Способ получения производных пристинамицина

 

Изобретение относится к гетероциклическим соединениям и, в частности, к получению производных пристинамицина формулы I, где Y-H или диметиламиногруппа

R - 3- или 4-хинуклидинил, в виде отдельного изомера или смеси изомеров или их кислотно-аддитивных солей, которые обладают антибактериальным действием. Цель изобретения - разработка способа получения соединений, обладающих указанным действием. Получение ведут реакцией соответствующего производного пристинамицина с тиолом формулы R-SH в среде органического растворителя с последующим выделением целевого соединения в виде основания или кислотно-аддативной соли. 3 табл. @ (I)

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

Ê1 Л

3ДНЛ1И ..

БИБЛ .1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Х FlATEHTY

2 но-аддитивных солей, которые облада1 ют антибактериаль иым действием. Цель изобретения — разработка способа по лучения соедин: чий обладающих указан) ным действием. Пол учечие ведут реакцией состветствующего производного пристинимицина с тиолом ф-лы R-SH в среде органического раствора с последующим выделением целевого соединения в виде основания или кислотноаддитивной соли. 3 табл.

СИ> ! (Т)

О

С2Н5

СНз 0

0 0 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗИОДНИХ

ПРИСТИНАИИЦИНА (57) Изобретение относится к гетероциклическим соединениям и, в част- ности, к получению производных пристинамицина ф-лы (I), где Y-H или диметиламиногруппа; R — 3- или, 4-хиI нуклидинил, в виде отдельного изомера или смеси изомеров или их кислот°

gSR ®

0 о

01 0

gSR

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4202596/23-04 (22) 21.05.87 (31) 8607270 (32) 22.05.86 (33) FR (46) 23. 12.90. Бкп. М 47 (71) Рон-Пуленк Санте (FR) (72) Жан-Клод Баррьер, Клод Котрель и Жан-Марк Парис (FR) (53) 547.97.07 (088.8) (56) Патент Франции 1 2549065, кл ° С 07 D 498/14, 1985.

Патент СССР Р 1421260, кл. С 07 D 498/00, 13.07.83

Изобретение относится к способу получения новых производных пристинамицина общей формулы Н1

„,SUÄÄ 1616520 А 3 (1) С 07 D 498/14, A 61 K 31/395 где Y — водород или диметиламиногруппа;

R — 3- или 4-хинуклидинил в виде отдельного изомера или смеси изомеров, или их кислотноадцитивных солей, которые обладают антибактериальным действием, в частности на стафилококки aureus Smith, и могут найти применение в медицине.

Цель изобретения — получение новых производных пристинамицина, обладаю1616520 щих более низкой токсичностью вследствие исключения побочного кластогенного эффекта ..

В описании все протоны в спектрах указаны по нумерации, приведенной в следующей формуле:

31 4СНь

39 СНЗ 4з 4

4Р /=1 о

2Р2У 0 4Ф

I 5а5 0

0 . Н1NH 0

Н0

1 Н4

МН, 15

Спектры сделаны при 250 МГц в дейтерохлороформе; химические смещения выражены в ppm по отношению к сигналу тетраметилсилана. Используют следующие сокращения: s — синглет; 25

d- дублет; t — триплет; mt " муль- . типл ет; ш — плот ный; dd — дубл ет дублета; dt — дублет триплета; ddd дублет дублета дублета; dddd — дублет дублета дублета дублета. 30

Пример 1. Враствор 4,4 r

53-метиленпристанамицина I в смеси

А

40 см метанола и 20 см хлороформа добавляют 2,8 г 3-меркаптохинуклидина, затем перемешивают полученный раствор в течение 44 ч при 20 С. Реакционную смесь концентрируют досуха при пониженном давлении (2,7 кПа) о при 30 С. Полученный остаток суспендируют в 100 см простого этилового эфира, затем очищают мгновенной жид- костной хроматографией при среднем давлении 50 кПа, используя двуокись кремния гранулометрического состава

