Способ определения иммунологической реактивности организма

 

Изобретение относится к медицине и может найти применение в диагностике спефицического клеточного иммунитета при острых и хронических заболеваниях инфекциошго-аллергического или аутоиммунногогенеза.Цель изобретения - повышение точности за счет определения рецепторного аппарата лимфоцитов и фагоцитов. Производят измерение люмннолзависимой хемолюминесценции нестнмулироваиных сенсибилизированных лейкоцитов, лейкоцитов, стимулированных латексом без антигена и лейкоцитов, стимулированных латексом , нагруженным бактериальным или тканевым антигеном, сопоставляют полученные данные и при повышении хемилюминесценции в пробе, содержащей специфический стимулятор, и отсутствии разницы между показателями реакции па неспецифический стимулятор и без него определяют гипергический тип иммунной реакции, а при наличии разницы между ними определяют гипергический тип иммунной реакции. Точ- - ность способа составляет 62%, по прототипу - 32%. с « СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК, G 01 И 33/53, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ. ГКНТ СССР

К АBTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4458984/14 (22} 12.07.88 (46) 23.02.91. Бюл. Р". 7 (71) Киевский медицинский институт им. акад. А.А. Богомольца (72) Н.И.Якуба, А.А. Андрущук, Л.И.Скрипка и Е.Ф.Чернушенко (53) 615. 375 (088, 8) (56) Чернушенко Е.Ф, и Колосова Л.С.

Иммунологические исследования в клинике, - Киев: Здоровье, 19-78, с.47 — 48. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОИ РЕАКТИВНОСТИ ОРГАНИЗМА ,(57) Изобретение относится к медицине и может найти применение в диагностике спефицического клеточного иммунитета при острых и хронических забол ева виях инфекционно-алл ергич еского или аутоиммунного генеза. Цель изобреИзобретение относится к медицине и может найти применение в диагностике специфического клеточного иммунитета, а также установления его типа при острых и хронических заболеваниях инфекционного, аллергического, .аутоиммунного, профессионального и др. генеза.

Цель изобретения -. повышение точности способа за счет определения рецепторного аппарата лимфоцитов и клеток.

Способ осуществляется следующим . образом в два этапа.

1-й этап включает наслоение антигена на латекс. К 1 мл суспензии из

„„SU„„! 629848 А 1

1 тения — повышение точности за счет определения рецепторного аппарата лимфоцитов и фагоцитов. Производят измерение люминолзависимой хемолюминесценции нестимулированных се сибилизированных лейкоцитов, лейкоцитов, стимулир ованных латекс ом без антиг ена и лейкоцитов, стимулированных латексом, нагруженным бактериальным или.тканевым ацтигейом, сопоставляют полученные данные и при повышении хемилюминесценции в пробе, содержащей специфический стимулятор, и отсутствии разницы между показателями реакции на неспецифический стимулятор и без него определяют гипергический тип иммунной реакции, а при наличии разницы между ними определяют гипергический тип иммунной реакции. Точ- .ност ь сп ос оба с оста вля ет 6 2Х, по прототипу — 32X частиц латекса. в концентрации 10 добавляют 1 мл антигепов (используются стандартные бактериальные, грибковые, пыльцевые, пищевые или производственные антиг ены, а также тка невые антигены, полученные общепринятым методом.

Смесь латекса и антигена помещают в морозильное отделение холодильника на 18 ч, после чего ее центрифугируют, надосадочную жидкость выливают, добавляют мп физиологического раствора.

На 2-м этапе проводят исследование люминолзависимой хемилюминесценции сенсибилиэированных лейкоцитов.

1629848

Кровь.из пальца или вены набирают в

4 гепаринизированные капилляры.

Герметически закрытые капилляры центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, Лейковзвесь из четырех капилляров, образованную на границе плазма— эритроцит, растворяют в 8 мл раствора Хенкса, образуя 16 проб (2 контрольных и 14 опытных). При необходимости исследовать одновременно большее или меньшее количество антигенов описанным способом готовят нужное количество проб из расчета . 1 капилляр периферической крови, растворенный в 1,5 мл раствора Хенкса на каждые 3 пробы.

Смесь лейковзвеси и раствора Хенкса разливают по 0,5. мл во флаконы для хемилюминесцентного исследования, после чего добавляют: в 1-й контрольный флакон 0,1 мл физиологического раствора,во ".-Й контрольный флакон 0,1 мл раствора частиц латекса в дистиллированной воде в концен- трации 10, в 3 — 14-й опытные флаконы по

О, 1 мл частиц латекса, нагруженного бактериальными, грибковыми или тканевыми антигенами в конечной концентрации 10

В каждую пробу добавляют 0,1 мл

2,8 MM раствора люминола, пробы инкубируют в термостате 30 мин и провоцят замер хемилюминесценции в режиме. счета фотонов с помощью ФЭУ-39а.

Сопоставляют результаты хемилюминесценции, полученные во 2-й контрольной пробе с опытными, выявляя пр обу, хемилюминесцентное свечение которой существенно выше по сравне40 нию со 2-й контрольной, на основании чего диагностируют наличие специфической иммунной реакции по отношению к данному антигену.

