Способ определения антител к катехоламину

 

Изобретение относится к химии получения новых соединений для их использования в технике иммунохимических иследований. Цель изобретения - повышение чувствительности к катехоламину. Для этого в раствор пероксидазы в воде добавляют катехоламин и глутаровый альдегид в молярном соотношении компонентов 1:100:(8-16). Смесь инкубируют при 20-30°С в течение 3 ч, затем выделяют целевой продукт диализом против воды. Для повышения чувствительности способа твердую фазу сенсибилизируют вторичными антителами, их подвергают взаимодействию с исследуемой сывороткой при 37°С 40 мин, затем твердую фазу промывают водой, добавляют меченый пероксидазой катезоламин в разведении 1:100. Перед конъюгированием ферментномеченого катезоламина пероксидазу хрена активируют периодатом натрия при молярном соотношении 1:(150-200), выдерживают 30-40 мин и используют в соотношении катехоламином 1:200. Реакционную смесь инкубируют 40 мин при 37°С, промывают водой, добавляют субстратную смесь и по оптической плотности раствора определяют титр антител . 2 з.п. ф-лы. fe

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (says 6 01 и 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ. (21) 4114750/14 (22) 10.09.86 (46) 15.06.91. Бюл. М 22 (71) Таджикский государственный университет им. В.И. Ленина и Институт сердечнососудистой хирургии им. А.Н. Бакулева (72) С.П, Смотров, И.Н, Шарипова, Д.Б. Сапрыгин и П.M. Аширов (53) 615,373 (088.8) (56) Boerrigter G.Н. et al. lmmunol. Meth., 1983, ч. 61, р. 377-384. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К

КАТЕХОЛАМИНУ (57) Изобретение относится к химии получения новых соединений для их использования в технике иммунохимических иследований.

Цель изобретения — повышение чувствительности к катехоламину. Для этого в раствор пероксидаэы s воде добавляют катехоламин и глутаровый альдегид в молярном соотноИзобретение относится к химии получе, ния новых соединений для их использования в технике иммунохимических исследований.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа при определении титров антител к катехоламину.

Способ осуществляют следующим образом.

В раствор пероксидазы в воде добавляют катехоламин и глутаровый альдегид в молярном соотношении компонентов

1;100:8 — 16 соответственно, смесь инкубируют при 20 — 30 С в течение 3 ч, после чего выделяют целевой продукт диализом против воды.

Возможен также вариант, при котором пероксидазу растворяют в воде, в раствор

„„5U,, 1656455 Al шении компонентов 1:100:(8-16). Смесь инкубируют при 20 — 30 С в течение 3 ч, затем выделяют целевой продукт диалиэом против воды. Для повышения чувствительности способа твердую фазу сенсибилиэируют вторичными антителами, их подвергают взаимодействию с исследуемой сывороткой при 37 С 40 мин, затем твердую фазу промывают водой, добавляют меченый пероксидаэой катеэоламин в разведении

1:100. Перед коньюгированием ферментномеченого катеэоламина пероксидазу хрена активируют периодатом натрия при молярном соотношении 1:(1 50-200), выдерживают

30 — 40 мин и используют в соотношении катехоламином 1:200, Реакционную смесь инкубируют 40 мин при 37 С, промывают водой, добавляют субстратную смесь и по оптической плотности раствора определяют титр антител. 2 з.п; ф-лы. добавляют перйодат натрия в количестве

150 †2 M на 1 M пероксидазы, реакционную смесь инкубируют 30 — 40 мин. диализуют против воды, после чего в ней растворяют катехоламин в количестве 200 M на 1 M пероксидаэы, инкубируют при 20-30 С в течение 3 ч, а затем выделяют целевой продукт диалиэом против воды.

Для повышения чувствительности способа определения титров антител к катехоламину путем обработки иммобилизованного на твердой фазе комплекса антиген-антитело ферментсодержащим биологически активным веществом. взаимодействия с субстратной смесью и последующего определения титра антител по интенсивности окраски, твердую фазу сенсибилизируют вторыми антителами, их под1656455 вергают взаимодействию с исследуемой сывороткой при 37 С в течение 40 мин, после чего твердую фазу промывают водой и к ней добавляют меченый пероксидазой катехоламин в разведении 1;100, реакционную смесь инкубируют 40 мин при 37 С, промывают водой, добавляют субстратную смесь и по оптической плотности раствора определяют титр антител.

Согласно способу определения катехоламинов, антитела к катехоламину сенсибилизируют на твердой фазе, затем к иммобилизованным антителам добавляют исследуемую пробу, инкубируют при 37 С в течение 40 мин, отмывают водой, после чего к образовавшемуся комплексу добавляют меченый пероксидазой катехоламин, инкубируют при 37 С в течение 40 мин, промывают водой, добавляют субстратную смесь и по оптической плотности раствора определяют количество катехоламина в исследуемой пробе. .По первому способу катехоламин связывается с пероксидазой при помощи бифункционального реагента — глутарового ал ьдегида.

Пример 1. Получение меченого пероксидазой норадреналина 0,1 мкМ пероксидазы растворяют в 2 мл воды, добавляют в раствор 10 мкМ норадреналина и по каплям 2 мл раствора, содержащего 0,8 мкМ глутарового альдегида. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч, а затем подвергают диализу против воды на диализной мембране 20/32 фирмы Serve (ФРГ) в течение 24 ч.