40-53 мм (flash хроматограФией). 45

Используют растворитель — хлористый метилен-метанол (90-10 об.Ж), отбирая фракции по 100 см . Фракции с

11 по 35 соединяют, затем концентрируют досуха при пониженном давлении (2,7 кПа) при 30 С. Остаток перемешивают в 120 см простого этилового эфира. Полученное твердое вещество отделяют фильтрованием, затем снова очищают "мгновенной" хроматографией (растворитель — хлористый метилен-метанол 85-15 o6.X), отбирая фракции по 100 см . Фракции с 2 по 7 соединяют, затем концентрируют досуха при пониженном давлении (2,7 кПа) при 30 С. Остаток перемешивают в

50 см простого этилового эфира, и полученное таким образом твердое вещество отделяют фильтрованием, промывают 3 раза по 5 см простого этилового эфира, затем сушат при пониженном давлении (27 Па) при 20 С. Таким образом, получают 1,7 r (3-хинуклидинил)-5 -тиометил-пристанамицина I в форме твердого вещества бледно-желтого цвета с т.пл. 200 С.

Спектр ядерного магнитного резонанса (смесь 4 иэомеров): 2,88 и

2,89 (?в, 4 — N(CHy)g) 3,21 и 3,22 (2s 4 — СНу); 6,51 и 6,53 (2d 2

-NH-), 6,57 и 6,58 (2d, 4K) 7,82 и

7,85 (mt, 1 Н 2 мажоритарных изомег ров); 7 95 (mt, 1 Н 2 относящихся к меньшинству изомеров); 8,78 и 8,81 (2d, 6 — 12Н- 2 относящихся к большинству изомеров);8,98 и 9,0 (2d, 6-NH- 2 относящихся к меньшинству иэомеров) .

Получают 5Х-ный водный раствор (3-хинуклицинил) -5г2 -тиометилпристинамицина I A в виде гидрохлорида: продукт 100 мг, 0,1 н.соляная кислота

0,98 см, дистиллированная вода достаточное количество для 2 мп.

3-Меркапто-хинуклидин получают следующим образом.

В раствор 14,5 г 3-ацетилтио-хинуклидина в 150 см метанола добавляют О, 5 г метилата натрия. Затем реакционную смесь нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 1 ч. Добавляют 0,5 г метилата натрия, затем нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную смесь концент-; рируют досуха при пониженном давлении (2,7 кПа) при 40 С. К полученному остатку добавляют 40 см дистиллированной воды, затем примерно

1 см уксусной кислоты, чтобы получить величину рН около 8. Полученную смесь экстрагируют 3 раза по 20 см хлористого метилена. Соединенные органические фазы сушат на сульфате натрия, фильтруют, зат ем концентрируют досуха при пониженном давлении (2,7 кПа) и температуре 30 С. Полученное коричневое масло подвергают перегонке при пониженном давлении (9 20 Па) . Фракцию, отгоняемую около

О

94 С, отбирают. Таким образом, получают 2,8 r 3-меркапто-хинуклидина.

5 16

3-Ацетилтио-хинуклидин получают следующим образом.

В раствор, содержащий 42 r трифенилфосфина в 300 см3 тетрагилрофурао на при 5 С в атмосфере азота добавляют по каплям за 30 мин 31,6 см дни зопропила зодикарбоксилата. Затем перемешивают полученную суспензию в течение 30 мин при 5 С. Добавляют в эту суспензию, поддерживаемую при

5 С, за 30 мин раствор 10,2 г 3-окси-хинуклидина и 11.4 см тиоуксусной кислоты в 600 см тетрагидрофурана. Реакционную смесь перемешивают в течение 20 ч при 20 С, затем коно центрируют досуха при пониженном давлении (2,7 кПа) при 40 С. Полученное масло растворяют в 400 см" простого этилОвого эфира, затем промывают 3 раза по 160 см соляной кислоты. Соединенные водные Фазы промывают

100 см3 простого этилового эфира, нейтрализуют до величины рН около 7 добавлением бикарбоната натрия. Величину рН полученного раствора регулируют примерно до 9 добавлением нескольких капель водного раствора 10 н. гидроокиси натрия. Экстоагируют 3 раза по 200 см хлористого метилена.