Для уточнения напряженности иммунитета, т. е. типа иммунологическои

t 45 реакции сопоставляют показатели 1-й и 2-й контрольных проб, диагностируя

° гипергический тип клеточного иммунитета при отсутствии разницы между показателями спонтанной хемилюминес- 50 ценции и стимулированной .инертным латексом (неспецифическим" стимулятором), тогда как гиперерический тип иммунной реакции определяют при наличии разницы между этими показателями. 55

Пример 1. Вольной К., 7 лет, поступил в детское отделение с диагнозом". левосторонняя очаговосливная бронхопневмония ДН, левосторонний экссудативный плеврит.

Иммунологическое исследование выполнено согласно методике, описанной в предыдущем разделе. У больного из пальца произведен забор крови в 3 гепаринизированные капилляра. Лейковзвесь из капилляров получали описанным способом, растворяли в 6 мл раствора Хенкса, смесь распределяли по

0,5 мл на 12 проб.

Ко всем пробам добавляли 0,1 мл

2,8 MM люминола, пробы инкубировали в термостате в течение 30 мин и проводили измерение хемилюминесценции каждой пробы в течение 10 с. Получают хемилюминесцентное свечение в 1-й контрольной пробе в течение

12500 имп/с, а во 2-й контрольной пробе — 11950 имп!с, Значения хемилюминесценции 1-й опытной пробы (стимулированной частицами латекса, нагруженными антигеном гемолитического стафилококка составили 19200 имп/с, что существенно выше по сравнению со второй контрольной пробой. Данные хемилюминесценции других опытных проб достоверно не отличались от 2-й контрольной пробы.

На основании полученных данных диагностировано наличие специфической и мунной реакции по отношению к гемолитическому стафилококку. Отсутствие существенной разницы в покязателях хемилюминесцентного свечения 1-й и 2-й контрольных проб позволяет определить гипергическую иммунную реакцию к выявленному антигену гемолитического стафилококка. Низкая напряженность иммунитета указывает на активный инфекционно-воспалительный процесс, вызванный стафилококковой инфекцией, что было подтверждено выявлением в плевральпой жидкости гемолитического стафилококка в высоких титрах — 10 б

Полученные данные подтверждены также нарастанием титров антистафнлококковых антител в динамике заболевания (через 2 недели от начала болезни титр антистафилококковых антител вырос в 6 раз по сравнению с исходным уровнем.

При исследовании известным способом существенной разницы в показателях спонтанной, стимулированной ФГА и стимулированной гемолитическим стафилококком РБТЛ не выявлено (пропент бластных клеток соответственно

Установленный диагноз подтвержден путем проведения комплекса иммунологических исследований. Аутоиммунную

5 реакцию на легочной антиген выявлено путем проведения реакции поглощения комплемента (по Кондрашовой H.È.), которая была положительная (+++).

Специфичность антигена нейссерия катарралис и туберкулина подтверждена путем постановки кожных проб. Кожная проба с аллергеном нейссерия катарралис была положительна (+++) через

48 ч (отмечался волдырь в диаметре более 12 мм). Проба Манту — папула

19 мм (через 32 ч).

При исследовании известным способом РБТЛ спонтанная составляет 12Х, РБТЛ с ФГЛ вЂ” 23Х, РБТЛ с аллергеном

20 нейссерия катарралис — 22,6Х, РБТЛ с легочным антигеном — 23.GX, РБТЛ с туберкулином — 41,4Х, что свидетельствует об отсутствии положительных реакций со специфическими антигенами

25 легких (нейссерия катарралис): положительная реакция отмечена только в отношении туберкулина.

В приведенном примере высокая точность предлагаемого способа подтверж30 дена комплексом иммунологических исследований, выявляющих наличие специфической сенсибилизации к антигеEIBM различного вида.

В то же время обследование пред35 лагаемым способом не дало положительных реакций к двум из трех специфических антигенов. Это указывает на большую точность предлагаемого способа по сравнению с известным.

Пример 3. Больной В., 36 лет, поступил в кли. .ику ВНИИГИПТОКСА с диагнозом: бронхиальная астма, профессионального генеза. .Из проф. анамнеза выяснено, что в течение 11 лет работает аппаратчиком и цеху антибиотиков по производству биомицина на Немешаевском бпохимза50 димо установить наличие сенсибилизаспецифическому антигену.

55.Для решения поставленной задачи согласно методике предлагаемого спо5 16 298 составил: 7Х, 17,2Х и 18,12), в связи с чем определение реактивности специфического клеточного ыкмунитета было невозможным. Это свидетельствует о преимуществе предлагаемого способа по сравнению с известным, диагностика с помощью которого невозможна при гипергических реакциях иммунитета.

Пример 2. Больная К., 13 лет, поступила в стационар с диагнозом: хроническая пневмония в стадии ремиссии, деформирующий бронхит.