Для сенсибилизации поверхности полистиролового планшета используют вторые антитела, в качестве которых применяют

IgG морской свинки к IgG кролика, в концентрации 20 мкг/мл в 0,1 М карбонатбикарбонатном буфере рН 9,6, В каждую лунку планшета вносят по 50 мкл раствора вторых антител и инкубируют в течение 18 ч при 4 С, после чего лунки промывают водой с добавлением твина-20 фирмы

"Ferak" (Западный Берлин). Затем в каждую из лунок вносят антисыворотку к определяемому катехоламину в двукратных разведениях (no 50 мкл), начиная с разведения 1:200, инкубируют в течение 40 мин при 37 С, затем отмывают водой с твином20 и вносят в каждую из лунок по 50 мкл меченого пероксидазой катехоламина, вид которого соответствует определяемому типу антител, в разведении 1:100. Смесь инкубируют в течение 40 мин при 37 С, после чего планшеты отмывают водой с твином-20 и добавляют в каждую из лунок по 50 мкл субстратной смеси,,состоящей из 5 мл расв течение 3 ч при комнатной температуре, а затем диализуют против воды на диализной

30 мембране 20/32 фирмы "Serva" (ФРГ) в течение 24 ч, Определение титра антител проводят как в примере 1.

Препарат, синтезированный по перво35 му способу, содержит большее количество катехоламина, присоединенного к пероксидазе (6 — 8 М на 1 М пероксидазы), чем препарат, полученный по второму способу (3 — 4 М на 1М пероксидазы), В то же время

40 препарат, полученный по второму способу, обладает большей ферментативной активностью (2 10 M против 5 10 М). Из практических соображений предпочтение к использованию одного из препаратов от45 дать затруднительно, так как качественные параметры их примерно одинаковы.

Отсюда следует. что первый и второй способы получения являются альтернативными.

50 Основным критерием оценки свойств полученных препаратов служит определение связывающей способности антител к катехоламинам по отношению к этим и репаратам.

55 Для сравнения производят определение титров антител прототипным способом, при котором полист ироловыи планшет сенсибилизируют соответствующим катехоламином, а образовавшийся комплекс катехоламин — антитело индентифицируют

25 твора ортофенилендиамина (0,4 мгlмл) в 0,1

М цитратно-фосфатном буфере рН 5,0 и 20 мкл З,-ной перекиси водорода. После инкубации в течение 5 мин ферментативную реакцию останавливают 50,-ным раствором серной кислоты, Оптическую плотность раствора в каждой лунке регистрируют на многоканальном фотометре

FP-901, фирмы "Labsystems Оу" (Финляндия).при 500 нм.

По второму способу углеводную часть пероксидазы предварительно подвергают окислению перйодатом натрия и активированный таким образом фермент вступает в реакцию с катехоламином.

Пример 2. Получение меченого пероксидазой норадреналина.

0,2 мкМ пероксидазы растворяют в 1 мл дистиллированной воды, Затем к этому раствору добавляют 0,2 мл раствора, содержащего 30 мкМ перйодата натрия, перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре и диализуют против воды. 40 мкМ норадреналина растворяют в 1 мл фосфатного буфера рН 7,2 и добавляют к раствору окисленной перйодатом пероксидазе. Смесь перемешивают

1656455

Составитель А. Литовченко

Техред М.Моргентал Корректор С. Шевкун

Редактор А. Ревин

Заказ 2049 Тираж 419 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 вторыми антителами, мечеными пероксидаэой. По данным измерения оптической плотности построены зависимости в координатах — оптическая плотность против фактора разведения антисыворотки: при 5 определении известным способом и предлагаемым способом. В известном определении: при разведении антител 1:3200 и выше оптическая плотность хе изменяется и равна

0,17. В предлагаемом определении это зна- 10 чение оптической плотности достигается при разведении 1:891.200 и выше. Это говорит о том, что образовавшийся комплекс катехоламин-антитело выявляется в предлагаемом способе в 256 раз чувствительнее, чем 15 в прототипном. Таким образом, применение меченого пероксидазой катехоламина в предлагаемой схеме определения титров позволяет повысить чувствительность определения более чем в 200 раз. 20

Формула изобретения

1. Способ определения антител к катехоламину, включающий сенсибилиэацию твердой подложки, добавление исследуе- 25 мой сыворотки,.ферментспецифического субстрата и определение количества антител по развитию специфического окрашивания, отличающийся тем, что, с целью увеличения чувствительности способа, твердую подложку сенсибилиэируют вторичнымц антителами и после добавления исследуемой-сыворотки вносят ферментномеченный катехоламин, приготовленный путем его конъюгирования и инкубирования в течение 3 ч при комнатной температуре с последующим диализом.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем;-. что при конъюгировании ферментномеченного катехоламина используют катехоламин, пероксидазу хрена и глутаровый альдегид в молярном соотношении

1: 100:8-16.

3. Способ по и. 1, отличающийся тем, что перед конъюгированием фермент- но-меченного катехоламина пероксидаэу хрена активируют перйодатом натрия, взятых в малярном соотношении 1:150-200, выдерживают 30-40 мин при комнатной температуре и используют в соотношении с катехоламином 1:200.