для отделения избытка длину возбуждающего света 330 нм, а сахара и других ниэкомолекулярных регистрацию ведут на максимуме флу- соединений плазму в количестве 0,4 мл оресценции — 400 нм. Учитывая, что наносят на колонку с сефадексом С -25. квантовый выход флуоресценции свобод- Собранную белковую фракцию разбавляют ного йиридоксамина практически соот- ° 0,0> На-фосфатным у„"р, р
45 .ВеТсТВуеТ квантовому выходу флуорес- до конечнои конпентр ци «-г .10- И. ценции пиридоксамина, кдвалентно свя- Концентрацию плазмы определяют спектзанного с белком через остаток саха- рофотометрически, считая, что .1 мг ра измеряют интенсивность флуорес- плазмы человека в 1 мл Иа-фосфатного .ценции белковой пробы и по калибра-. буфера, рН 6,8, имеет оптическую вочному графику через интенсивность плотность 0,.69 при 7 п и 278 нм. К плазме флуоресценции определяют по оси абсцисс концентрацию пиридоксамина, алия вь е живают 25 мин, затем обавляют -к атный молярный избыковалентно связанного с белком через добавляют 100-крат . р ,оотаток сахара. Определенная таким ток пиридоксамина 1 о разом конце б азом концентрация пиридоксамина .(после Формирования основания Шиффа) соответствует искомой концентрации добавляют 2 мг (100-кратный избыток) гликоэилированного белка. боргидрида натрия. Через 1,5 ч проиэ5 14657 водят отделение избытка пиридоксамина НС1 и других низкомолекулярных соединений на колонке с сефадексом
G — 25, Собирают белковую фракцию в
5 концентрации 1-2 ° 10 M и измеряют ин -. тенсивность флуоресценции (М pe =
= 400 нм, Л „ = 330 нм). Искомую концентрацию гликознлированных белков в пробе определяют по калибровочному графику через интенсивность флуоресценции.
При постановке опыта (пример 2) одновременно сравнивают количество гликозилированных белков плазмы, опреде- 1r ляемых с помощью пиридоксамина у больных сахарным диабетом, с уровнем свободного сахара в плазме крови больных (см. чертеж).
Для этого строят график, где по левой оси ординат откладывают концентрацию свободного сахара в плазме больных в ммоль/л, по правой оси ординат — интенсивность флуоресценции пиридоксамина, связанного с белками плазмы, в относительных единицах при
Л, = 330 нм и Л Точками показаны значения концентрации свободного сахара в плазме, знаком "о" — интенсивность флуорес- . денции. Уровень сахара в плазме больных определяют О-толуидиновым мето,дом. С увеличением количества кава35 леитно связанной с белками плазмы глюкозы и, соответственно, количеством связавшегося с ней пнридоксамина, возрастает интенсивность флуоресценциие Предлагаемый способ по сравнеж ю . с известным повышает чувствительность" определения более, чем на 2 порядка за счет использования в качестве ре4Я агентов для обработки белков в прига- . товленной анализируемой пробе перйо66 6 дата, пиридоксамина и боргидрида натрия с последующим графическим определением количества гликозилированных белков в пробе по интенсивности флуоресценции на длине волны 3904t0 нм при длине возбуждающего света 325 — 335 нм. Упрощение определения при осуществлении предлагаемого способа обеспечивается тем, что известный способ предусматривает приготовление анализируемой пробы, отделение белков от сахаров, обработку их щавелевой кислотой, кипячение в течение 24 ч, охлаждение белков трихлоруксусной кислотой, добавление к надосадочной жидкости тиобарбитуровой кислоты и спектрофотометрирование, в то время как предлагаемый способ облегчает определение за счет устранения ряда операций — кипячения, охлаждения белков, что позволяет уменьшить время определения до 2- 3 ч при исследовании каждой пробы по сравнению с 26 — 30 ч при использовании способа-прототипа определении гликозилированных белков. Ф ор мул а и s о бр е те ни я Способ определения гликозилированных белков крови, включающий приготовление анализируемой пробы и отделение белков от сахаров с последующей обработкой их химическими реагентами и количественной оценкой, о т л и ч а юшийся тем; что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, «Х» пробу белка берут в концентрации 10 10 М, обрабатывают последовательно перйодатом, пиридоксамином и боргидридом натрия при малярном соотношении белок пробы: химические реагенты со" ответственно 1: 100:100:1000 а количество гликозилированных белков определяют флуориметрически на длине волны флуоресценции 390 — 410 нм, при длине возбуждающего света 325 - 335 им.! 465766 0 © Ю Е Пй я5иа5ы0 непер йлщоад Составитель Н. Гуляева Касарда Техред Л.Олийнык Корректор Н. Король Редактор И. Заказ 938/44 Тираж 788 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035,;Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. ужгород, ул. Гагарина,!01