Соединенные органические фазы сушат на сульфате натрия, фильтруют и концентрируют досуха при пониженно давлении (2,7 кПа) при 30 С. Таким образом, получают 14,7 г 3-ацетилтиохинуклидина в форме коричневого масла (Rf = 0,33; растворитель— хлористый метилен-метанол 90-10 об.7) . . Пример 2. Аналогично способу, описанному в примере 1, но исходя из 6,15 r 51-метилен-пристинамицина I< и 1,1 r 3-меркапто-хинуклидина (S) и после двух очисток "мгновенной" хроматографией, отбирая фракции по

50 см (первая хроматография: раство-. ритель — хлористый метилен-метанол

90-10 об.7), после концентрации досуха фракций 12-36; (вторая "мгновенная" хроматография: растворитель: хлористый метилен-метанол 9-10 об.Ж), после концентрации досуха фракций

3-20, получают 2,6 r 3-хинуклидинил (S) -Я-тиометилпристинамицина I в

4 форме бледно-желтого порошка.

Этот продукт получают в кристаллическом состоянии следующим образом.

2,6 г 3-хинукпидинил (S)-53-тиометил-пристинамицина ЕА растворяют в

2g см метанола. Получают желтый

6Н, — СН сн1 и 58); 2,4 (d, Е и—

5 ) . 2э5 2ь 75 (mt> 5 Я, 15, 1Н, д,Я и 1Н, — СН2S-); 2,9-3, 20 (mt, -Я вЂ” СН,, 1Н, -СН вЂ” и <.

g «21

25 3,30 (mt 1Н, + ;4,98 (dd, I и 7 5, 1Н, 5 ); 5 30 (mt, 2Н, 50( и 4(К); 7,90 (dd, 1Н, 1 Н ) . (3-Хинуклидинил (S) -58-тиоиетил)— пристинамицин Ip можно также переЗО кристаллизовьтвать следующим образом.

Растворяют 17,4 r 1 3-хинуклидинил (Е) -5)-тиометип1 -пристинаиицина I

Д в 87 см ацетона, предварительно до" веденного до кипения. Полученный раствор фильтруют, затеи нерастворимую часть прополаскивают 10 c Р ацетона. Полученные через 3 ч при 20 С кристаллы фильтруют, затем сушат. Перекристалпизация полученных 14,8 г щ из 75 смэ ацетона при таких же условиях дает после фильтрования, затем сушки, при пониженном давлении (90 Па) при 20ОС 12,2 г белых кристаллов с т.пл. 185-190 С.

3-Меркапто-хинуклидин (S) получают следующим образом.

B раствор 29 r 3-ацетилтио-хин; клидина (S) в 30 см метанола, поддерживаемый приблизительно при 25 С, медленно добавляют 30 см водного ,.аствора 10 н.гидроокиси натрия. Реакционную смесь перемешивают 2 ч при о

20 С. Затем доводят величину рН реакционной смеси до 9 добавлением при55 мерно 10 см уксусной кислоты. Полуз ченную смесь экстра ируют 3 раза по

100 см хлористого метилена. Соединенные органические фазы сушат на сульфате

16520 6 раствор. Кристаллический осадок появляется после затравливания трением после фильтрования и сушки при пониженном давлении (27 Па) при 30 С.

5 Получают 1,2 г 3-хинуклидинил (S)5F-тиометил-пристинаэицина ЕА в форме белых кристаллов с т.пл. 200 С (кристаллизованный продукт в сочетании с метанолом).

Спектр ядерного магнитного peso-, нанса; 1 иэомер (следы изомера на уровне углерода 53); 0,62 (сЫ, I

16 и 6, 1Н, 5 ); 1,6-2,30 (mt, натрия, фильтруют и концентрируют досуха при пониженном давлении (2,7 кПа) при 30 С. Полученный оста- ток очищают перегонкой при понижен5 нои давлении (970 Па) . Таким образом. получают 12 r 3-меркапто-хинукпид:тна (S) в форме белых кристаллов с т.пл .

