Способ получения антибиотика s @ , штаммы стрептомицетов - продуценты антибиотика s @

 

Изобретение относится к новым соединениям - антибиотикам и к способам их получения, более конкретно изобретение относится к соединениямантибиотикам, которые могут быть получены посредством ферментации актиномицетов Streptomyces thermoarchaen- sis штамм NC1B12015, или NC1B12111, или NC1B12112, или NC1B12113, или fiC1B12M4 на среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли , при 28-34°С, рН 5,4-7,2 в течение 5-10 сут с последующим выделением целевого продукта антибиотика Sg-,Лормулы он ЈН3 Н J. .,СН3 о снСО HOR где Рм - метил, этил или изопропнл,; 2. водород или метил. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ сОциАлистичесних

РЕСПУБЛИН

{51}5 С 12 Р 1:/06

)) 0()ij

Н ПАТЕНТ У %

CHg

ОН

„CH3

Π— g

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

{21) 3957807/13 (22) 13.09.85 (31) 8423278, 8432519

{32) 14. 09. 84, 21. 12. 84 (33) СВ (46) 30.05.92. Бюл. Р 20 (7i) Глэксо Груп Лимитед (GB) . (72) Д><он Барри Уорд, Хейзл Мэри Ноубл, Нейл Портер, Ричард Алан Флет; тон и Дэвид Ноубл (GB) (53) 615.779.9 (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

8,1 ЛТА1"ПЯ СТРЕПТОЕИЦЕТО — ПРОДУЦЕНТЫ АНТИБИОТИКА S (57) Изобретение относится к новым соединениям — антибиотикам и к способам их получения, более конкретно изобретение относится к соединениямантибиотикам, которые могут быть.получены посредством ферментации актиномицетов Streptomyces thermoarchaensis итамм МС1В12015, или ИС1В12111, или ИС1В12112, или ИС1В12113, или

Изобретение относится к новым соединениям-антибиотикам и способам их получения, более конкретно изобретение относится к соединениям-антибиотикам, которые могут быть получены посредством ферментации организмов

Streptomyces.

Антибиотики S 4 представляют собой группу родственных соединений

Ьормулы I

„„SU„„ I7З8О9О NC1B12114 на среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли, при 28-34 С, рН 5,4-7,2 в течение

5-10 сут с последующим выделением це— левого продукта антибиотика 8,формулы где P.< — метил, этил или изопропил;

Р. — водород или метил. 2 с. и 4 з.п, h-JIbl 3 табл

1738090 более конкретно формулы II

ОН ,СН . СНз

Н Ц7

CHg

Q !

ОН (БЗ

eH3

ОВя

Изобретение распространяется на соединения, имеющие указанные вьппе формулы, как индивидуальные, так и их сочетания. Для определенных областей использования, например в земледелии, в садоводстве или в ветеринарной медицине, более удобным может быть применение Антибиотиков $ < без разделения на индивидуальные компоненты, однако для других областей использования, например в гуманитарной медицине, может быть предпочтительным использование индивидуальных соединений.

Первоначально выделенные антибиотики S, легко разделяются посредством хроматографии на силикагеле на два компонента, которые обладают например, противогельминтной активностью и тушат ультрафиолетовую флуоресцепцию при 254 нм. Компонент I характеризуется значением М 0,7 — 0,75, а компонент II — 0,39 — 0,46, что было определено методом тонкослойной хроматографии на пла.стинах фирмы

Нерк 5735 из силикагеля 60, элюируемых смесью 3:1 хлороформа и этилацетата. Компоненты I u II где R является соответственно группой -СН и

-Н, антибиотиков Б могут быть дополнительно очищены с образованием шести веществ формулы I, обладаюцих активностью антибиотика, например противогельминтной, имеющих общую формулу III где Р. — метильная, этильная или изопропильная групп໠— водород или метильная груп2

5 па.

Эти шесть веществ формулы III обозначим как фактор А (К < — изопропил, R< — водород), фактор В (R1— метил, Р— метил), фактор С (R метил, К вЂ” водород), фактор 0 (R 1— этил, R — водород), фактор E (R этил, R — метил) и фактор F (R изопропил, R — метил). Факторы А и

С являются особенно предпочтительны15 ми

Факторы В, Е и F получают из комйонента I а факторы Л, С и D — из компонента II.

Вещества по изобретению обладают щ активностью антибиотиков, например противогельиинтной, в частности, против нематод, и в особенности активностью против внутренних и внешних паразитов.

В частности обнаружено, что такие вещества являются активными против паразитирующих нематод, например Haemonchus contortus, Ostertagia circumcineta, Trichostrongylus colubiformis.

Dictyocaulus Ч1чьраг1з, Cooperia on«О cophera, Ostertagia ostertagi, Nippostrongylus loraziliensis, и паразирующих клещиков, таких как Sarcoptes sp., Psoroptes sp. Следовательно, эти вещества могут быть использованы

35 при лечении животных и людей, пораженных внутренними и/или внешними паразитами.

Кроме того, было обнаружено, что такие вещества обладают противофунgg, гицидной активностью, например против штаммов Candida sp таких как Candida albicans, Candida glabrata, и против дрожжей, таких как Saccharomyces

carlsbergensis.

Эти вещества также активны против свободно живущих нематод Caenorhabditis elegans.

Кроме того, было найдено, что вецества, полученные по предлагаемому способу являются эффективными при борьбе с насекомыми, клещевндными и нематодными вредителями в продуктах земледелия, садоводства, лесоводства, в хранящихся продуктах и для общего здравоохранения. Вредители почвы и растительных плодов, включая злаки . (например, пшеница, ячмень, кукуруза и рис, овощи (например, соя), фрукты (например, яблоки, виноград и цитру5 17 совые), а также корнеплоды (например, сахарная свекла, картофель) могут быть эффективно уничтожены.

В частности, обнаружено, что пред-. лагаемые вещества являются активными, например, против фруктовых клещиков и тлей, таких как Aphis fàbàå, Aulacorthum curumflexum, 11укпз persicae, et аll, и представителей рода Tria—

leuroides, нематод, таких как представителя рода Aphelencoides, Globodera Hetегоdera et al., чешуекрылых, таких как Hel iothis, Plutella, Spodnptera, каландрин, таких как Anthononus grandis, Sitophilus granarius, мучных хрущаков, таких как Tribal ium

castaneum, мух, таких как Musca domestica, муравьев Рихтера, узкокрылых молей-минеровр Pear рsyllа, Thrips

tabaci, тараканов, таких как В1а е1la germanica, Periplaneta ameri.ñàna,. и комаров, таких как Aedes aegypti.

Вообще эти вещества могут применяться как в отношении хозяина (животного или человека, или растения, или другой растительности), так и в отношении самих вредителей или их очага. Особенно предпочтительными являются факторы Л, I), С, D, Е и Г, которые указаны выше. Вещества, полу- ченные по предлагаемому способу, могут быть. использованы в виде различных лекарственных форм лля введения любым удобным способом в ветеринарии или медицине.

Композиции, в состав которых входят предлагаемые вещества, могут быть использованы для парэнтерального (включая внутригрудное, орального, ректального, местного или имплантного введения. При составлении композиции, которая должна быть стериальной, например инъекция, глазные капли и мази, активный компонент сам может быть приготовлен антисептическим или стерильным, например, после обработки гамма-излучением или окисью этилена.

При использовании в садоводстве или земледелии, вещества, полученные по предлагаемому способу, могут быть включены в рецептуры сухого или: жидкого типов, например дусты, включающие основы дуста, или концентраты, порошки, включающие растворимые или увлажненные порошки, грануляты, включающие микрогранулы или гранулы, способные диспергироваться, таблетки, текучие жидкости, эмульсии, такие как разбавленные эмульсии .или коицентрл38090 6 ты, способные эмульгироваться, жипкости для погружения, такие как погружные жидкости для корней или для семян, оболочки семян, семенные таблетки, масляные концентраты, масляные растворы, инъекции, например инъекции в стебепь, аэрозоли, дымы и туманы.

Обычно такие рецептуры включают соединение в сочетании с подходяцим носителем или разбавителем. Такие носители могут быть жидкими или твердыми и предназначаются для облегчения применения вецества или посредством диспергирования там, где оно должно быть нанесено, .или для обеспечения рецептуры, которая может быть составлена потребителем в виде препарата, способного к диспергированию. Такие рецептуры хорошо известны и могут быть получены традиционными методамп, такими как, например, смешивание и/или размалывание активного компонента(тов) вместе с носителем или разбавителем, например твердым носителем, растворителем или поверхностно-активным веществом.

Твердые носители, подходящие для использования в рецептурах, таких как дусты, грануляты и порошки, могут. быть выбраны, например, из природных минеральных наполнителей, таких как диатомит, тальк, каолин, монтмориллонит, пиро*иллит или аттапульгит.

3S

4О

Сильно диспергированная кремневая кислота или сильно диспергированные поглощающие полимеры могут быть включены в композицию. Используемые гранулированные адсорбирующие носители могут быть пористыми (такими как пемза, размолотый кирпич, сепиолит или бентонит) или непористыми (такими как кальцит или песок). Могут быть использованы подходящие предварительно гранулированные материалы, которые могут быть органическими или неорганическими и включают доломит и размолотые растительные остатки.

