Способ ферментативной изомеризации глюкозы во фруктозу

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к способам ферментативной изомеризации глюкозы, и может быть использовано в пищевой промышленности для получения фруктозы. Целью изобретения является удешевление способа. Способ заключается в пропускании раствора глюкозы через колонку с адсорбированной на гранулированной DEAE - целлюлозой (GDC) глюкозоизомеразы с последующим получением содержащих фруктозу растворов. На колонке сначала адсорбируют 10-50% фермента от максимальной емкости анионообменника, а для поддержания постоянной активности глюкозоизомеразы в колонке периодически проводят добавление новых порций фермента до тех пор, пока общее количество введенного фермента не достигнет максимальной емкости сорбента. Использование изобретения позволяет удешевить способ на 50-62%. 2 табл, СП С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (н)5 С 12 М 11/00, 9/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 3938656/13 (22) 01.08.85 (31) 636879 (32) 02.08,84 (33) US (46) 15.03.92. Бюл. hh 10 (71) Стабра А.Г. (СН) (72) Норман Е. Ллойд и Ричард Л,Антрим (US) (53) 577.15 (088,8) (56) Иммобилизованные форменты/Под ред. И.В.Березина и др. М„ 1976, т. 1, с, 127-140.

Патент США М 3960663. кл. 195/31, опублик., 1979. (54), СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ИЗОМЕРИЗАЦИИ! ГЛЮКОЗЫ ВО ФРУКТОЗУ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам ферментативИзобретение относится к биотехнологии, в частности к способам ферментативной иэомериэации глюкозы, и может быть использовано в пищевой промышленности для получения фруктозы, Целью изобретения является удешевление способа.

Способ заключается в пропускании раствора глюкозы через колонку с адсорбционно-иммобилизованной на гранулированной

DERE-целлюлозе G DC глюкозоизомеразой с последующим получением содержащих фруктозу растворов. Для поддержания постоянной активности глюкозоизомеразы в колонке необходимо периодически добавлять новые порции растворимого фермента, . 5U 1720492 АЗ ной изомеризации глюкозы, и может быть использовачо в пищевой промышленности для получения фруктозы. Целью изобретения является удешевление способа. Способ заключается в пропускании раствора глюкозы через колонку с адсорбированной на гранулированной ОЕАŠ— целлюлозой .(GDC) глюкоэоизомеразы с последующим получением содержащих фруктоэу растворов. На колонке сначала адсорбируют 10 — 50 (фермента от максимальной емкости анионообменника, а для поддержания постоянной активности глюкозоизомеразы в колонке периодически проводят добавление новых порций фермента до тех пор, пока общее количество введенного фермента не достигнет максимальной емкости сорбента. Использование изобретения позволяет удешевить способ на 50 — 62%, 2 табл. так как в противном случае содержание фруктозы в растворе снижается. С целью эффективного связывания этих порций фермента с анионообменником на нем сначала адсорбируют фермент в количестве 10-50 от максимальной емкости DERE-целлюлозы, а затем периодически добавляют глюкозоизомеразу до тех пор, пока общее количество введенного фермента не достигнет максимальной емкости DERE-целлюлозы.

Изобретение позволяет удешевить способ на 50-62, так как при одинаковой мощности установки для изомериэации глюкозы в предлагаемом способе используются 3 колонки вместо б — 8 колонок по известному способу.

1720492

Пример 1. Для осуществления способа используют гранулированную DEAE-целлюлозу марки GDC, а также микробную глюкоэоиэомеразу. Определение адсорбционной емкости целлюлозы в отношении 5 глюкозоизомеразы показывает, что на 1 г сухого сорбента сорбируется около 584 международных единиц (межд.ед.) фермента.

