Способ определения функционально-активных лейкоцитов

 

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано с целью диагностики нарушений иммунитета в стоматологии. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Способ осуществляется посредством определения окислительно-восстановительных свойств нейтрофилов хемилюминесцентным методом в смывах с полости рта, которые смешивают со средой 199 в соотношении 10 : 1 и выдерживают при +4°С до полного осаждения клеточной фракции, добавляют люминол в конечной концентрации 10 3 М и пирогенал (25 МПД/мл). Таким образом повышают чувствительность способа, что позволяет определять функциональную активность нейтрофилов в концентрации 10 клеток/мл 1 табл

COIO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4495835/14 (22) 18.10.88 (46) 23,10.91. Бюл. ¹ 39 (71) Волгоградский медицинский институт (72) Э.С.Темкин и С.M.Ëèõîëåòîâ (53) 616.003.215(088,8) (56) Зенков Н.К. и Куликов B,Þ., Лабораторное дело, 1985, № 1, с. 43-44. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО-АКТИВНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ (57) Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано с целью диагностики нарушений иммунитета в стоматологии. Целью изобретения являетИзобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности, Способ осуществляют следующим образом.

У больного делают ополаскивающий смыв 5 мл физраствора в течение 20-30 с и его сбрасывают. Через 2-3 мин повторяют процедуру смыва с полости рта и всю смывную жидкость собирают в градуированную центрифужную пробирку, Жидкость изо рта сливают медленно, так, чтобы не образовалась пена. Слюну не собирают в пробирку. В полученный смыв (примерно 4-5 мл) добавляют

0,5 мл 10-кратной среды 199 и оставляют в холодильнике до полного оседания клеточной фракции. Надосадочную жидкость сливают, а клетки (лейкоциты) в осадке исследуют хемиалюминисцентным методом. Л юминол 10-3 M готовят следующим образом: навеску 10 мг сухого люминола фирмы "Серва" суспендируют в 1 мл физраствора и подогревают до

45-50 С. Нерастворившийся люминал отде!

Ж,» 168б355 А1 ся повышение чувствительности способа, Способ осуществляется посредством определения окислительно-восстановительных свойств нейтрофилов хемилюминесцентным методом в смывах с полости рта, которые смешивают со средой 199 в соотношении 10

1 и выдерживают при +4 С до полного осаждения клеточной фракции, добавляют люминол в конечной концентрации 10 э М и пирогенал (25 МПД/мл). Таким образом повышают чувствительность способа, что позволяет определять функциональную активность нейтрофилов в концентрации

10 клеток/мл. 1 табл. ляют фильтрованием через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Профильтрованный раствор хранят в холодильнике и используют в неразведенном виде. При измерении хемилюминесценции лейкоцитов в присутствии люминола записывают показания в

mv сдисплея прибора наибольшую цифру иэ трех, возникающих каждые 1-2 сек. Функциональную активность лейкоцитов полости рта изучают в присутствии стимулятора пирогенала. Для этого в 3 кюветы (стимулированный тест) вносят по 50 мкл из осадка лейкоцитов и по 25 мкл раствора пирогенала (коммерческий раствор 25 МПД/мл) и в 3 другие кюветы добавляют по 25 мкл физраствора (контроль). Кюветы встряхивают, добавляют по 10 мкл люминола и оставляют на

45 мин при 37 С. Через каждые 15 мин кюветы вынимают из термостата и измеряют хемилюминесценцию на приборе ЛКБ-1250 (Финляндия). Интенсивность хемилюминесценции определяют как светосумму в mv трех измерений. Коэффициент активации лейкоцитов

16S6355 (К) полости рта в присутствии пирогенала рассчитывают по следующей формуле: а — Ь

К=— а где а — светосумма хемилюминисценции нейрофилов в присутствии пирогенала;

Ь вЂ” то же самое без такового.

Пример осуществления способа.