Используемые в качестве носителей или разбавителей растворители представляют собой ароматические углеводороды, алифатические углеводороды, спирты и гликоли или их простые эфиры, сложные эфиры, кетоны, амиды кислот, сильно полярные растворители, необязательно эпоксидированные растительные масла и воду.

Также могут быть использованы традиционные неионогенные, катионогенные йли анионные поверхностно-.актив173809 ные вещества, например этоксилирован- ные алкилфенолы и спирты, соли щелочных или щелочно-земельных металлов алкилбенэолсульфокислот, лигносульфокислоты или сульфонаты полимерных фенолов, которые обладают хорошими эмульгируюцими, диспергирующими и/или увлажняющими свойствами, или индивидуально или в сочетании в композициях.

Кроме того, в композициях могут быть использованы стабилизаторы, противослеживаюциеся добавки, регуляторы вязкости, связующие и липкие добавки, фотостабилизаторы, а также удобрения, стимуляторы питания или другие активные вецества, вещества полученные по предлагаемому способу, могут быть использованы в смеси с другими инсекти- 2О цицами, акарицидами и нематоцидами.

В этих рецептурах концентрация активного материала обычно составляет

0,01 — 99% и более, предпочтительно

0,01 — 40 вес.X. 25

Промышленные продукты обычно поставляются в виде концентрированных композиций, которые для использования могут быть разбавлены до соответствуюцей концентрации активного материала, например от 0,001 до

0,0001 вес.%.

В земледелии, садоводстве и в ветеринарии может быть желательным использование цельного hepMeHòàöèoнноro бульона (без разделения его на 35 компоненты или факторы) в качестве источника QKTHBkIbIK вец1еств. Может Х быть удобным использование высушенно(го бульона, содержащего мицелий,,или лизированного мицелия, живого 40 или неживоro мицелия, выделеííîro иэ бульона с использованием методик разделения жидкость - твердое тело или методик выпаривания, или с использованием уерментационного бульона, остаю- фф щегося после выделения мицелия. По желашпо мицелий может быть пастеризован или, ибо более предпочтительно, высушен, например, методами распылительной сушки или сушки на роликах. Щ

Мицелий пли бульон могут входить в состав композиций, включающих традиционные инертные носители, среды для лекарств или разбавители, которые описаны выше.

На основе таксономических исследованьк, конкретным микроорганизмом, способным продуцировать укаэанные выше вещества, является новый вид рода

t trep tomyce s, который был назван

S trep tomyce s thermoa rchaen s is. Образец этого микроорганизма, выделенного иэ почвы, депонирован в постоянную

:коллекцию культур Национальных Коллекций промышленных и морских бактерий (Исследовательская станция Торри, r. Абердин, Великобритания) и ему присвоен номер ИС18 12015, Изобретение также распространяется на любые вещества, которые способны продуцироваться посредством ферментации S. therrzoarchaensis NC18

12015 и которые являются оптическими изомерами.веществ формулы Т.

Организм рода Streptomyces предпочтительно представляет собой Streptomyces thermoarchaensis NC1B 12015 или его мутант.

Мутанты S. thermoarchaensis NC18

12015 могут возникать самопроизвольно или продуцироваться множеством способов. Такие способы включают ионизирующее излучение, химические методы например обработку N-метил! У

N -нитро-N-нитрозогуанидином (НТГ), термообработку, генетические методики, такие как рекомбинация, трансдукция, трансформация, лизогенизация и лизогенное превращение, и селективные методики для самопроизвольных мутантов.

Так, например, получены четыре мутантных ытамма S. thermoarchaensis

JCf8 12015, причем каждый штамм депонирован в коллекции культур Национальных Коллекций промышленных и морских бактерий (Исследовательская станция Торри, r. Абердин, Великобритания) и им присвоены номера NC18

12111, NC 18 12112, NC18 12113 и NC18

12114: S. thermoarchaensis NC18 12111, 12112, 12113 и 1211.4.

Мутантные штаммы NC18. 12111, 12112 и 12113 выведены путем обработки спор S. thernoarchaensis NQfzz

12015 N-метил-N -нитро-N-нитрозогуанидином и затем охарактеризованы одностадийным способом Холлидэя, Мутантный штамм NC18 12114 возник при самопроизвольной мутации S. thermoarchaensis NC18 120 15 и бы идентифицирован как стойкий к стрептомици-, ну, так как оставался жизнеспособным после воздействия сульфата стрептоми цина (100 мгк/мл) при 28 С в течение

5 сут.

1738090 I0

Таксономические исследования показывают, что S. thermoarchaensis МС1В

12015 представляет собой микроорганизм нового вида, характеристики которого описаны ниже.

Па предпочтительнык споруляционных средах — агаре овсяной муки, солодо" во-дрожжевом агаре и крахмальном агаре с неорганическими солями — S.thermoarchaensis NC1B 12015 обильно растет, продуцируя стабильный субстратньп мицелий и воздушный мицелий, порождающий споры в открытых спиральных цепочках в виде боковых ответвлений от основных гиф. На этих средах обратная пигментация желто-коричневая, а спорофоры серые. При стократном, увеличении видно, что спорофоры содержат 2-5 витков в цепочке 5-10 спорами внутри каждого витка спирали.

В среднем спорофоры содержат 20-50 спор. При увеличении в 12 000 в сканирующем электронном микроскопе видно, что споры имеют гладкие стенки и эллипсоидную форму 0,7Х1,4 мкм в наиболее широкой части эллипсоида.

Б.thermoarchaensis i!C1B 1?015 явл,",ется rpar mo roæèòåëürrbì организмом и способен расти и образовывать споры при 20-50 С.

Сравнение приведенных выше данных с опубликованными описаниями в Бергеевском справочнике определительной ,бактериологии показывает, что организм Б.thermoarchaensis NC18 12015 принадлежит к роду Streptomyces.

Идентификацию S.thermoarchaensis

ИС1В 12015 на уровне вида-группы проводят, используя компьютеризированную.иатрицу идентификации.

Ниже приведены результаты 41 таксономического испытания для S.thermoarchaensis NC1B 12015:

Признак Результат

Цепочка спор мутовчатая

Цепочка спор жестко связанная

Цепочка спор прямоизвитая

Цепочка спор спиральная +

Фрагментация мицелия

Поверхность спор гладкая

Поверхность спор морщинистая

Цвет спор серьп +

Цвет спор красньп"

Цвет спор зеленый

Обратный желто-коричневый +Обратньп красно-орацжевьп

Производство меланина

Использование адонитола

Использование целлобиозы

Использование D-фруктозы

Использование Meso-иноэитола

Использование инулина

Использование маннитола

Использование раффинозы

16

Использование рамнозы . Использование D-ксилозы

Использование DL †aëüôaаминомасляной кислоты

Использование 1.-гистидина

Использование L-гидроксипролина

Расщепление аллантоина

Расщепление арбутина

Расщепление ксаптина

Расщепление пектина

Расщепление лецитина

Восстановление нитрата

Производство сероводорода

Устойчивость к азиду натрия (0,01X .вес/об)

Устойчивость к хлориду натрия (77. вес/об)

Устойчивость к фенолу (0,17. вес/об)

Рост при 45 С

Стойкость к неомицину (50 мкг/мл)

Стойкость к рафампицину (50 мкг/мл)

Лнтибиоз к Aspergillus

З5 niger LIV 131

Лнтибиоз к Bacillus subtilis 11С1В 3610

Антибиоэ к Streptomyces

murinus ISP 509 1

Иутан тные штаммы ИС 1 В 1 21 1 1, 12112, 12113 и 12114 все имеют практически аналогичные S.thermoarchaensis существенные признаки. Однако

NC1B 12111 для роста требуется аденин, NC18 12112 — серии, NC1B 12113- — гистидин, а NC!В 1.2114 стоек к стрептоиицину.

11икроорганизмы, способные продуцировать антибиотики S5 <, легко могут быть обнаружены с поиощью удобного мелкомасштабного теста с применением нематод Caenorhabditis elegans, например путем добавления испытуемого образца к суспензии нематод и опреде.. ления последующего воздействия на жизнеспособность последних.

Получение антибиотиков S> < путем ферментации подходящего организма

38090 l1

17

Streptomyces может быть осуществлено традиционными способами, например пу. тем культивирования организма Streptomyces в присутствии источника усваиваемого углерода и минеральных солей.

Источники усваиваемого углерода, азота и минеральных солей могут быть предоставлены простыми либо сложными питательными веществами. Источники углерода обычно могут включать глюкозу, мальтозу, крахмал, глицерин, кормовую патоку, декстрин, лактозу, сахарозу, фруктозу, карбоновые кислоты, аминокислоты, глицериды, спирты, алканы и растительные масла Вообще ис- . точники углерода могут составлять

0,5 - 107. От веса Ьерментационной среды.

Источники азота могут включать муку соевых бобов, жидкости замочки г зерна, растворимые продукты перегонки, экстракты дрожжей, муку семян хлопчатника, пептоны, размолотую ореховую муку, солодовый экстракт, кормовую патоку, казеин, смеси аминокислот, аммиак (газ или раствор), аммонийные соли или нитраты. Также могут применяться мочевина и другие амиды.

Источники азота могут составлять 0,110R от веса ферментационной среды.