Начальное фиксирование фермента на грэнулированной 0ЕАЕ-целлюлозе GDC. 10

Носитель GDC частично загружают растворимой изомерээой примерно до 257 до пустимой нагрузки. Готовят суспензию GDC (14,8 г сухой основы) в деионизированнай воде и значение рН устанавливают равным 15 до 6,0 — 7,1. Суспензию деаэрируют s условиях вакуума водяного аспиратора при комнатной температуре в течение 60 мин и затем заливают в стеклянную колонку с двойными стенками Glass Adjustachrom 20 к размером один дюйм в диаметре на 12 дюймов длины, имеющую стеклянное дно, Слой уплотняют на глубину 3,54 дюймов (90 мм), Стеклянные бусинки помещают на верх слоя (4 дюйма или 101 мм) для распределе- 25 ния потока. Гранулированную DEAE-целлюлозу загружают посредством накачки 145 мл (2600 межд.ед. глюкозоизомераз, растворимой изомеразы, проходящей вниз через слой со скоростью 1 мл/мин при 30 комнатной температуре.

Температуру водяной рубашки на колонке устанавливают равной 61 С, 50 -ный раствор кристаллической целлюлозы при значении рН 7.8, содержащим 5 мМ MgS04 35 и 5 мМ МаН$0з, пропускают вниз через слой фиксированной изомеразы со скоростью потока 0,4 мл/мин, Колонка работает

16 ч. Для анализа берут пробу выходящего материала и активность фиксированной 40 иэомеразы определяют по следующему уравнению;

E< = — In и Ie -lo

К Ie — I (1) где Ет — общая активность фиксированной 45 изомеразы, межд.ед.; и — скорость потока, мл/ч;

С- концентрация моносахарида, г/мл;

Кг — постоянная скорости реакции при 61ОС (0,019 г/межд.ед. изомерээы 50 глюкозы /ч);

I — Степень изомеризации выходящего поконцентрация ктозы тока равна концентрация моносэхэридэ

lo — t входящего потока равно 0 для 55 кристаллической декстроэы;

4 — при равновесии равно 0,510 при

61 С.

Степень и ." еризации измеряют поляриметрией счед, ещим образом. Образцы входящего в колонку потока и выходящего потока разбавлчч 20-кратно деионизированной водой и выдерживают в течение 1 ч до достижения равновесия при вращении.

Измерения на вращение проводят на поляриметре модели Перкин Элмер 241 при 25ОС при длине волны ртутного источника 576 нм.

Прибор устанавливают на нуль с водой в ячейке и получают показания в градусах вращения разбавленного входящего и выходящего потоков.

Активность иммобилиэованной изомеразы, определенную данным методом анализаа. соста вл я ет 1548 межд.ед. глюкозоиэомеразы и это указывает на то, что 60 от 2600 ме>кд,ед. растворимой глюкозоизомеразы, загруженной на носитель, составляет активность фиксированной изомеразы.

50%-ный раствор гидролиза кукурузного крахмала, содер кащий 95 декстрозы на сухой основе твердых веществ, 5 мМ MgSO4 и 5 мМ МаН$0з, доводят до рН 7,8 и пропускают в нижнем потоке через слой фиксированной изомеразы при 64 С. Начальный поток через колонку вычисляют по уравнению (1), Конверсия во фруктоэу составляет примерно 4, Этот поток со скоростью примерно 17 мл/ч поддерживают постоянным за исключением времени анализа активности иммобилизованной изомеразы. Содержа гие фруктозы в выходящем потоке измеряют в основном методом, который применяют для определения степени изомериэации. фруктозы = 100! б, где d — содержание моносэхарида в выходящем потоке, выраженное как доля твердых частиц на сухой основе.

Уровень фруктозы постеченно уменьшается в течение 16 дней до примерно 40, после чего осуществляют первую добавку растворимого фермента. Анализ активности показывает, что для компенсирования потерянной активности и увеличения конверсии фруктозы до 447ь требуется примерно 800 межд.ед. изомераэы глюкозы.

Соответственно 40 мл фермента (720 межд.ед. изомеразы глюкозы) добавляют в 126 мл 50 -ного раствора кристаллической декстроэы, содержащего укаэанные соли, Подачу в колонку переключают нэ раствор деьстрозы, содержащий, фермент, и пропускают раствор со скоростью 0,3 мл/мин до истощения. Обнаружено, что выходящий из колонны поток во время процесса адсорбции фермента не со.держит растворимую изомеразу (определе1720492

50 но путем выдерживания в термостате выходящего материала в течение 16 ч при 61 С и измерения повышенного содержания фруктозы). Раствор кристаллической декстрозы продолжают применять как питающий раствор для анализа дополнительной активности фиксированной изомеразы, Затем снова переключают на подачу гидролизата из кукурузного крахмала и уровень фруктозы в выходящем потоке восстанавливается до 44%.