4 о

46 С.и отгоняемых при 95 С при

970 Па (g = — 118 С, С = i, 1, метао нол) .

3-Ацетилтио-хи нуклили н (S) п ол учают аналогично примеру 1, но на осноне 104 8 г трифенилфосфина, 80,8 г дииэопропилазодикарбоксилата. и

25,7 г 3-окси-хинуклидина (R) (Acta

Pharm Snec, 1979, 16, 281) . Таким образом, получают 30 r 3-ацетилтиохинуклидина (S) в форме желтого масла (Ry = 0,2; растворитель — хлористый метилен-метанол 90-10 об .7) . Углерод 3 конфигурации (R) превращают в углерод конфигурации (S) в ходе реакции по методике, описанной в Tet, Let, 1981, 22 (33), 3119 . 25

Пример 3. Аналогично примеру

1, но исходя из 6,15 г 5f-метиленпристинамицина IA и 1 г 3-меркаптохинуклидина (R) и после очистки

"мгновенной" хроматографией, отбирая фракции по 40 смз (растворитель хлористый метилен-метанол 85-15 об.7), и после концентрации досуха фракций

20-30 получают 2 г (3-хинуклидинил (R)j -5I!-тиометил-пристинамицина I

А в форме порошка бежевого цвета и т.пл. 2"0 С.

Спектр ядерного магнитного резонанса: 0 58 (dd, I = 15 и 5,5, 1Н, С

5 ); 1,5 — ?," (ш;5Ги,с"г ); 2,30 (m, 1Н, 5g); 2,35 (d, I = 15, 1Н, 5(1) Р 2,50 (сЫ, 1Н, -СН Б-); 2,60 (И, 1Н, 5Я ); 2,78 (m, 1Н, -S Ъ ° 45 )!

2,90-3,10 (m, 1Н, -СН -S- и -S ). . .СИг !

3,15 (m, 1Н, -S C ); 3,48 (m, 1Н, 1Д

- г ) 4 95 (dd, 1Н 5Я!) 5 28

H3

55 (нг, 2Н, 5 б(и 4g); 7,87 (m, 1Нк

)t0,85, 1 Н< 1-ого изомера); 7,93 (m, 1Нк0,15 1 Н6 2-ro изомера) .

1616520 8 (3-Хи нуклидинил (R) -5 g-тиометил)— пристинамицин I < перекристаллиэоI вывают следующим образом.

Растворяют 14, 15 r (3-хинуклидинил (К) -5 F-тиометил 1-пристинамицина Ig в 75 смз метана. Лобанля к этому раствору 4 см дистиллированной воды, затем оставляют для кристаллизации при 4 С . Полученные о кристаллы фильтруют, затем прополаскивают 4 раза по 10 см смеси метанола и воды (95-5 об. X) . После сушки при пониженном давлении (90 Па) при 42 С получают 10,27 r белых кристаллов с т.пл. 190 С. о

3-Меркапто-хинуклидин (R) получают по примеру 2, Hî íà ос нове

32, 5 г 3 — ацетилтио-хинуклидина (К) и 35 см водного раствора 10 н.гидроксида натрия. Получают 11, 5 r 3меркапто-хинуклидина (R) в форме белых кристаллов с т.пл. 45 С и отгоня- о о о емых при 90 С и при 930 Па (OC р =

+121 С, С = 1,1, метанол) .

3-Ацетилтио-хинуклидин (R) получают аналогично примеру 1, но на основе 104,7 r трифенилфосфина, 80,8 г диизопропилазодикарбокскпата и "5,7 r 3-оксихинуклидина (S) (Acta

Pharm Snec, 1979, 16, 281). Таким образом, получают 33,8 г 3-ацетилтиохинуклидина (R) н форме светло-коричневого масла (R = 0,4; растноритель— хлористый метилен-метанол 80-20 об.Х).