Питательные минеральные соли, которые могут быть введены в культураль ую среду, включают соли, способные выделять ионы натрия, калия, аммония железа магния цинка никеля кобальта, марганца, ванадия, хрома, кальция, меди молибдена, бора, фосфора, сульфата, хлора и карбоната.

Для регулирования избыточного вспенивания может присутствовать противо.пенная добавка, которую добавляют периодически по мере надобности.

1(ультивирование организма Strepto"

myces обычно осуществляют при 2050 С, предпочтительно 25-40 С, особенно около 34 С, причем желательно, чтобы культивирование протекало при аэрировании и перемешивании, например, посредством встряхивания и перемешивания. Среда может быть первоначально инокулирована небольшим количеством суспензии микроорганизма, производящего споры. Причем, чтобы избежать задержки роста можно приготовить вегетативный инокулят организма путем инокулирования небольшого количества культуральной среды спорообразующим организмом, полученный ве5

l5

46

55 гетативный инокулят может быть перенесен в ферментационную среду или, что. более предпочтительно, на одну или несколько затравочных стадий, где происходит дальнейший рост до переноса в основную ферментационную среду.

В основном Ьерментация осуществляется при рН 5,5-8 5 предпочтительно

5,5-7 5. берментация может проводиться в течение 2-10 сут, например около

5 сут.

Разделение материала, содержащего антибиОтики 8 541 и любые их компонен ты или факторы, или введение любых их компонентов или факторов осуществляют с помощью традиционных методик выделения и разделения. Антибиотики

S y4 преимущественно содержатся в мицелии клеток, но также могут быть. найдены в ферментационном бульоне.

Выделение может быть проведено до или после осветления ферментационного бульона, выбор методики выделения может широко варьироваться.

Антибиотики Б 4 могут быть выделены и разделены с помощью множества методик фракционирования, например с помощью адсорбции-элюирования, осаждения, дробной кристаллизации и экстракции растворителем, которые могут сочетаться различным образом.

Найдено, что экстракция растворителем, хроматография и дробная кристаллизация являются наиболее пригодными для выделения и разделения веществ, получаемого по предлагаемому способу.

После ферментации мицелий может быть собран с использованием традиционных методик, например фильтрации или центрифугирования. После этого материал может быть экстрагирован из мицелия подходящим органическим растворителем, таким как кетон, ацетон, метилэтилкетон или метилизобутилкатон, углеводород, например, гексан, галоидированный углеводород, например хлороформ, четыреххлористый углерод или хлористый метилен, спирт, например метанол или этанол, или диол, например пропандиол-1,2, или сложный эфир,, например метилацетат или этил-. ацетат. Если мицелии содержат значительное количество воды, то предпоч- тительно использование водорастворимого растворителя.

Для достижения оптимального выделения необходима более чем одна экстl

1738090 14 ракция. Предпочтительно первую экстракцию проводят с использованием смешивающегося с водой растворителя, такого как метанол или ацетон. Антибиотики могут быть выделены в виде сырого экстракта посредством удаления растворителя. Экстракты растворителя ." могут быть сами экстрагированы после уменьыения объема растворителя, например, посредством выпаривания. На этой стадии предпочтительно использовать не смешивающийся с водой растворитель, такой как гексан, хлороформ, хлористый метилен или этилацетат или их смесь, причем для достижения удовлетворительного распределения соединений †антибиотик добавляют достаточно количество воды. При удалении не смешивающейся с водой фазы получают материал, содержащий антибиотики

8 4». фактор В может быть выделен посредством кристаллизации из подходя- щего растворителя, например изопропанола.

Очистка и/или разделение активных компонентов и/или факторов могут быть осуществлены традиционными способами, такими как, например, хроматография (включая жидкостную хроматографию высокого разрешения) на подходящем носителе, таком как силикагель, нефункциональная макросетчатая адсорбционная смола, например, сшитые полистирольпые смолы, такие как амберлит

;:AJ)-2, ХЛЭ-4 или ХЛВ-1180 (фирма "Роом и Хаас, Лтд."), или смола 8112 (фирма Касталл. Лтд."), или совместно с органическим растворителем сшитый декстран, такой как сефадекс ?.Н20 (фирма "Фармация Ю-Кей.Лтд."), или в случае жидкостной хроматографии высокого разрешения — обратимофазные носители, такие как привитой углеводородный силикагель, например С 8привитой силикагель. Этот носитель . может находиться в виде слоя или, что более предпочтительно, набит в колонку. В случае нефункциональных макросетчатых смол, таких как XAD-1180 или 5112, для элиюрования могут быть использованы смеси органических растворителей, например ацетопирил с водой.

Обычно раствор веществ в подходящем растворителе запускается в колонки с силикагелем или сефадексом после первоro уменьшения, объема растворителя. 1-"олонка необязательно может быть промыта и затем элюирована раст30 жет быть разделен с факторами Е и Е путем кристаллизации из спирта, такого как метанол или изопропанол. По желанию, маточные растворы, содержащие факторы Е и Г, могут быть подвергнуты дальнейшей очистке, папри— мер хроматографической на силикагеле, причем факторы Е и F выделяют с использованием жидкостной хроматографии высокого разрешения.

40. После того как эти факторы получены, они могут быть очицены дополнительно посредством кристаллизации, например, из метанола, изопропанола или смеси метанол/вода, и это рас— пространяется на вещества, находящиеся в кристаллическом состоянии.

С помощью подходяцего сочетания указанных выше методик вещества, полученные согласно предлагаемому способу, выделяют в твердом состоянии.

Причем порядок, в котором проводятся указанные выше стадии очистки, и вы- . бор этих стадий для применения могут широко варьироваться.

Так, фактор В был получен как кристаллическое твердое вещество, имеющее степень чистоты выше 90%.

Аналогично факторы А, С, D, Е и F имеют степень чистоты выше 90%. Одна50

55 ворителем подходяцей полярности. В случае сефадекса и силикагеля в каче-I стве растворителей могут быть использованы спирты, такие как метанол, углеводороды, такие как хлороформ или хлористый метилен, или сложные эфиры, такие как этилацетат. Кроме того, могут применяться сочетания таких

10 растворителей или без воды, или с водой.

3а ходом элюирования и разделения/

/очистки веществ можно следить, используя традиционные методики, такие как хроматография, например тонкослойная хроматография и жидкостная хроматография высокого разрешения.

При хроматографировании на силика— геле, предпочтительно с использованием элюента, такого как смесь хлороформ:этилацетат, антибиотики Б легко разделяются на компоненты I u

II, причем компонент I элюируется первым. Затеи легко могут быть получены из компонента I факторы В, Е и

Г с использованием, например, жидкостной хроматографии высокого разрешения. Аналогично, факторы А, С и D легко могут быть выделены из компонента II. Альтернативно фактор В мо16

1738090

12,5

1ь5

Оь 125

1,25

25,0

12 5

1ь5

0,125 ко эти факторы используются со степенью чистоты, соответствующей их предполагаемому использованию: для применения в медицине желательна степень чистоты по меньшей мере 90 ь предпочтительно выше чем 95 ) для использования в ветеринарии, земледелии или садоводстве достаточны степени чистоты, например, 50 . или ниже.

Изобретение иллюстрируется примерами, где приняты следующие сокращения: ТСХ вЂ” тонкослойная хроматогра.фия (с использованием пластинок фирмы Иерк 5735 с силикагелем 60, проявленных смесью (3:1) хлороформ:этилацетат) ХК вЂ” хроматография на колонке фирмы клерк 7734 с силикагелем 60 (колонка длиной 200 и диаметром 4 см), элюируемой смесью (3:1) хлороформ! этилацетат1 NKBP - жидкостная хроматография высокого разрешения, ПЭ— петролейный эфир (т.кип. 60-80 С).

Среды Л, В и С, которые упоминают-. ся в примерах, имеют следующий состав.

Среда A г/л."

D-Глюкоза 15,0

Глицерин 15,0

Соевый пептон 15,0

Хлористый натрий 3,0

Углекислый кальций 1,0

Дистиллированная вода До 1 л рН доводят до значения 7,0 водным раствором едкого натра до ныдерживания н антоклаве.

Среда В, г/л:

D-Глюкоза 2,5

Солодоный декстрин М

30Е (фирма "Рокуетт, Лтд." Великобритания) 25,0

Лрказой 50 (фирма "Бритиш Лркади Ко., Лтд.")

Кормовая патока

К НРО4

Карбонат кальция

ИОР G $3- (11-морфолино)пропансульфокислотаД 21, 0

Дистиллированная вода До 1 л рН доводят до значения 6,5 водным

5 н. раствором едкого натра до ныдерживания в автоклане.

Среда С, г/л:

В-Глюкоза 2,5

Солодовый декстрин ИД

30Е (фирма "Рокуетт.

Лтд." Великобритания)

Лрказой 50

Свекольная патока

К ПРО4.

0,5

5,0

Углекислый кальций 1,25 силикон 1520 (фирма "Доу

Корнинг") 0,625

Дистиллированная вода До1л рП доводят до 6,5 до стерилизации.