Такая последовательность постепенного снижения уровня фруктозы в выходящем потоке до примерно 40, затем переключение на подачу раствора кристаллической декстрозы для анализа фиксированной изомеразы, добавка растворимого фермента через питающий поток декстрозы, повторный анализ активности фиксированной изомеразы и снова переключение на подачу гидролиэата кукурузного крахмала продолжается в течение 17 недель, В течение остальных 10 недель испытаний последовательность изменяется, исключая анализ активности фиксированной изомеразы до и после добавки фермента. Затем периодически добавляют постоянное количество растворимого фермента. Уровень содержания фруктозы в течение этого времени изменяется только между произвольно установленными пределами 40—

44% при этом скорость потока поддерживают постоянной.

Через 7,5 недель работы активность фермента в колонке удваивается без значительного влияния на работу системы, эа исключением увеличения скорости потока для достижения выхода 40 — 44 фруктозы. После 13 недель работы уровень солей в питающем потоке гидролиэата кукурузного крахмала снижают до 1 мМ MgS04 (с 5 MM) и 2 мМ ИаНЯОз (с 5 мМ).

Анализ для 24 недель испытания выходящего потока, взятого во время загрузки фермента, показывает, что последняя добавка фермента дает значение поглощенного общего фермента

649 межд.ед. иэомеразы глюкозы/г, близкое к его способности, измеренной вначале как 684 межд.ед. изомеразы гл ю козы /г.

Бо время последующих загрузок потеря активности увеличивается, хотя адсорбируется достаточное количество свежего фермента для поддерживания 5 свыше 40% конверсии фруктозы. Тот факт, что фермент все же адсорбируется после превышения начально измеренной способности, указывает на то, что некоторая часть инертного фермента может десорбироваться.

В табл. 1 представлены данные по производству фруктозы и добавке фермента в

27-недельных испытаниях, Количество полученной фруктозы выражено в граммах от

43% сиропа фруктозы на сухой основе.

Пример 2. Осуществляют загрузку колонки, в результате которой растворимая глюкозоизомераза, применяемая для частичной загрузки носителя в начале и во время последующих добавок, имеет высокую чистоту. Операции, осуществляемые в колонке, аналогичны примеру 1, т.е. скорость потока гидролизата кукурузного крахмала поддерживается постоянной, а периодические добавки растворимого фермента в растворе кристаллизсванной декстрозы осуществляют через питающий трубопровод.

Таким образом, в течение 14 недель поддерживают конверсию фруктозы в пределах 40-44%. Загрузка рафинированного гидролизата кукурузного крахмала с 45 твердых веществ содержит примерно 95% декстроэы, 1,5 мм MgS04 и 2,0 мм йанЯОз.

Значение рН входящего материала доводят до 7,8 для получения выходящего потока с рН 7,5, температура слоя фиксированного фермента равнялась 60 С, Как описано в примере 1, в стеклянную колонку добавляют носитель 60С (на сухой основе 7,75 г), Носитель загружают очищенным ферментом примерно до 25 допустимой нагрузки посредством накачки нисходящего потока 50%-ным раствором кристаллической декстрозы (рН 7.8; 5 мМ

MgSO4, 5 MM йаНЯОз), содержащим 136 мл очищенного фермента, разработанного 1:40 (2720 межд,ед. изомераэы глюкозы) со скоростью потока 0,4 — 0,7 мл/мин. В выходящем потоке растворимый фермент не обнаружен. Поток раствора кристаллической декстрозы (рН 7,8; 5 мМ MgS04, 5 мМ

МаНЯОз) используют для анализа, а рубашку колонки снабжают водой, так что температура слоя колонки равна 60 С.