Проведено иммунологическое обследование по предлагаемому способу.Из двух капилляров крови, взятых у больной из пальца приготовлено 6 проб:

1-я контрольная с физиологическим раствором, 2-я контрольная с латексом без антигена, 1-я опытная с латексом, нагруженным легочным антигеном, 2-я опытная с латексом, нагруженным стафилококковым антигеном, 3-я опытная с латексом, нагруженным стрептококковым аллергеном, 4-я опытная с латексом, нагруженным комплексным пневмококковым аллергеном, 5-я опытная с латексом, нагруженным аллергеном нейссерия катарралис, 6-я опытная с латексом, нагруженным синегнойной палочкой, 7-я опытная с латексом, нагруженным туберкулином.

В результате измерения хемилюминесценции подготовленных проб получены следующие результаты: 1 — я контрольная проба 11200 имп/с, 2-я конт-. рольная проба 17020 имп/с. Среди опытных проб повьпцение хемилюминес-: ценции отмечалось в пробах 1-й, 5-й и 7-й, на основании чего диагностирована специфическая реакция иммунитета по отношению к легочному антигену, антигену нейссерии катарралис и туберкулину. Сопоставление результатов исследования 1-й и 2-й контрольной проб позволило установить существенное повышение хемилюминесцентного свечения в 1-й пробе по сравнению со

2-й, что свидетельствует о повышенной (гиперергической) реакции иммунитета к данным антигенам, что может быть связано с хроническим инфекционным процессом.

Проведенное обследование позволило уточнить окончательный диагноз: хроническая пневмония, гиперчувствительность замедленного типа в отношении легочного антигена, антигена нейссерия катарралис и туберкулина. воде.

Для подтверждения диагноза необхоции к производственному антигену (биомицину) и выявить напряженность иммунитета по отношению к выявленному соба создано три пробы: 1-я контрольная нестиж улирова ная, 2-я контрольная, стимулированная инертным латексом, 3-я опытная, стиммулированная

1629848 вить специфический антиген, но и определить напряженность иммунитета в отношении данного антигена, в плане уточнения гиперерической или гиперэргической реакции иммунитета, что позволяет также отдифференцировать острый и хронический инфекционный, аллергический или аутоиммунный процесс.

Практическая значимость способа определяется широкой информативностью, позволяющей исследовать специфические реакции иммунитета в отношении самых различных антигенов (инфекционных, тканевых, атопических, производственных, медикаментозных и др.), быстрым получением результатов (через час после взятия крови

15 для исследования), тогда как при исследовании известным способом — только на 5 — 7-е сутки, а также высокой объективностью, поскольку результаты исследований Регистрируются печатным устройством установки по измерению хемилюминесценции.

Формула изобретения

Способ определения иммунологической реактивности организма путем добавления к лейкоцитам крови больного специфического и неспецифического стимулятора с последующим учетом показателей реакции на стимуляторы и

30 без них, отличающийся тем, что, с целью повышения точности спо35 соба за счет определения состояния рецепторного аппарата лимфоцитов.и фагоцитирующих клеток,в качестве стимулятора используют частицы латекса, нагруженные специфическим .и неспеци» фическим антигеном, далее проводят реакцию хемилюминесценции и при повы-. шении специфической хемилюминесценции и отсутствии разницы между показателями реакции на неспецифический стимулятор и без него определяют ги

45 юкова ва

Корректор М.Демчик

Заказ 436 Тираж 407 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101 латексом, нагруженным раствором биомицина в разведении 1:10.

Получены следующие результаты: хемилюминесцентное свечение 1-йконтрольной пробы составляет

12950 имп/с, 2-й контрольной пробы—

28732 имп/с, 3-й опытной пробы—

44260 имп/с.

На основании полученных данных, свидетельствующих о существенном повьппении хемилюминесценции в пробе, содержащей производственный антиген (биомицин) по сравнению с контролем, а также повышение свечения во 2-й контрольной пробе по сравнению с 1-й контрольной диагностировано наличие сенсибилизации к биомицину и гиперэргическую реакцию иммунитета по отношению к этому антигену. Это подтверждает возможность возникновения хронического заболевания (бронхиальной астмы), вызванного производственным . антигеном.

Диагноз гиперчувствительности замедленного типа, вызванный производственным антигеном (биомицином), подтвержден постановкой реакции торможения миграции лейкоцитов (миграция лейкоцитов в агарозе, содержащей биомицин в разведении 1:100, была на 20(Fi. меньше по сравнению с контролем).

При,постановке РБТЛ (по известному способу) существенной разницы между показателями спонтанной, стимулированной ФГА и стимулированной специфическим антигеном (биомицином) не выявлено, что свидетельствует о большой точности предлагаемого способа по сравнению с известным.

Предлагаемым способом обследовано

110 детей с различной соматической и инфекционной патологией, а также более 280 взрослых лиц в отделениях клиник терапевтического профиля, профзаболеваний и туберкулеза. Точность способа при этом возрастала на 62 (по известному 32X).

Преимущества способа заключаются также в возможности не только выяСоставитель Г.Кр

Редактор Н.Лазаренко Техред Л.Сердюко

:пергический тип иммуннойреакции,а при наличии разницы между ними определяют гипергический тип иммунной ре-, акций.