Пример 1. Споры Streptomyces

thermoarchaensis UC1B 12015 инокулируют на скошенный агар, состояций из следуюцих компонентов, г/л:

Дрожжевой экстракт (фирма "Оксоид Ь21")

Солодовый экстракт (фирма "Оксоид Е39") 30,0

Иикологический пептон (фирма "Оксоид L40")

Лгар Р 3 (фирма "Оксоид

1.13") 15,0 значение рН около 5,4, и культивируют при 28 С в течение 10 сут. Затем созо ревший скошенный агар покрывают 10Хным раствором глицерина (6 мл) и соскабливают стерильным инструментом для того, чтобы разрыхлить споры и мицелий. Лликвоты (0,4 мл) полученной суспензии спор переносят н стерильные полипропиленовые соломки, которые затем термически запаивают и хранят в парах жидкого азота до употребления. . Содержимое отдельной соломки исЗО пользуют для инокулирования 10 мл . среды Л, которую затем культивируют при 28 С н течение 3 сут на качалке, о врацающейся со скоростью 250 об/мин с диаметром орбитального движения

З 50 мм. Эта культивируемая среда используется,для инокулирования (в количестве 2 ) 15 пробирок и двух колб

Эрленмейера (емкостью 250 мл), содержащих соответственно 10 мл и 50 мл

40. среды В.

Пробирки и колбы культивируют при

25С в течение 5 сут, а затем культу" ры раздельно фильтруют под вакуумом и клетки встряхивают в течение 30 мин

45 с метанолом, взятым в количестве, равном объему фильтрата культуры.

AKTHBHocTb npoTHB Caenorhabditis

elegans определяют в экстрактах клеток,выращенных в пробирках и колбах.

ЗО Мицелиальные экстракты объединяют, выпаривают досуха и повторно экстрагируют метанолом до концентрата (6 мл), который подают в колонку, заполненную сефадексом Н20 (110х2,5 см) и элюированную метанолом. Собирают фракции по 10 мп.

Фракции 21-28 сгруппировынают и выпаривают с образованием маслянистого остатка (156 кг), который экстра17

1738090 18 гируют смесью (3:1) хлороформ:этилацетат. Получают 3 мл экстракта, который подвергают ХК (колонка 55 х

3 2 5 см), собирают фракции по 10 мл и анализируют методом ТСХ, используя пластины, содержащие флуоресцентньп индикатор, Фракции 20-23 и 36-44 вызывают две главные области, которые тушат флуоресценцию, их идентифицируют как компонент 1 (Rf 0,70) и компонент II (Rf 0,43). При выпаривании фракций 20-23 получают компонент I в твердом виде (9 мг) В максимумах поглощения при

238, 245 и 254 нм величины E равны соответственно 340, 350 и 200.

При выпаривании фракций 36-44 получают компонент II в твердом виде (11 мг). В максимумах при 238, 245 и 254 нм величины Е составляют соответственно 440, 460 и 280.

Пример 2. Каждую из двух колб Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащую по 50 мл среды А, инокулируют 0,2 мл суспензии спор Streptomyces thermoarchaensis NC1B 12015, взятой из соломки, приготовленной, как описано в примере 1. Колбы культивируют при 28ОС в течение 3 сут на качалке, вращающейся со скоростью

250 об/мин с диаметром орбитального движения 50 мм. Затем содержимое обеих колб используют для инокулирования сосуда-ферментера емкостью 20 мл, содержащего 12 л среды В. Через 5 сут роста производят сбор клеток культуры, которые обрабатывают, как описано в примере 3.

Пример 3. через 5 сут культивирования при 28 С ферментационного о бульона (12 л), полученного, как описано в примере 2, производят сбор клеток, которые центрифугируют со скоростью 4200 об/мин при 10 С в тео чение 15 мин. Лепешку из клеток смешивают с 5 л метанола и выдерживают при 4 С в течение 20 ч. Мицелиальный экстракт фильтруют, выпаривают при

40 С и подвергают азеотропной перегонке после добавления 100 мл бутанола-1. Затем экстракт обрабатывают метанолом (5 раз по 200 мл), объединенные экстракты выпаривают до объема

100 мл и подают на колонку с сефадек сом I.Í20 (112XS см). Колонку элюируют метанолом и после пробного прохождения 200 мл собирают, фракции по 50 мл.

Фракции 40-90 группируют и выпаривают, получая 3,85 г маслянистого ос35

55 дает три пика со значениями Rf 0,390,46, эти три пика были приписаны факторам А, С и D.

Фактор А, элюированный из колонки

ЖХВР между 260 и 340 мл после введения образца, имеет значение Rf 0,44, найденное методом ТСХ. Фактор В элюируют из колонки ЖХВР между 270 и

310 мл после введения образца, причем он имеет значение Rf 0,62, найденное методом ТСХ. Фактор С элюируют из колонки ЖХВР между 160 и 180 мл после введения образца, причем он имеет значение Rf 0,4, найденное методом ТСХ. Дополнительные характеристики факторов А, В, С и D описаны нине.

Пример 4. Используют 0,4 мл суспензии спор организма Я герСошусез

thermoarchaensis NC1B 12015, взятой из соломки, приготовленной как описано в примере 1, для инокулирования

50 мл среды А, содержащейся в колбе

Эрленмейера емкостью 250 мл. Колбу культивируют при 28 С в течение 4 сут на качалке, вращающейся со скоростью

250 об/мин с диаметром орбитального татка. Этот остаток экстрагируют

77 мл смеси (3:1) хлороформ:этилацетат, фильтруют и затем подвергают разделению на ХК, причем после пробного прохождения 200 мл собирают фракции объемом около 15 мл.

Фракции 124-142, содержащие компонент I, группируют и выпаривают, получая 253 мг твердого вещества, из которых 216 мг очищают методом >КХВР (колонка с фазой Зорбакс ODS, 25 2, 1 см, элюент 80Х ацетонитрила/вода). Фракции 250-320, содержащие компонент II, группируют и выпаривают, получая 602 мг твердого вещества, из которых 540 мг очищают методом НХВР (как для фракций 124-1.42) и собирают фракции из нескольких опытов.

Э поируемый из колонки НХВР материал просматривают методом УФ-спектроскопии при 243 нм. Вещества, имеющие пики поглощения при этой длине волны, высушивают и испытывают на активность против Carnorhabditis elegans, а так-. же анализируют методом TCX. Четыре вещества, которые обладали активностью против Caenorhabditis elegans, также имеют значение Rf 0,39-0,46 илп

0,70-0,75.

ЗО Компонент I дает один пик со значением Rf от 0,7 до О, 75, этот пик был приписан фактору В. Компонент II

19 17 движения 50 мм. Затем используют порции по 8 мл рпя того, чтобы инокулировать каждую из двух плоскодонных колб, содержащих 400 мл той же среды, и затем культивируют в тех же самых условиях в течение 3 сут.

Содержимое обеих колб затем используют для инокулирования сосудаферментера емкостью 70 л, содержащего .40 л среды В, дополненной силиконом

525 (фирма "Доу-Корнинг, 0,0625 об/об. ). Ферментацию проводят с перемешиванием и аэрированием, которое обеспечивает поддержание концентрации растворенного кислорода на уровне более 20Х от насыщения, причем при необходимости добавляют силиконовый антивспениватель. Через 10 .сут проводят сбор ферментационных клеток, причем бульон (40 л) осветляют центрифугированием (1500 об/мин). Жидкость над осадком заменяют на воду (5 л) и выделенные клетки (1,4 кг) о замораживают при -20 С.

Через неделю замороженные клетки оттаивают, суспендируют в 15 л метанола и осторожно перемешивают 15 ч.

Затем суспензию фильтруют и твердый

Ф остаток повторно.экстрагируют метанолом (10 л). Объединенные фильтры (25 л) разбавляют водой (12 л) и экстрагируют петролейным эфиром (25 л)." .Через 30 мин Лазы разделяют центрифугированием.

Нижнюю метанольную фазу снова экстрагируют петролейным эфиром (3 раза:

25, 15 и 15 л). Объединенные фазы петролейного эфира (80 л) концентрируют, пропуская три раза через тонкопленочный испаритель пфаудлер 8,8127-27 (давление паров 0,1 бар, температура паров 20 С, температура водяного пара 127 С), и концентрат (8 л) сушат сульфатом натрия (1 кг) и дополнительно концентрируют при поо ниженном давлении и 40 С в роторном пленочном испарителе. Иаслянистый остаток (15 мл) растворяют в смеси хлороформа и этилацетата (70 мл, 3 1 об/об.) и подвергают разделению на ХК, собирая фракции объемом около

40 мл после пробного прохождения

1400 мл.

Фракции 45-65 объединяют и выпаривают,.получая фактор В (940 мг, как указано в примере 3), который дважды перекристаллизовывают из метанола и окончательно из нитрометана. Кристял20

27,8

13 9

1,7

0,14

1,39 нинг) О, 067 (об/об.)

Ро стерилизации доводят рН до 6,5.

Ферментацию проводят при 28 о0 с перемешиванием и аэрированием, обес/ печивающим поддержание концентрации растворенного кислорода на уровне более 20Х. от насыщения. Через 2 сут

50 доводят рН до 7,2 добавлением серной кислоты. Через 5 сут ферментации проводят сбор клеток культуры.