Активность иммобилизованного фермента, определенная методом анализа, который описан в примере 1, равна

1686 межд,ед. глюкозоизомеразы.

Гидролизат кукурузного крахмала пропускают через слой фиксированного фермента, при этом поток регулируют таким образом, чтобы можно было получить 4044 конверсии фруктозы. Скорость потока поддерживают постоянной, т.е. примерно

0,35 мл/мин на протяжении всего испытания. Так как уровень фруктозы уменьшается со временем из-за инактивации фермента, 1720492 то в 50 -ный раствор кристаллической декстрозы {рН 7,8; 5 r-моль MgSO4, 5 г-моль

Na H ЯОз) добавляют примерно 20 мл аликвоты разбавленной и очищенной растворимой иэомеразы, содержащей 434 межд,ед. глюкозоизомеразы, причем раствор накачивают через слой со скоростью примерно

0,4 мл/мин. После адсорбции подачу переключают снова на гидролизат кукурузного кразмала.

В табл. 2 представлены данные по изомеризации и добавке фермента, Как и в примере 1, постоянную конверсию фруктозы поддерживают при постоянной скорости потока посредством периодической добавки растворимой изомеразы, Пример 3. Осуществляют загрузку колонки, при этом использована растворимая глюкозоизомераза высокой чистоты с тем, чтобы первоначально загрузи",ü носитель на 10% его полной емкости и для последующих добавлений, Растворимый фермент, носитель и операции с колонкой такие, как в примере 2, однако используется другая степень начальной загрузки, 87,75 г носителя из примера 2 добавляют растворимый фермент в количестве примерно 10% его емкости при помощи нагнетания по переточной трубе 50%-ного раствора кристаллической декстрозы (рН 7,8; 5 мМ MgS04, 5 мМ МаНБОз), содержащего 55 мл очищенного фермента иэ примера 2, разбавленного в пропорции 1;40 (1088 межд.ед. активности) с объемной скоростью 0,4-0,7 мл/мин. Активность иммобилиэованного фермента составляет

762 межд.ед. в пересчете на активность при абсорбировании 70% фермента.

Гидролизат кукурузного крахмала пропускают через слой фиксированного фермента и поток регулируют таким образом, чтобы обеспечить степень превращения фруктозы 40 — 44 j. Объемную скорость поддерживают постоянной на уровне примерно

0,14 мл/мин на протяжении всего испытания. Когда содержание фруктозы снижается со временем из-эа распада фермента, порцию примерно в 20 мл разбавленного очищенного фермента, содержащего 434 межд,ед., добавляют в 50%-ный раствор кристаллической декстрозы (рН 7,8; 5 мМ

MgSG4, 5 мМ йаН$Оз) и этот раствор нагнетают через слой со скоростью примерно 0,4 мл/мин. После адсорбции колонку снова переключают на постоянный гидролиэат. Постоянную степень превращения фруктозы поддерживают при постоянной объемной скорости при помощи периодических добавлений растворимои изомеразы, acera испытания. Когда уровень фруктозы

30 падает со временем из-за разрушения фермента, порцию в примерно 20 мл разбавленного, очищенного фермента из примера 2, содержащего 434 межд.ед„добавляют в

50%-ный раствор кристаллической декстроэы (рН 7,8; 5 мМ NaHSOg) и раствор нагнетают через указанный слой со скоростью примерно 0,4 мл/мин. После адсорбции сырье снова переключают на постоянный гидролизат. Постоянную степень превращения фруктозы поддерживают при постоянной обьемной скорости при помощи периодического добавления растворимой изомеразы.

При мощности установки 200 т/деньдля получения 42%-ного раствора фруктозы используют 3 колонки.

Таким образом, использование предложенного изобретения позволяет значительно удешевить способ получения фруктозы за счет применения 3 колонок вместо 6-8 (т.е. удешевление на 50 — 62%) при одинаковой мощности установки (200 т/день), Формула изобретения

Способ ферментативной изомеризации глюкозы во фруктоэу. заключающийся в пропускании раствора глюкозы через колонку, содержащую глюкозоизомеразу, иммобилиэованную адсорбцией на анионообменнике, причем растворимую глюкоэоизомеразу добавляют периодиче5

П р и M е р 4. Осуществляют загрузку колонки, flpN этом используют растворимую глюкозоизомеразу высокой чистоты для начальной загрузки носителя до 50% полной емкости и для последующего добавления.