Пример 4. Аналогично примеру 1, но исходя из 3,5 r 5$ метиленпристинамицина IA и 0,6 r меркаптохинуклидина (Helv Chim Acta 1974, 57, 2339) и после концентрации досуха, получают твердое вещество, которое перемешивают в простом этиловом эфире. После фильтрова ния выделяют

3,6 r твердого вещества бежевого цвета, которое очищают "мгновенной" хроматографией, отбирая фракции по

50 см (растворитель — хлористый метилен-метанол 85-15 об.7). После концентрации досуха фракций 19-35, промывки простым этилоным эфиром, фильтрования, затем сушки образующегося твердого вещества при пониженном давлении (2,7 кПа) при 20"С получают

1,2 г (4-хинуклидинил)-5о -тиометилпристинамицина I> н форме измельченного белого порошка с т.пл. 200 С.

Спектр ядерного магнитного резонанса (2 изомера на уровне углерода 5 Р в количествах 85-15 приблизительно): 0 62 (dd, I = 1 и 5 5, 1Н, 161652 сн,--—

5P>); 1,87 (Е, 6Н, -S+ 1 )

СН—

2,20 (m, 1Н, 5g); 2,28 (m, 1Н, -CH<-S-); 2,35 (d, 1 = 15, 1Н, 5P,);

",47 (dd, 1Н, 5 ); 3,10 (t, 6H, сн1

Н,— Н ); 3,72 (dd, 1H, СН(-СН вЂ”, -S ); 5,01 ((Ы, 1Н, 5Я,);

5,29 (широкая, I = 5,5, 5К); 7,86 (m, 0,85 Н, 1 Н < относящийся к большинству иэомер); 7,92 (m, О, 15 Н

1 Нб относящийся к меньшинству изомер) .

Пример 5. Аналогично примеру 1, но исходя иэ 1,2 r 5() -метиленвиргиниамицина S в 20 см метанола и О, 21 г 3-меркапто-хинуклидина (R) i

После очистки "мгновенной" хроматографией, отбирая фракции по 10 см (растворитель — хлористый метилен-метанол 95-5 об.7. до фракции 35, затем хлористый метилен-метанол 80-?О об. Е), 2, концентрации досуха фракций 47-55 и сушки при пониженном давлении (2,7 кПа) при 30 С получают 0,6 г (3-хи нуклиди нил (R)) -5Е-тиометил вир— гиниамицина (S) в форме измельченного белого порошка с т,пл, 185 С.

Спектр ядерного магнитного резонанса (2 изомера на уровне углерода

5f в количествах приблизительно 8020): 04 (dd, I = 15и 5 5, 1Н, 5PJ;

Н

С

2 (m 1Н, 8ТЯ )1,2 34 (4 2 13

1Н, 5g,); 2,52 (dd, 1Н вЂ” СН Б-);

2,63 (Ы, 1Н, 5 ); 2,78 (dd, 1Н, -S

); 2,85-3,15 (т, 1Н, -СН Б 45

Н

-S н НД1 ); 3,48 (m, 1Н вЂ” ) );

4 94 (dd, 1Н, 5Я ); .5 27 (d широкая 50

1 = 5, 1Н, 51)Д; 7982 (М, I = 4 и 1, 1 Н6 1-ro изомера); 7,9 (dd, I = 3 и 1, 1 Нб 2-го изомера) .

Пример 6. Аналогично примеру 1, но исходя из 1, 1 г 5()-метиленвиргиниамицина (S) в 70 см3 метанола и 0,19 r 3-меркапто-хинуклидина (S) .

После очистки "мгновенной" хроматографией, отбирая фракции по 10 см

0 10 (растворитель — хлористый метилен= метанол 90-10 об.А), концентрации дб суха фракций 19-32 и сушки при пониженном давлении (2,7 кПа) при 30 С получают 0,5 г (3-хинуклидинил (S)g—

5о-тиометил-виргиниамицина (S) в форме бледно-желтого порошка с т,пл.

190 С.