Бульон (450 л) осветляют путем центрифугирования и жидкость над осадком заменяют водой (20 л). Выделенные клетки (25,5 кг) перемешивают в течение 1 ч в таком количестве метанола, чтобы общий объем смеси сос38090 лы подвергают рентгеновскому дифракционному анализу монокристаллов, из которого следует, что кристаллы представляют собой орторомбические прозрачные призмы с параметрами; а =

10, 171/3/, Ь = 13,317/5/, с

25,032-7/, А, объем ячейки 3391 А, Е = 4, пространственная группа Р212г21, Эо = 1,18 г/см, R = 0,053 для 2169 независимо наблюдаемых отражений (@ меньше 58 ), измеренных дифрактором с Cu-I -излучением (длина волны

1,54178 А) .

Пример 5. Инокулят Streptomyces thernoarchaensis NCIB 12015 готовят, как описано в примере 4, причем период роста составлял 2 сут, и используют его для инокулирования сосуда-ферментера (70 л), содержащего

40 л среды В, дополненной полипропиленом 2000 (0,065 об/об.7) вместо силикона 525. Полипропилен 2000 добавляют по мере необходиМости на протяжении ферментации для того, чтобы уменьшить вспенивание. Ферментацию проводят при 28 С с перемешиванием о и аэрированием, которое обеспечивает поддержание концентрации растворенного кислорода на уровне более 307. от

30 насыщения. Через 24 ч ферментации . порцию бульона (1 л) переносят в hepментер (700 л), содержащий 450 л среды, имеющей следующий состав, г/л:

D-Глюкоза 2,8

35 Солодов >>< декстрин (M ЗОВ)

Лрказой 50

Кормовая патока

K IIP0g

40 cacns

Силикон 525 (Доу Кор17

21 тавлял 75 л. Суспензию фильтруют, твердый остаток повторно экстрагируют

35 л метанола и фильтруют. Объединен-, ный Ьильтрат (87 л) разбавляют водой»(40.л) и экстрагируют петролейным эфиром. Через 30 мин фазы разделяют центрифугированием, и нижнюю метанольную фазу повторно экстрагируют петролейным эфиром (30 л) после добавления 40 л воды. После разделения нижнюю, фазу снова экстрагируют 30 л

ПЭ. Объединенные фазы петролейного эфира (85 л) концентрируют, пропуская

3 раза через тонкопленочный испаритель пфаудлер 8,8-12V-27 (давление паров О, 1 бар, температура паров

20 С, температура водяного пара

127 0). Концентрат (9 л) сушат сульфатом натрия (2 кг) и дополнительно концентрируют при пониженном давлении при 40 С в роторном пленочном испарио теле. Маслянистый остаток (130 r) растворяют в хлороформе, получая

190 мл смеси, котору«о подвергают разделению на ХК (набивная колонка, промытая 500 мл хлороформа), собирают фракции объемом около 40 мл после пробного прохождения 1400 мл.

Фракции 32-46 объединяют и выпаривают, получая 21,2 r масла. Фракции

47-93 объединяют и выпаривают, получая 20,1 r масла, которое растворяют в смеси (3:1) хлороформ:ЭА до объема

50 мл. Раствор разделяют на ХК, собирая фракции объемом около 40 мл после пробного прохождения 1400 мл.

Фракции 22-23 объединяют и выпаривают, получая 3 1 r м,асла, которое добавляют к маслу, полученному из фракций 32-46 на первой колонке. Объединенные масла растворяют в кипящем метаноле (4 мл) и затем этот раствор добавляют к 20 мл горячего пропанола-2, получая при выдерживании кристаллический фактор В (2,57 г).

Маточный раствор после кристаллизации фактора В выпаривают, получая масло, которое растворяют в равном объеме хлористого метилена, и раствор подают на колонку (30x2,2 см) с фазой мерк кизельгель 60 (70-230 меш, АБТИ х

¹ 7734), заполненной в хлористом метилене. Слой промывают CHzC1@ (вдвое больше объема слоя) и элюируют смесью (3:1) хлороформ:этилацетат (2 объема слоя). При выпаривании элюата получают масло, которое растворяют в метаноле и подвергают препаративному разделению методом РХВР на

38090 с*ерисорбе S50DS-2 (250 «»20 мм фирма

"Фэцз Сеп. Лтд."). Образец объемом

5 мл прокачивают через колонку в течение 1 мин и колонку элюируют смесью

S (7:3) ацетонитрил:вода при следующих условиях:

Время, мин Поток, мл/мин

0,00 0,00 (Время

1,00 0,00 ввода

1,10 30,00 пробы)

39,90 30,00

40,00 35,00

75,00 35,00

Элюируемый из колонки ЖХВГ материал анализируют методом УФ-спектроскопии при 238.нм. При выпаривании объединенных фракций имеющих пик

7 Р эл«о«»руемый на 26,3 минуте, получают фактор E в твердом виде. При выпаривании объединенных фракций, имеющих пик, элюируемый на 36,4 минуте, получают фактор Р в твердом виде.

Пример 6. Ферментационный бульон (аналогичный примеру 2) с урожаем клеток культуры через 117 ч обрабатывают в автоклаве (121 С, 1 ч), охлаждают до комнатной температуры и перемешивают на магнитной мешалке, получая гомогенную суспензпю клеток, Две порции суспензии (2 мл) центрифу- гируют (ускорение 12 000 g, 2 мин, комнатная температура), декантируют жидкость над осадком и осажденные клетки суспендиру»от в 2-мл воды, тщательно смешивают и снова подвергают центрифугированию (12 000 g, 2 м«ш, комнатная температура). После декантации жидкости над осадком клетки дважды промывают дистиллированной во40 дой (порции по 2 мл). Затем промытые клетки тщательно смешивают с водой (2 мл) или с метанолом (2 мл) и выдерживают при комнатной температуре при периодическом встряхивании в те4$ чение 1,5 ч. Суспензию снова центрифугируют (12 000 я, 2 мин, комнатная температура) и надосадочные жидкости последовательно разбавляют в воде.

Клетки из водных суспензий повторно щ суспендируют в воде и немедленно последовательно разбавляют водой, Порции (10 мкл) каждого из разбавлений добавляют к суспензии (200 мкл) нематод Caenorhabditis elegans в буфер-. ном растворе, содержащим„ г/л: гидрофосфат натрия 6, гидрофосфат,калия 3) хлорид натрия 5, семиводный сульфат магния 0,25 — и имеющем рИ

7, 0 ° Через 4 ч суспензию нематод ис 23

17 следуют, чтобы установить, какие разбавление испытуемой смеси вызывают полное ингибирование подвижности бо- лее чем 983 нематод в анализируемой суспензии. Было найдено, что разбав ления метанольного экстракта 1:5, 1:25, 1:250 и 1:500, разбавления клеточной суспензии 1:5, 1:25, 1:250, t".500 и 1:1000 и разбавления водного. экстракта 1:2, 1:4 и 1:8 вызывают такое пнгибирование нематод, когда

10 мкл добавляют к 200 мкл суспензий нематод.

Пример 7. 50 мл среды А или среды В в колбе Эрлемейера емкостью

250 мл инокулируют 0,4 мл суспензии спор S.thermoarchaensis NC1В 12015, взятой из соломки, приготовленной, как описано в примере 1. Колбы, содерх<ащие среду A или В, культивируют при 28 С в течение 2 сут на роторной качалке, работающей в режиме .

250 об/мин с диаметром хода 50 мм.

Затем из каждой среды берут порции (8 мл) для инокулирования плоскодонных колб емкостью 2 л, содержащих

400 мл той же самой среды (А или В соответственно). Эти колбы культивируют в течение 2 сут при тех же усло-виях.

Два ферментера емкостью 70 л каждый инокулируют двумя колбами среды

Л и один 70-литровый ферментер инокулируют двумя колбами среды В. Каждый йерментер содержит 40 л среды С.

Ферментацию проводят при 34 С пео ремешивацием и аэрированием, достаточным для поддержания концентрации растворенного кислорода свыше 303 от насыщения. Приблизительно через 24 ч

*ерментации значение рН смеси доводят до 7,2 добавлением водного раствора серной кислоты. При необходимости добавляют антивспениватель — полипропиленгликоль 2000. Через 5 -сут проводят сбор клеток, которые объединяют. !

70-литровыи ферментер, который такх<е инокулируют двумя колбами, содерх<ащими среду В, содержит среду В с добавлением 0,067 силикона 1520.

Ферментацию проводят при 28 С с перео мешиванием и аэрированием, достаточными для поддержания концентрации растворенного кислорода на уровне свыше

307 от насыщения. При необходимости для уменьыения вспенивания добавляют полипропиленгликоль 2000. Через 24 ч порцию 9 л переносят в Ферментер емго эфира (85 л) концентрируют на тон50 копленочном испарителе (давление паров О, 15 бар, температура паров 26 С) .

Концентрат (3 л) сушат сульфатом натрия (2 кг) и затем дополнительно выпаривают при пониженном давлении и

40 С. Полученное масло (639 r) растворяют в.300 мл смеси хлороформа и этилацетата (3:1,. об/об,), фильтруют и промивные жидкости (1060 мл) разде-

38090 24 костью 700 л, содержащий 450 л среды С. о берментацию проводят при 34 С с перемешиванием и аэрированием, достаточными для поддержания концентрации. растворенного кислорода на уровне . свыше. 303 от насыщения. Вспенивание регулируют добавлением полипропиленгликоля 2000 и приблизительно через

24 ч рН среды доводят до 7,2 добавлением водного раствора серной кислоты. Через 4 сут ферментации собирают клетки культуры, которые объединяют

15 с тремя описанными выше продуктами ферментации.

