Способ определения антителозависимой цитотоксичности лимфоцитов

 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано в различных областях клинической и экспериментальной медицины для характеристики функционального состояния иммунной системы. С цельюупрощения способа в качестве клеток-мишеней используют аутоэритроциты, а регистрация их разрушения проводится : по выходу калия из разрушенных клеток-мишеней с помощью фотометрирования.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5! is G 01 N 3 3/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ пО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4756324/14 (22) 16.11.89 (46) 07.04.92. Бюл. М 13 (71) Киргизский государственный медицинский институт (72) В.Л.Морозов, Д.А.Адамбеков и

Ж.Б.Бошкоев (53) 615.475 (088.8) (56) Grelss Mlchell Agaub. Standartlsatlon a

homologous antybogydenendent cell

mediated citotoxiclty assay for ЫаИп!са! use — Med. Lab. Science, 1988, v, 45, М 1, р.74-;82.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для характеристики функционального состояния имунной системы.

Цель изобретения - упрощение и повышение достоверности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

10 мл крови, полученной путем пункции вены, смешивают с гепарином (20 ед/мл), для осаждения эритроцитов добавляют 1 мл

10 -ной желатины и помещают в термостат при 37 С на 30 мин.. Плазму, обогащенную лейкоцитами, наслаивают на градиент фиколла-верографина плотностью 1,077 и цен-. трифугируют 45 мин при 1500 об/мин..

После центрифугирования взвесь мононуклеарных клеток, извлеченных из интерфазы, . отмывают дважды холодной средой 199.

Промытые мононуклеарные клетки затем суспендируют полной питательной средой, состоящей из среды 199 с добавлением 10ф сыворотки крупного рогатого скота, Ьглю„„5U„„1725125 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛОЗАВИСИМОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ (57) Изобретение относится к медицине, в ° частности к иммунологии, и может быть использовано в различных областях клинической и экспериментальной медицины для характеристики функционального состояния иммунной системы. С целью упрощения способа в качестве клеток-мишеней используют аутоэритроциты, а регистрация их разрушения проводится:по выходу калия из ,разрушенных клеток-мишеней с помощью фотометрирования. тамина (300 мг/мл) и гентамицина (0,08 мг/мл)., Клетки разводят до концентрации

8х10 на мл. . В качестве клеток-мишеней используют аутоэритроциты. Взвесь аутоэритроцитов дважды промывают физиологическим раствором, после этого аутоэритроциты обрабатывают папаином в течение 10 мин.

Промывают один раз физиологическим раствором от папаина. После этого эритроциты разделяют на две пробирки А и Б. Пробирку

А с аутозритроцитами инкубируют гипериммунной антиэритроцитарной антисывороткой кролика в течение 10 мин. После инкубации эритроциты промывают дважды средой 199 и суспендируют до концентрации 8 х10 на мл, чтобы соотношение эффекторов и клеток-мишеней было 10:1.

Цитотоксический тест определяют в пластиковых 96-луночных планшетах (Ленинград, завод Медпалимер). В опытные лунки в триплете добавляют по 0.1 мл аутоэритроцитов, нагруженных антителами, и

1725125

25

69 — 57

79-57

0,1 мл эффекторных клеток в соответствующих концентрациях, контроль ставят в двух вариантах. Один из них — для спонтанного лизиса, где в лунке 0,1 мл аутоэритроцитов, необработанных антисывороткой, и 0,1 мл эффекторные клетки. Другой для определения общего лизиса клеток-мишеней лунки содержит 0,1 мл аутоэритроцитов и 0,1 мл полной питательной среды. Планшеты инкубируют при 37 С, 18 ч во влажной атмосфере воздуха с 5% COz. По истечении этого времени содержимое лунок отсасывают в . центрифужные пробирки и разводят 2 мл физиологического раствора, а второй контроль разводят 2 мл дистиллированной воды для определения общего лизиса клеток-мишеней. После этого центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. 1 мл надосадка отсасывают во флаконы для определения концентрации калия. Степень лизиса клеток-мишеней .регистрируют по выходу калия из разрушенн ых аутоэритроцитов. Для on ределения концентрации калия в надосадке применяют пламенный фотометр ПАЖ-2. Индекс цитотоксичности (ИЦ) вычисляют по формуле

ИЦ- хх.100 % где А — показания фотометра по содержанию калия в опытной пробе;

 — показания фотометра по содержанию калия в первом контроле (спонтанный лизис клеток-мишеней);

С вЂ” показания фотометра по содержанию калия во втором xoHTpoле(общий лизис клеток-мишеней).