Спектр ядерного магнитного ре1 зонанса (2 изомера на уровне углерода 5д в количествах приблизительно

85-15 об.Х): 0,39 (Ы, I = 15 и

5, 1Н, 5P); 1 5 73 (m, 5H, СН 5() ); 2, 11 (m, 1Н, . )

2,34 (d, I =15, 1Н, 5Р1); 2,52 (dd, 1Н, -СН S-); 2,64 (Ы, 1Н, 5 E<);

2 66 (dd, 18, 83 ); 2,90-3,2

Н С-„ (m, 6Н, 1Н, -СН S-, и H СН2 -484

3, 3-3, 5 (m, 1Н, Н С. б ); 4, 95 (dd, 1Н, "Р9); 5,27 (d широкая, 1Н, 5о1);

7,80 (dd, I = 4 и 1 1НУ0,85, 1 Н 1-го изомера); 7,90 (dd, I = 4 и 1, 1Н <

)(0,15, 12 Нб 2-го изомера).

Пример 7. Аналогично примеру

2, но исходя из 1,67 r 3-меркаптохинуклидина (S) и перемешивания при -20ОС в течение 20 ч получают после концентрации досуха при пониженном давлении (2,7 кПа) при 30 С

11,4 г вещества бежев.го цвета, которое перемешивают в 100 см простого диэтилового эфира, фильтруют, затем прололаскивают 3 раза по 20 см3 того же растворителя. Этот продукт можно перекристаллизовывать из ацетона, как описано в примере 2, чтобы голучить 6,6 г 3-хинуклидинил (S) -58-тиометил-пристина))ицина I> в форме белых кристаллов с т.пл . 198-200 С, характеристики которого идентичны характеристикам продукта, полученного в примере 2 и содержащего 37 относящегося к меньшему количеству изомера, высокоразрешающей жидкостной хроматографией (HPLC) .

Пример 8. В раствор 1 г

50-метилен-пристинамициíà I в я

20 см3 ацетона добавляют при -20 С за 1 ч 0,16 г 3-меркапто-хинуклидина (S) в растворе в 5 см3 ацетона. После 18 ч перемешивании при -20 С фильто

IZ руют реакционную смес ь, промывают твердое вещество 3 раэа по 2 см ацетона. После сушки воздухом получают 0,6 г (3-хинуклидинил (S)J -5IIтиометип-пристинамицина I g в форме о белых кристаллов с т.пл. 190 С, характеристики которого идентичны характеристикам продукта, полученного в примере 2 и содержащего 37. относящегося к меньшинству изомера, определенного HPLC.

Пример 9, В раствор 1,22 г

5f-метилен-пристинамицина I II в 15 см ацетона добавляют при -78 С 0,16 г

3-меркапто-хинуклидина (S) в растворе в 5 смз ацетона, затем перемешивают полученный раствор в атмосфере азота в течение 24 ч при -78 С. Потом реакционную смесь концентрируют досуха при пониженном давлении (2,7 Па) при 30 С, чтобы получить

1,4 г кремового белого твердого вещества, содержащего 57 относящегося к меньшему количеству иэомера,определенного HPLC и имеющего характеристики, идентичные характеристикам продукта, полученного в примере 2.

Пример 10. Исследование биологической активности полученных соединений.

Испытание полученных соединений на бактериостатическую активность

in vitro. К серии пластинок, содержащих 20 смз среды для культуры (агар Мюллер Хинтона), добавляют

1/10 этого объема серии геометрически увеличивающихся разведений (отношение геометрической прогрессии

2) испытываемого соединения. На пластинки производят посев культуры с помощью многоточечного инокулятора, который дает пятно из 104 образующих колонию единиц микроорганизма в триптиевом соевом бульоне, проходившей инкубацию в течение 18 ч при 37 С и разведенного в отношении 1/100 в той же среде.

После посева микроорганизмов пластинки инкубируют в течение 24 ч при

37 С.

Минимальной ингибирующей концентрацией (М.И. К) является самая низкая концентрация, при которой ингибируется развитие микроорганизма.

Результаты испытаний представлены в табл. 1.