Объединенные бульоны с клетками центрифугируют на центрифуге "Шарплес

АЯ16РУ" со скоростью около 120 л/ч.

Остаточную жидкость над осадком в центрифугируемых сосудах заменяют на воду.

Выделенные клетки (11,65 кг) суспендируют в 33 л метанола с помощью смесителя Силверсона. Через 60 мин суспензию фильтруют через киперную ткань и остаток еще раз суспендируют в 34 л метанола. Через 40 мин суспен.зию снова сзильтруют. Фильтраты от двух метанольных экстракций объединяЗ -О ют.

Объединенные экстракты (53,5 л) смешивают с 27 л воды и. 27 л петролейного эфира. После перемешивания в течение 20.мин две фазы разделяют на центрифуге "Вестфалия ИЕИ 1256". Нижнюю водно-метанольную фазу (70 л) смешивают с водой (37 л) и петролейным эфиром (27 л), перемешивают и разделяют, как и раньше. Иежфазную

jQ, эмульсию в *азе петролейного эфира разбивают ацетоном (4 л). Нижнюю водно-метанольную фазу (108 л) затем смешивают с водой (40 л) и петролейным эфиром (27 л) в третий раз, перемешивают и разделяют, как и раньше, причем для разбиения мех<фазной эмульсии используют 4 л ацетона. Затем три гексановых экстракта объединяют.

Объединенные экстракты петролейно25 17 ляют на ХК (1500 мм, диаметр 100 мм), элюируя со скоростью потока 6 л/ч.

Фракции, элюируемые между 8,8 и

13,1 л, объединяют и выпаривают при низком давлении, получая 56,3 г мас" ла, фракции, элюируемые между 13,1 и 24,6 л, упаривают аналогично, получая светло-желтое твердое вещество (153,4 г). Первые фракции в основном содержат фактор В, тогда как последние фракции содержат смесь факторов

А, В, С и D. Фактор В в этой последней фракции последовательно удаляют при повторении разделения на ХК, как описано выше, дважды (последний раз на свежем силикагеле) при аналогичных условиях за исключением того, что скорость потока была снижена до

3 л/час.

Пики веществ, содержащих факторы

А, С и D, из второй из указанных ко.лонок элюируют между 8,8 17,6 л, 1остаточный фактор В, который она содержит, разделяют на третьей колонке, из которой факторы Л, С и D элюируются между 14 и 28 л. Этот окончательный объединенный элюат упаривают при пониженном давлении, получая

114 г твердого вещества. Пики веществ, содержащих фактор В, из двух колонок -(7,5-8,8 л и 10,3-13,4 л соответственно) выпаривают до масла (соответственно 10, 7 и 10 r) и объединяют с маслом, полученным на первой из этих трех колонок.

Иасла, содержащие фактор В, растворяют в кипящем метаноле (25 мл) и

Ь смешивают с кипящим пропанолом-2 (100 мл). При охлаждении до 4"С фактор В кристаллизуется. Кристаллы отфильтровывают, промывают метанолом (200 мл), охлаждают до -20 С и сушат в вакууме, получая 25,3 г фактора В.

Твердое вещество из третьей силикагелевой колонки, в котором содержатся факторы А, С и D, сушат в вакууме до постоянного веса (87 г). Образцы (20 г) этого твердого вещества растворяют в 190 мл метанола и доводят до объема 230 мл смесью (7:3 по объему) ацетонитрила и воды. Затеи порции (5 мл) этого раствора разделяют на хроматографической колонке (250 мм, диаметр 21,2 мм) со сферисорбом ODS — 2 (частицы диаметром

5 мкм), используя в качестве элюирующего растворителя смесь (7:3) ацетонитрила и воды. Скорость потока элюента поддерживают равной 20 мл/мин

38090 26 приблизительно в течение.10 с, затем ее постоянно увеличивают до 34 мл/мин в течение 22-минутного периода и эту скорость поддерживают еще в течение

3 мин. Элюируемые факторы детектируют при длине волны 238 нм. Фактор С элюируют между 11,0- и 13,4-й минутами. Фактор 1> " между 13,4- и 17,4-й минутами и Фактор А между 17,4- и

23,0-й минутами.

Содер>кащие фактор С фракции из каждого хроматографического разделения объединяют и выпаривают при низ15 ком давлении pо твердого вещества.

Фракции, содержащие фактор А, аналогично выпаривают до твердого вещества. Фракции, содержащие фактор

D, также объединяют и выпаривают, по20 лучая неочищенное твердое вещество (7 г). Пооледнее вещество снова растворяют в метаноле (65 мл), смешивают с водным ацетонитрилом (30 об.Ж воды) и повторно разделяют хромато>рафически на колонке со сферисорбом ODS-2, как описано выше, с тем исключением, что при разделении поддерживают постоянным поток элюента 20 мл/мин. Теперь фактор D элюируют между 16- и

20-й минутой, и эти фракции из каждого хроматографического разделения.. объединяют. Объединенные элюаты выпаривают до твердого вещества. Три твердых вещества, содержащие факторы А, С и D, высушивают над Р О в вакууме до

З5 постоянного веса (55; 7,0 и 1,21 г соответственно).

Показано, что каждое из четырех твердых веществ, выделенных в этом способе, аналогично образцам факторов ф А, В, С и О.

Пример 8. 50 мл среды В, содержащейся в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, инокулируют суспепзией спор организмов Streptomyces thermoarhaensis NC1B 12111, 12112, 12113 и

121.14 (по 0,5 мл), взятой из соломок, приготовленных, как описано в примере 1.

Колбы, содержащие S. thermoarhaensis НС1В 12111, NC1B 13112 н NC1B о

12113, культивируют при 31 С на роторной качалке. Колбу, содержащую

S.thermoarhaensis 12114, культивируют

5 при.28 С в течение 2 сут и затем 1 мл о бульона переносят в другую колбу Эрленмейера, содержащую 50 мл среды B.

Эту колбу культивируют при 31>С на роторной качалке. Все, колбы встряхиТаблица 1

612,37

598,35

584,34

598,35

612,3638

626,3807

С, Н 0 8

C3s Н500 8

15 С

Cy4.Н48О 8

С, Н„08

С., Н,08

С Н,-408

-е ББА Мол.

Фактор +е ББА вес

A И/Е635(И+Ба)

11/Z613(И+Н)+

M/Z611 (М-Н) 612

В М/Е691 (М+Н+глицерин, М/Е599(И+Н)"

И/Е581(МН-Н О)

M/Z563 (ИН-21;20)

С N/2607(È+Nà) 598

M/Z583(M-H) 584 М/Е597(И-Н) 598

D М/Е621(M+Na) 173 вают со скоростью 250 об/мин при диаметре хода 50 мм.

Через 4 сут культивирования центрифугируют 10 мл образца каждого бульона при ускорении 1250 g в течение

45 мин и обрабатывают, как указано ниже. 11идкость над осадком сливают и таблетку осадка повторно суспендируют в 10 мл метанола. Суспензию тща тельно встряхивают и выдерживают 1 ч при периодическом перемешивании. 3атег» суспенэию центрифугируют при

10 000 g в течение 5 мин и жидкость над осадком анализируют методом 8ХВР (колонка 85 ODS-2, 10 см, диаметр

4,6 мм, элюент 707-ный ацетонитрил/

/0,1 И раствор дигидрофосфата аммония). Гики веществ анализировали при

246 нм.

В каждом случае анализ ЖХВР показал наличие факторов А, В, С и О, 11 р и м е р 9. Установлено, что факторы А, В, С, D, Е и F содержат только углерод, водород и кислород.

Иетодом масс-спектроскопии электронного удара (ИСЭУ) были получены

Иетодом масс-спектроскопии полевой десорбции для фактора Е были получены следующие результаты: М/Z 612И+, а для фактора Г - M/Z 62.61i+.

В спектре ИСЭУ фактора A при точном измерении масс отмечены ионы: при

61 2, 37 — С Н 08, 466, 31 — С о Н 4 04, 448,30 — СэбН4оО, 425,23 — С 6Н О, 354, 22 — С Нэо0, 297, 22 — С «Н э0 .278,11 — С«5Н « 0з; 247,17 — С«611 зОг °

219,18 - C»5Н2ЬО, 95,05 — С6Н О.

В спектре ИСЭУ фактора В йр»» точном определении масс отмечены ионы: прп 598,35 — CSWHsa081 438,28

С28НэВ04 420,26 — 314,19 — Czphz«;O, 248,14 - С»уНаоОэ, 151,08- С Н»102.

8090 28 результаты для факторов А, В, С, D, Е и F (приведенные в табл. 1).

Фактор Молекулярньп» Соответствующая ион молекулярная

1О формула

Методом масс-спектроскопии с бомбардировкой быстрыми атомами (ИС-ББА) были получены результаты, приведенные в табл. 2. б

Таблица 2

В спектре ИСЭУ фактора С при точ45 ном определении масс отмечены ионы: при 584, 34 — C 4.H <80<, 566, 33 — С„ Н4,0.„

438,28 — С28 Нэ80, В спектре 11СЭУ фактора D при точном определении масс отмечены ионы:

50 зри 598,35 — С 11д„08, 452,29 — С ЭН4фр 34,28 — Сщ«1Н ЩО .