Пример 1. Больной П„34 года.

Диагноз: инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого.

Из вены путем пункции в пробирку с гепарином взяли 10 мл крови, добавили 1 мл

10%-ной желатины. Кровь помещали в термостат при 37 С на 30 мин. Плазму с лейкоцитами .отсасывали и помещали. в 2 мл раствора фиколла-верографина плотностью

1,077. Центрифугировали плазму 45 мин при 1500 об/мин, после чего отсасывали интерфазу. Клетки отмывали 2 раза средой

199 и взвесь клеток помещали в полную питательную среду в концентрации 8х10 на мл.

Аутоэритроциты отмывали дважды физиологическим раствором хлористого натрия и обрабатывали папаином в течение 10 мин. Отмывали один раз от папаина и разделили на две пробирки. Аутоэритроциты первой пробирки инкубировали с гипериммунной антиэритроцитарной антисывороткой кролика. После инкубации аутоэритроциты промывали дважды средой

199 и суспендировали до концентрации

8 х10 на мл.

В опытные лунки в триплете смешивали

0,1 мл аутоэритроцитов, насаженных антителами, и 0,1 мл эффекторных клеток в соответствующих концентрациях, контроль ставили в двух вариантах, один из них для спонтанного лизиса, где 0,1 мл аутоэритроцитов, необработанных антителами, и 0,1 мл эффекторных клеток, другой для общего лизиса аутоэритроцитов, где в лунке 0,1 мл аутоэритроцитов и 0,1 мл полной питательной среды. Планшет помещали во влажную камеру с 5% COz на 18 ч при 37ОС. Затем иэ каждой лунки отсасывали содержимое в центрифужные пробирки и разводили 2 мл физиологического раствора, а второй контроль разводили 2 мл дистиллированной воды, Затем центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. 1 мл надосадка отсасывали во флаконы и определяли содержание калия на пламенном фотометре ПАЖ-2.

Результаты определения, опытная проба = 69, первая контрольная проба (спонтанный лизис) = 57, вторая контрольная проба (общий лизис) = 79.

Индекс цитотоксичности

x100% = 54,5 %.

Это свидетельствует о снижении антителозависимой клеточной цитотоксичности лимфоцитов данного больного.

Пример 2. Больной А„43 года.

Диагноз: Сепсис.

Результаты определения, Опытная проба = 65, первая контрольная проба (спонтанный лизис) = 57, вторая контрольная проба (общий лизис) = 79, 65-57

Индекс цито оксич ости 79-57 х100% = 36 6%

Полученные данные также указывают о снижении антителозависимой клеточной цитотоксичности лимфоцитов у больного.

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет упростить определение антителозависимой цитотоксичности по сравнению с прототипом, не снижая ее чувствительности и специфичности. При этом отпадает необходимость в обработке клеток мишеней. радиактивным изотопом (Cr "), дорогостоящего оборудова-, ния (усчетчикоа) и специального помещения для защиты от у-облучения. Способ может применяться практически в любой клинической лаборатории для оценки функциональной активности иммунной системы.

1725125

Формула изобретения

Составитель P.Ã ìåíþê

Редактор М.Стрельникова Техред М.Моргентал Корректор Э;Лончакова

Заказ 1172 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рэушская нэб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Способ определения антителозависимой цитотоксичности лимфоцитов путем инкубирования лимфоцитов с клеткамимишенями, нагру>кенными антителами, с последующей регистрацией разрушения клеток-мишеней, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения достоверности способа, в качестве клеток-мишеней .используют аутоэритроциты, а

5 регистрацию разрушения клеток-мишеней осуществляют фотометрированием по выходу ионов калия.