Испытание полученных соединений на активность против внутрибрюшинной инфекции на мьииах. Мышам вводят внутрибрюшинную инъекцию 0,5 см взболтанной культуры возраста 18 ч тест микроорганизма в среде Мозговой и

5 сердечной инъекции (Difco), развеII денной 57-ным свиным муцином. Такая инъекция выэывает смерть контрольных животных в течение 24-48 ч. Испьггываемое соединение вводят подкожно дважды с интервалом 5 ч в день инъекции, причем первую дозу вводят через

1 ч после инъекции микроорганизма.

Использовались единичные дозы в объе15 ме 50 ".м кг.

DC a — является дозой испытываемого соединения, вводимой при каждом подкожном уколе, приводящей к тому, что 507 испьггываемых животных вы20 живают в течение испь:тательного периода (8 дней) .

Тест микроцикла СНО in vitro. Данное исследование рассчитано на оценку потенциальной активности продуктов путем возбуждения появления микроядер в клетках яичника китайского хомяка (СНО) с метаболической активацией и беэ метаболической активации.

Циклофосфамид (случай с активаци3р ей) и метилметансульфонат (случай без активации) использовались параллельно в качестве позитивного контроля.

Культуры клеток фибробластулы китайского хомяка (СНО-К1) подверга35 ют действию испытываемого соединения в присутствии или отсутствии экэогенной метаболической активации. После воздействия испьггываемых соединений клетки фиксировались и окрашивались.

40 Затем предметные стекла анализировались для обнаружения микроядер.

Клетки исследовались через 44 ч после конца воздействия.

В данных исследованиях используется полная среда, приготовленная на основе культурной среды, Hamis F-12 выпускаемой фирмой Flow Laboratories.

К среде Hamis F-12 добавлено, о мас. У.: сыворотка зародыша теленка 10," пенициллина (5000 межд.един. в 1 мп) и стрептомицин (5000 мгк/мл в растворе) 1; глютамин 1L.

Система метаболической активации (смесь S9), используемая в испытаниях, является гомогенным препара-, том печени (S9) крыс, предварительно обработанных препаратом полихлорированным бифенилом, содержащим 54Х!

CH

О Н

Н О

ОН

12®

О где у — водород или диметиламиногруппа;

R — 3- или 4-хинуклидинил в виде отдельного иэомера или смеси

45 иэомеров или их кислотно-аддитивных солей, отличающийся тем, что производное пристинамицина общей формулы

0Н

161152

С1 Агосlог 1254, к которому добавлены кофакторы и минеральные соли.

Смес ь S9 приготавливают следую-щим образом.

Раствор кофакторон никотинамида—

5 дениндинуклеотидфосфат, мл; г1ЛРР (О, 1 моль) 0,30; ультрачистая вода

3,40; изоцитрат (О, 15 моль) 8, 7.

Раствор S 9:1 мл приготавливают

10 следующим образом.

Самцы крыс (порода Спрейг-До ли) подвергают ннутрибрюшинной инъекции

Агос1ог 1254 (500 мг, кг) в объеме

25 мп/кг и убивают через 5 дней. Пос!

5 ле этого асептически удаляют печень и гомогениэирун>т в присутствии КС1 (0,15 моль) при температуре ниже

+4ОС. Гомогенный препарат подвергают центрифугиронанию н течение

10 мин при числе оборотон 90008, верхний слой (S9) разливают в флаконы и хранят в жидком азоте при †1 С о

Для каждой концентрации 2 чашки

Nunc (площадью 10 см ) заселяют примерно 150000 клеток, содержащихся и

2 мп полной среды, и подвергают инкубации при 37 С в Течение 4 ч.

В конце инкубационного периода среды с веществом выливают, чашки споласкивают PBS и инкубируют с

2 мп полной среды.

Через 44 ч после конца обработки клетки окрашивают 1 мп раствора MEYGrunwald в течение 3 мик. Затем эа

1 мин добавляют 1 мл дистиллирован35 ной воды. Клетки споласкивают 1 мл дистиллированной воды.