В спектре МСЭУ фактора Е при точ- ном определении масс отмечены ионы: при 452,2908 — С Н4ОО«1, и для йакто55 -pa F ионы при 466,3067 - CgpHzq04..

Факторы А, В, С, D Е и F имеют следующие характерные пики в ИК-спек тре (в бромойорие).

Та блица 3

Фактор Длина волны, а

318

252

244,5

468

430

239

252

302

244,5

426

Г1

239

394

316

252

244,5

470

239

432

263 35

252

244,5

393

Г!

239

362

252

266 4О

244

402

238

373

252

421

244,5

It

239

389

Г(онцентрация в метаноле С=О»001Х що

Приведенные выше значения представляют собой характеристику каждого фактора, значения. Е< отража(М ют чистоту материала в полученном ви- 5ъ де (отношения величины Е являются

l характеристичными для вегества).

Спектры протонного магнитного резонанса (ПГ1Р) при 200 МГц каждого

29 17380

Для фактора А — около 3510 (OH), 1712 (сложный эфир) и 998 см »(С-О).

Для Ьактора В около 3510 (ОН) 1710 (сложный эфир) и 996 см (С-О).

Для фактора С около 3510 (ОН),"

1712 (сложный эфир) и 996 см" (С-О).

Для фактора D около 3508 (ОН) 1711 (сложный эфир) и 996 см (С-О).

Для фактора Е около 3500 (OH), 1708 (сложный эфир) и -994 см (С-О).

Для фактора Г около 3100 (OH) 1708 (сложный эфир) и 997 см (С-О).

Факторы А, В, С, D Е и Г имеют

УФ-спектры в растворе метанола (0»0027)» где П вЂ” перегиб и И вЂ” максимум (см. табл. 3).

30 фактора в растворе дейтерохлороформа включают следующие сигналы (значения

Ф с мультиплектностью, константами сочетания .(Гц) и интегральными величинами в скобках).

Фактор А: 4,1-4,4 (м, 2Н), 4,61 (шир. с, 1Н) 4,6-4,75 (м, 2Н), 4,81 (д, 9, 1Н)» 5,05 (м, 1Н), 5,34 (с, 2Н)g 5,69 (д, 5, 1Н), 6,06 (д, 5, 1Н);

6 17 (м» 1Н) 6»26 (p» 11» 1Н) бь37 (м, 1EIi» 6,46 (д, 10, 1Н), 6,74 (к, 2, 1Н); 7 42 (м, 1Н).," 7 7 7 9 (м, 5Н), 8,14 (с, ÇH), 8,40 (с, ÇH), 8,47 (с, ЗН), 8, 61 (т, 11, 1Н)," 8,96 (д, 7, ЗН) 9,06 (д, 7, ЗН)," 9,02 (д, 7, Н);

9,13 (к, 11, 1Н), 9,21 (д, 7 ЗН).

Фактор В: 4, 2 — 4,4 (и, 2Н), 4,55 (к, 7, 1Н), 4,65 (пир. с, 1Н), 4,6-.

48 (и, 2Н)," 506 (м, 1Н),"5355 (и, 2EI); 6 01 (д, 5, 1Н)," 6,07 (д, 5, 1Н); б, 12 (с, 1Н)i б, 24 (д, 11, 1H)

6,24 (м» 1 1), 6,3-6,5 (м, 2Н) 6,53 (с, ÇH), 6,73 (к, 2, 1Н), 7,62 (м, 1Н), 7,6-8,0 (м, 4Н) ьь 8,22 (c» ÇII),"

8,35 (д, 7, ЗН), 8,41 (с, ÇH), 8,49 (с,. ÇH)," 8, 62 (т, 1 i, 1Н), 9,03 (д, 6, ЗН)," 9,12 (к, 11, 1Н); 9,22 (д, 3H) .

Фактор С: 4,29 (д, 11, т, 2, 1Н), 4,4-4,6 (м, ÇH)) 4,56 (шир. с, 1Н)," .

5,14 (дд, 15, 10, 1Н), 5,23 (м, 1Н} "

5, 65 (шир, с, 2Н) 5 72 (д, 6, 1Н);

5»95 (д» 10» 1Н)ь 5»99 (д» 6» 1Н) г

6,08 (шир. с, 1Н), 6,1-6,4 (м, ÇH) <

6,62 (к, 3, 1Н), 7,7-8,1 (м, около

1Н), 7,18 (с, 3H) » 8,33 (с, ЗН)ь 8,48 (д» 7, ÇH), 8,64 (с, ÇH), 8,68 (т, 1 1, 1H), 9,00 (д, 7), 9,08 (д, 7, ÇH)

9,12 (к, 12, 1Н) .

Фактор D: 4, 18-414 (м, 2Н), 4, 474,82 (м, 4Н); 5,04 (м, 1Н), 5,35 (с, 2Н) 5 72 (д» 7» 1Н) ь 6»07 (p» 7» 1H)ü, 6,15-6,45 (м, 4Н); 6,74 (к, 4, 1Н), 7,45-8, 1 (M, 8Н); 8, 16 (с, ÇFI) 8, 41 (с, ЗН); 8,49 (с, ÇH); 8,62 (т, 11, 1Н)", 8,92-9 05 (м, 6Н), 9,21 (д, 7, 3H).

Фактор Е:. 4,1-4,3 (м, 2Н), 4,5-4,8 (м, 4Н всего), 5,04 (и, 1Н), 5,2-5 5 (м, 2Н), 6,01 (д, 5, 1Н), 6,05 (д,5, 1Н)," 6,11 (с, 1Н); 6,1-6,4 (м, ÇH),"

6,45 (д, 1Н), 6,51 (с, ÇH), 6,70 (к, 2, 1Н), 7,GO (м, 1Н), 8,20 (с, ÇH) »

8,41 (с, ЗН), 8,47 (с, ЗН), 8,60 (т, 11, 1Н), 9,00 (т, 7, ЗН) 9,02 (д»

6, ЗН); 9,11 (к, 11, 1Н); 9,20 (д, 7, ЗН).

Фактор Г: 4, 2-4, 4 (м, 2Н); 4, 62 (с, 1Н)", около 4,70 (м, 2Н); 4,80 (д E

Вес.

9,0

4,5

31. 17

9, 1Н), 5,04 (м, 1Н) 5,2-.5,5 (м, 2Н)

5,99 (p,, 5, 1Н), 6,05 (д, 5, 1Н);

6 11 (с, 1Н); 6 1-6,3,(м, 2Н), около

6,36 (и, 1Н), 6,45 (д, 10, 1Н) 6,51 (с, ЗН); 6,70 (к, 2, 1Н), 7,42 (м, 1Н); 7, 58 (м, 1И), 8, 19 (с, ЗН)," 8, 40 (с, ЗН), 8,47 (с, ЗН), 8,60 (т, 11, 1Н), 8,95 (д, ЗН); 9,05 (p,, 7, 3H)>

9,01 (p,, 7, ЗН), 9,10 (к, 11, 1Н),"

9 21 (д, 6, ЗН).

Отфильтрованный-от шума спектр

ЛИР-С при 25,05 ИГц раствора каждо1Ь го фактора в дейтерохлороформе включает пики (в скобках даны величины с мультиплетностью сигналов внерезонансного спектра).

Фактор А при 173 2 (с), 142,6 (д);

139, 2 (с), 137, 6 (с), 137, 1 (с)

137,0 (д) f30,4 (с); 123,1 (д)

120, 1 (д); 171,8 (д) 99,5 (с), 80,0 (с), 79,0 (д), 76,S (д), 69,0 (д), 68,3», 67,4 (д); 48,2 (т), 45,4 (д), 40,9 (т), 40,5 (т)," 35,8+, 34,5 (т), 22, 1 (к) 34,5 (т) " 26, 6 (д), 22,6 (к), 22,0 (к), 19,7 (к), 15,3 (к); 13,7 (к)," 10,8 .(к)..

Фактор В при 173,4 (с)," 14 1 (p);

139,5 (с), 137,1 (с) 136,7 (с)

133,7 (с); 123,6 (д); 123,3 (д),"

120,0 (д); 119,3 (д), 118,2 (д), 99,5 (с), 80,1 (с); 77,3 (д), 76,6 (д)

76,4 (p), 69,0 (p); 68,3 (д) 67,9

67,6» 57,5 (к) 48,2 (-), 45,4 (д);

40,7 (т)," 40,5 (т), 35,8+", 34,5 (т);

22,1 (к) 19,6 (к); 15,3 (к); 13,6 (к)

12,9 (к), 10,5 (к). с!актор С при: 173,3 (с), 142,2 (д), 140,3 (с) 138,5 (с), 137 (с) 134,9 (с); 123,9 (д), 121, 1 (д), 120,6 (д), 118, 1 (д); 100,2 (с), 80,6 (с), 80,1 (д)э 77э4 (д) 69э2 (д) " 69э0 (p)>

68,3 ; 68,0 (д), 67,9 (p); 48,6 (т), 46,3 (д), 41,4 (т)" 36,5"; 36,3

36,1 (д), 35,0 (т), 22,6 (к), 20,0 (к), 15 4 (к), "14 3 (к), 13 1 (к); 10,8 (к).