Растворимый фермент, носитель и операции с колонкой те же, что в примере 2 за исключением степени начальной загрузки.

В 7,75 r носителя из примера 2 добавляют растворимый фермент в количестве примерно 50% его емкости при помощи нагнетания по переточной трубе 50%-ного раствора кристаллической декстрозы (pH 7,8; 5 мМ MgS04, 5 мМ МаН$0з), содержащего 270 мл очищенного фермента из примера 2, разбавленного в отношении 1:40 (5440 межд.ед,) с объемной скоростью 0,40,7 мл/мин. Активность иммобилиэованного фермента составляет 3264 межд.ед..при выражении активности в пересчете на адсорбирование 60% фермента.

Гидролизат кукурузного крахмала пропускают через слои фиксированного фермента, а обьемную скорость регулируют таким образом, чтобы обеспечить степень превращения фруктозы 40 — 44%, Объемную скорость поддерживают постоянной на уровне примерно 0,70 мл/мин в течение

1720492

10 — 50 от максимальной емкости ОЕАЕцеллюлозы-GDC, а периодическое давление глюкозоизомеразы проводят до величины, при которой общее количество фермента, 5 добавленного на носитель, не превышает максимальную емкость ОЕАЕ-целлюлозыG DC. ски по мере снижения выхода фруктозы, о тличающийся тем,что,сцелью удешевления способа, в качестве анионообменника используют гранулированную

ОЕАЕ-целлюллозу-GDC, содержание адсорбированной иммобилизованной глюкозоизомеразы устанавливают равным

Т а блица!

На копление фруктозы г при 43ь сухой основы

Доба в ка фермента, межд.ед. изомеразы глюкозы

Накопление фермента, межд.ед. изомеразы глюкозы

Неделя

Средний процент фруктозы

Эффективность фермента. межд.ед., изомеразы глюкозы/г

43 4 фруктозы

43,7

2600

42,5

39,1

42 3

43,1

41,6

3320

39,8

39,5

44,7

6520

44,6

43,5

43,6

7930

41,1

41 4

44,3

40,4

43,4

40,7

8670

10550

43,2

42,7

42,0

43,3

41,9

11490

12430

41,9

44,5

43,0

13200

41,1

2

4

6

8

11

12

13

14

16

17 I8

19

21

22

23

24

26

94,0

770

2059

3606

4851

6533

8292

9891

11298

12379

15293

18302

20476

22789

24856

26764

29322

31298

33733

35433

37949

40162

42264

44497

48811

51011

52737

54528

1,26

0,72

0,68

0,51

0,40

0,34

0,29

0,53

0 43

0,36

0 32

0,29

0,28

0,30

0,27

0,25 .0,26

0,24

0,25

0,26

0,25

0,26

0,25

0,25

0,24

0,24

0,24

1720492

Т а б л и ц а 2

Данные изомеризации и добавки фермента

Эффективность фермента,межд. ед.изомеразы глюкозы/г

43 4 фруктозы

Накопление фермента, междееде изомеразы глюкозы

Добавка фермента, межд.ед. из омераз ы глюкозы

Накопление фруктозы,г при 433 сухой основы

Неделя

Средний процент выхода фруктозы

434

434

434

"34

434

CQcTssNT8é В. Муромец

Редактор И. Привалов Техред М.Моргентал Корректор M. Шароши

Заказ 779 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушскэя наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

2

4

6

8

11

12

13

3154

3588

3588

4022

4022

4456

5324

5324

5758

5758

5758

33,5

41,3

42,9

43,6

42 3

"3,1

41-,6

41,0

41,9

45,1

43,2

42,1

42,4

38,7

1608

3149

4756

6117

8236

9664

12924

16366

18152

21108

22624

1,69

1,00

0,75

0,59

О,"9

0,42

0,40

0,38

0,34

0 33

0,29

0,29

0,27

0,25