Исследование функциональной активности лейкоцитов полости рта у больного Е-ва, 46 лет с диагнозом верхушечного периодантита.

У.больного делают ополаскивающий смыв

5 мл физраствора в течение 20-30 с и его сбрасывают, Через 2-3 мин повторяют процедуру смыва с полости рта и всю смывную жидкость собирают в градуированную центрифужную пробирку. Жидкость изо рта сливают медленно, так, чтобы не образовывалась пена. Слюну не собирают в пробирку. В полученный смыв

5 мл добавляют 0,5 мл 10-кратной среды 199 и оставляют в холодильнике до полного соединения клеточной фракции. Надосадочную жидкость сливают, а клетки (лейкоциты) в осадке исследуют хемилюминесцентным методом. Люминол 10 M готовят следую-з щим образом: навеску 10 мг сухого люминола фирмы "Серва" суспендируют в 1 мл физраствора и подогревают до 45 — 50 С. Нерастворившийся люми нол отделя ют фильтрованием через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Профильтрованный раствор хранят в холодильнике и используют в неразведенном виде. При измерении хемилюминесценции (ХЛ) лейкоцитов в присутствии люминола записывают показатели в Inv c дисплея прибора наибольшую цифру из трех, возникающих каждые 1-2 с. Функциональную активность лейкоцитов полости рта изучают в присутствии стимулятора пирогенала, Для этого в 3 кюветы (стимулированный тест) вносят по 50 мкл из осадка лейкоцитов и по 25 мкл раствора пирогенала (коммерческий раствор 25 МПД/мл) и в 3 другие кюветы добавляют по 25 мкл физраствора (контроль).

Кюветы встряхивают, добавляют по 10 мкл люминала и оставляют на 45 мин при 37 С, Через каждые 15 мин кюветы вынимают из термостата и измеряют ХЛ на приборе ЛКВ1250 (Финляндия). Интенсивность ХЛ определяют как светосумму в mv трех измерений, Коэффициент активации лейкоцитов (К) полости рта в присутствии пирогенала рассчиты5 вают по следующей формуле:К = (а-b):а, где а— светосумма ХЛ нейтрофилов в присутствии пирогенала; b — то же самое, без такового. В норме коэффициент активации составляет

- 0,20 — 0,30. При наличии заболевания способ10 ность нейтрофилов к стимуляции низкая (К

0,2). Количество лейкоцитов в пробе составило 10 /мл. Результаты отражены в таблице, 5

Из таблицы видно, что предлагаемый способ позволяет выявить восстановление

15 функциональной активности лейкоцитов полости рта после лечения (до лечения эта активность была снижена, К равен 0,06 и 0,24 соответственно), По известному способу не удалось выявить какие-либо функциональные

20 изменения в лейкоцитах как до, так и после лечения, Объясняется это тем, что в пробе находилось количество лейкоцитов менее

10 /мл, Таким образом, повышение чувствитель25 ности способа делает возможным определение окислительно-восстановительных свойств лейкоцитов в концентрации 10 /мл.

В известном способе для такого определения необходима концентрация клеток не

30 менее 10 /мл.

Формула изобретения

Способ определения функционально-активных лейкоцитов путем выявления окисли35 тельно-восстановигельной способности их хемилюминесцентньгм методом, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения чувствительности, интенсивность хемилюминесценции лейкоцитов измеряют в смыве с

40 полости рта, который смешивают с 10-кратной средой 199, выдерживают при 4 С до полного осаждения клеточной фракции, добавляют к ней люминал в концентрации 10

М, в опытную пробу до введения люминола

45 дополнительно вводят пирогенал в конечной концентрации 25 МПД/мл и по разнице хемилюминесценции до и после введения пирогенала определяют показатель функционально активных лейкоцитов.

1686355

Составитель Г. Будова

Техред М.Моргентал Корректор M. Демчик

Редактор Л. Лашкова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3594 Тираж Подписное .

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5