Фактор D при: 173,2 (с), 142,S (д),"

139,1. (с); 137,5 {с), 137,1 (с);

132, 1 (с); 131,4 (д); 123,1 (p), 120, 1 (д); 117,8 {p), 99,5 (с), 79,9 (с); 79,2 (д); 76,5 (д)," 69,0 (д),"

68,3"; 68,1"; 67,6", 67,4", 48,2 (т)

45,5 (д); 40,8 (т), 40,5 (т), 35,71 ;

34,5 (т); 22,0 (к); 20,6 (т), 19,6 (к); 15,3 (к); 13,7 (к); 13,6 (к) ;

10,7 (к).

Кривые кругового дихронизма для факторов А, В, С и 9 (концентрация ю

32 растворов в метаноле около 0,1 ) плохо разрешены в области 230-260 нм, связанной поглощением диенового хро5 мофора. Это указывает на то, что во всех четырех факторах абсолютные кон фигурации при атомах углерода С, С 7, С у и С 9 являются одинаковыми.

Ниже следуют примеры рецептур согО ласно изобретению (активный компонент — вещество, полученное по предлагаемому способу, которое может представлять собой один из факторов

А, В, С, D Е или Г.

Парэнтеральная многодозная инъекция (интервал 1

5 вес./обЕ):

Активный компонент . 4,0

Бензиловый спирт 2,0

Триацетат глицерина 30,0

Пропиленгликоль До 100,0

Активный компонент растворяют в бензиловом спирте и триацетате глицерина. Добавляют пропиленгликоль и доводят до объема. Раствор фильтруют, чтобы удалить любые твердые примеси.

Продукт асептично заполняют в ампулы для инъекций и закрывают резиновыми

30 уплотнениями или поршнями удерживаеЭ мыми на месте алюминиевыми колпачками. Окончательно стерилизуют продукт путем нагревания в автоклаве.

Аэрозольный распылитель (интервал

0,01-0,50 вес.%), вес./вес. :

35 Активный компонент 0,1

Трихлорэтан 29,9

Трихлорформетан 35 0

Дихлорфторметан 35,0

Смешивают активный компонент с

40 трихлорэтаном и заполняют в аэрозольный контейнер. Продувают пространство головки газообразным распылителем и обжимают клапан на месте. Под давлением вводят необходимое количество

45 жидкого Распылителя через клапан, Устанавливают пускатель и внутреннюю крышку,.

Таблетки. Способ получения — влажная мг

50 грануляция:

Активный компонент 250,0

Стеарат магния 1 4,5

Кукурузный крахмал 5 22,5

Натрий-гликолят крах55 2

Лаурилсульфат натрия 1

Иикрокристаллическая целлюлоза— для оболочки таблетки весом 450 мг.

33

)ч

1738090

0,35

5,0

3,0

30,0

К активному компоненту добавляют достаточное количество 10%-ной крахмальной пасты для получения удобной для гранулирования влажной массы.

Формуют гранулы и сушат, используя сушильный поднос или сушилку в ожиженном слое. Просеивают через сито, добавляют оставшиеся компоненты и прессуют в таблетки.

В случае необходимости поверхность таблетки покрывают пленкой, используя оксиметилцеллюлозу или другой подобный пленкообразующий материал, применяя водную или неводную систему растворителей. В состав покрывающей пленки могут быть включены пластификатор и подходящая краска.

Ветеринарная таблетка для мелких домашнп:: животных. Способ получениясухая гра. Состав, мг:

Лктивный компонент 50,0

Стеарат магния 7,5

Иикрокристаллическая целлюлоза для оболочки таблетки 75,0

Смешивают активный компонент со стеаратом магния и микрокрпсталлической целлюлозой. <зормуют из смеси чер, вячки. Разбивают червячки, пропуская их через роторный гранулятор, получают свободнотекучие таблетки, Прессуют в таблетки. Оболочки таблеток затем могут быть покрыты пленкой.

Ветеринарная внутригрудная инъекция:

Активный компонент, мг 150

Полисорбат 60, вес.7 . До 3,0

Белый пчелиный воск, вес. 7 6,0

Лрахисовое масло, вес ..7. 91

Нагревают арахисовое масло, белый пчелиный воск и полисорбат 60 до о

160 С при перемешпвании. Выдерживают

2 ч при этой температуре и затем охлаждают до комнатной температуры при перемешивании.

Лсептично добавляют активный компонент в носитель и диспергируют, используя высокоскоростной смеситель.

Очипают путем пропускания через,коллоидную мельницу. Лсептично заполняют продукт в стерильные пластиковые шприцы.

Ветеринарный пероральный мягчитель, вес/об.7,:

Активный компонент

"Полисорбат 85"

Бензиловьпr спирт

Пропиленгликоль шприцы., Гранулы.для ветеринарного назначения в пищу, Båс.Е:

Активный компонент 2,5

Известковая мука До 100,0.

Смешивают активный компонент с известковой мукой. Формуют гранулы, используя способ влажной грануляции.

Сушат„ применяя суыильный поднос или сушилку в ожиженном слое. Заполняют в подходящие контейнеры.

Эмульгируемый концентрат

Активный компонент, r 50

Лимонный эмульгатор щ. (например, фенилсульфонат CAI.Х), r 40

Вено но генный эмульгатор (например, "Сипероник 11Р 13), г

45 Ароматический растворитель (например, "Сольвессо 100".), л До 1

Смешивают все компоненты и перемешивают до растворения. ц Транулы, г: а) Активный компонент 50

Древесная смола 40

Гипсовые гранулы, 20-60 меш (например, "Агсорб 100 А") До 1000. б) Активный компонент 50

Сипероник NP 13 40

Гипсовые гранулы (20-60 меш) До .1000

60 и осфатный буфер до рН 6,0-6,5

Вода До 100, 0

Растворяют активный компонент в полисорбате 85, бензиловом спирте и пропиленгликоле. Добавляют часть воды и доводят pEI до 6,0-6,5 фосфатным буфером (в случае необходимости). Добавляют остальное количество воды.

Заполняют продукт в емкость мягчителя.

Ветеринарная пероральная паста, вес. Х:

Активный компонент 7 5

Сахарин 25,0

Полисорбат 85 3,0

Дистеарат алюминия 5,0 йракционированное масло кокосового ореха До 100 0

Диспергпруит дистеарат алюминия во фракционированном кокосовом масле и полисорбате 85 путем нагревания, 7

Охлаждают до комнатной температуры и диспергируют са"..арин в масляном носителе. Распределяют активный компонент

25 в основе. Заполняют в пластиковые

38090

ОН ,СНз сн

Формула изобретения

Способ получения антибиотика

S р,1 формулы

Составитель И.Тареева Редактор И.Циткина Техред м,дндык Корректор А. Обручар

Заказ 1909 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

35 17

Растворяют все компоненты в лету- чем растворителе, например хлористом метилене, добавляют к гранулам, обрабатывают в барабане-смесителе. Сушат, чтобы удалить растворитель.

Активность Факторов А, В, С, D, Е и F определяют, используя множество вредителей и их хозяев, включая следующие: Tetranyc husurticae (обыкновенная фасоль и Мирабель В), Myzus

persirae (капуска китайская и редька), Не1iotlus virescens (хлопок), Chiloportellus (фасоль Рейна), Ileloidogyne

incognita (золотистая фасоль), Panonchus ulmi (мирабель В), Phorodon humuli (хмель), Aulacorthus circumflexum (цикламен).

Продукт используют в виде жидкогэ препарата (например, раствора в ацетоне). Затем эти растворы разбавляют водой, содержащей 0,1 илн 0,01 вес.% увлажняющего агента, до .тех пор пока жидкие препараты не будут содержать требуемую концентрацию продукта.

Иетодика испытания, принятая с учетом каждого вредителя, включает помещение нескольких вредителей в, среду, которой обычно является растение-хозяин, и эту среду обрабатывают препаратом (остаточное испытание). 8 случае Tetranyc urticae препаратом обрабатывают как вредителей, так и среду (контактное испытание).

Используя эту методику, находят, что факторы А-F являются эффективными при концентрациях (по весу продукта) до 500 ч. на млн или менее.

НО, 1О где 8 — изопропил или иметил, или этил;

Й д — Bopopop или MeTHJI, заключающийся в анаэробном культивировании штаммов Stpertomyces thermoarchaensis NC18 12015, или NC18

12111, или ИС18 12112, или NC18

12113, или NC18 12114 на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, 26 при 28-34 ". при рН 5,4-7,2 в течение

5-10 сут с последующим выделением целевого соединения путем экстракции водорастворимым растворителем.

2. Штамм стрептомицета Streptomyces thermoarchaensis NC18 12112— продуцент антибиотика S 4<.

3. Штамм стрептомицета Streptomyces thernoarchaensis NC18 12015 " продуцент антибиотика S 4<.

4. Штамм стрептомицета Streptomyces thermoarchaensis NC1B 12111 продуцейт антибиотика S 4<.

5. 1Чтамм стрептомицета Streptomyces thermoarchaensis NC18 12113— продуцент антибиотика SS4<.

35 6. Штамм стрептомицета" Streptomyces thermoarchaensis NC18 12114 продуцент антибиотика S

Приоритет по пунктам н признакам:

14.09.84 по п. 1 антибиотик S 4<, " штамм 12015, имеет признаки, характеризующие условия способа

2i.12.84 о п.3

13.09.85 по пп. 1, 2, 4-6.