Giensa, разведенную в отношении

1/3 дистиллированной водой, добавля- 40 ют в течение 20 мин. Затем клетки споласкивают. Дно чашки выдавливают и приклеивают на лредметное стекло каплей клея Eukitt

Одно из двух предметных стекол, полученных от двух чашек, анализируют для подсчета. Подсчитывают количество клеток с микроядрами на 1000 всех клеток.

Результаты испьгганий представлены в табл. 2 и 3.

LD„полученных соединений выше

150 мг/кг при испьггании на мышах при подкожном введении.

Соединения, полученные по предла55, гаемому способу, проявляют, кроме того, явление синергии, когда они сочетаются с пристинамицином II A или с растворимым производным пристинамицина I IB (патент Франции

2549260), Таким образом, соединения общей формулы (I) могут использоваться н свободной форме или н форме соли присоединения с фармацентически приемлемой кислотой, в чистом виде или н сочетании с пристинамицином II 4 или предпочтительно с растворимым производным пристинамицина II u

6 фармацевтических композициях. Кроме того, эти композиции могут содержать любое другое фармацентически совместимое вещество, которое может бьггь инертным или физиологически активным.

В терапии человека полученные соединения особенно полезны при лечении инфекций бактерийного происхождения. Дозы зависят от искомого эффекта и от времени лечения. Для взрос лого они составляют обычно между 2000 и 4000 мг в день при парентеральном приеме, особенно при внутривенном приеме с медленной перфузией.

Формула изобретения

Способ получения производных пристинамицина общей формулы сн

, O О СН, О йн Но

О 1

1616520

16 водород или ди— 3-хинуклидиводород, или

R — 4 -хи нукли—

Таблица 1

Staphylococcus

aureus Smith

Пример

Активность

Актив ность

1п

in

vitro

М.И. К, мг /мп

vivo

ОС о мг/кг (п одкомно) 2

1

0,5

5

8,5

19

48

?О

4,5

20 где Y имеет указанные значения, подвергают взаимодействию с тиолом общей формулы

R- БН, где R имеет укаэанные значения, в среде органического растворителя с последующим выделением целевого соединения или в виде основания, или в виде кислотно-аддитивной соли.

2

4

6

Известные соединения: а) 5g- (3(4-метил-1-пип ера зинил) пропил) тиометилпристинамицин Ig б) 5$-(1-метил4-пиперидил)тиометилпристинамицнн Тд б) 5$- (2-диэтиламиноэтил) тиометилпристинамицин I

Приоритет по приз накам:

2?.05.86 при Y метиламиногруппа, R нил .

21.05.87 при 7 ди метил а ми í or р уппа, динил.

I8

Таблица2

1616520

Число кл еток, с одерзащих микроядра/

/1000 примеру

16

29

33

40

268

Исследованные соединения по

П ол ожит ел ьный контроль

Положительный ко нтроль

Положительный контроль

Пол обит ел ьный контроль

Известное соединение в

Концентрация, мг/мл

1

5 ,50

1,25

15,00

7,50

3,75

45,00

22,50

11, 25

15 00

7,50

3,75

36

28

32

22

17

29

27

27

26

18

268

26

21

268

26

Заключение

Некластогенный продук1

Некластогенный продукт

Некластогенный продукт

Некластогенный продукт

Некластог е нный продукт

Некластогенный продукт

Кластогенный продукт

161652

Число

62

59

29

16

553

38

31

41

37

394

40

100

540

100

100

100

540

Иссл едованные соединения по примеру

Положительный контроль

Положительный контроль

Пол ожит ел ьный контроль

Положит ел ьный пример

Известное соединение а

Положит ельный пример

Сравнение

Известное соединение в

Положит ел ьный пример

Концентрация, мг/мп

24, 75

12,32

6,18

2,50

1,25

15,00

7,50

3,75

50,00

10,00

5,00

0,50

0,10 кл етох, с одержащих микр Оядра/

/1000

Таблица3

Заключение

Некластогенный продукт

Некластогенный продукт

Некластогенный продукт

Некпастогенный продукт

Кластогенный продукт

Кластог енный продукт