Способ получения полиэфирного антибиотика а 80190

 

Изобретение относится к новому полиэфирному антибиотику А 80190 и некоторым производным его, к его получению культивированием новых штаммов микроорганизмов. Антибиотик А 80190 получают путем культивирования штамма микроорганизма ACTUNOMADURA OLIGOSPORUS 15877 или штамма микроорганизма ACTUNOMADURADIGOSPORUS 15878 на питательной среде, содержащей усваиваемые источники углерода, азота и неорганических солей в условиях глубинной аэробной ферментации при 30 - 32°С. 5 табл.

СаОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (1М (П) А3 (5И 4 C 12 P 1/02, 1/06

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTY

QMe

Ме

I,Ме о г . Оно

ОЯ йе

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

flPH ГКНТ СССР

1 (2) ) 3963528/30-13 (22) 08. 10, 85 (31) 658.977; 658. 976 (32) 09 ° 10.84 (33) US (46) 23.12.89. Бюл. Ф 47 (71) Эли Лиллн Энд компани (US) (72) Роберт Л.Хамилл, Раймонд ЧеФонг

Яо и Лаверн Двейн Боек (US) (53) 615. 779, 9 (088. 8) (56) Патент СССР Ф 673184, xh. С 12 P 1/02, 1979.

Заявка Франции Р 2164792, кл. А 61 К 21/00, 1973.

Патент США У 3839558, кл. А 61 К 21/00, 1971.

Изобретение относится к новому полиэфирному антибиотику А80190, к некоторым производным его и к его полу, чению культивированием новых штаммов микроорганизмов, Характерные особенности А80190.

Антибиотику А80190 приписывают струк! туру I, основанную на рентгено-крис— таллографических исследованиях.

2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИЭФИРНОГО АНТИБИОТИКА А80190 (57) Изобретение относится к новому полиэфирному антибиотику А 80190 и некоторым производным его, к его получению культивированием новых щтаммов микроорганизмов. Антибиотик

А 80190 получают путем культивирования штамма микроорганизма Actunomadura oligosporus 15877 нпи штамма микроорганизма Actuna(nadure oligosporus

15878 на питательной среде, содеркащей усваиваемые источники углерода, азота и неорганических солей в условияк глубинной аэробной Ьерментации при 30 — 32 С. 12 табл.

Используя систему Уэстли, А801 90 ,, является новъм членом класса lб, ти- Я па (I), группы полиэфиров, потому что он имеет одну спирокетальную систему.

Другие члены этой группы включают

А-28695 А н В, А2041 и 11 и А-32887.

А801 90 ьиеет следующую структуру:

А80190 1,в его свободной кислотнойформе ) яснеет следующие характерные особенности.

l 53) 86) 0Ие

-и

ONe, Ме% е

Ие Ие

Ме

Ме

„:=,) — к,У

ОН

R — С

1а

II

Состояние: белые кристаллы (из ацетона — воды) ° Т. пл. 98 — 100 или

120 - 122 С (более часто); вероятно изменяется со степенью сольватации, рКа - 6,2 (66X-ный водный диметипдюрмамиц) . fa() 26 С (c 1, СНС1 ) .

Кол.масса 828 (масс-спектрометрия с десорбированиым полем) . УФ: поглощениее отсутствует. ИК: (CHCly) . Показы- )ð вает поглощение при следующих частотах, см : 3019. 2970, 2936, 2827, ) 721, ) 457, 1402, 1376, 13) 4, ) 163, 1105, 1092, 1083, 1056, 1022, 1006, 989, 980, 945, 934, 917, 892 и 859.

Вычислено, Х: С 63,77; Н 9 18;

О 27,05.

С 4Н 1аО 1м

Найдено, 7.: С 63,35; Н 9,17;

О 27, 10. 20

Растворимость. Нерастворнм в воде, растворим в низших спиртах, таких как метанол, кетонах, таких как ацетон, сложных эфирах, таких как этилацетат, 35 в которой R представляет водород ипи — C0NHR

R — алк ил, а рил, алк ип-а рил, арилалкип, галоидарил, нитроарил, галоидарилал- 40 кил, алкоксиарил, арилоксиарил, арипциклоалкип, ациларип и циклоалкип, или ацип, алкип сложноэфирные ипи алкип-эфирные 45 производные, ияи его соли.

А80) 90 и его производные являются полезными в качестве антибактериальных и антипротоэойных средств, Они улучшают эффективность использования кормов жвачными животными и действуют в качестве средства, способствующего росту животных с одной желудочной полостью. Кроме того, они имеют

55 инсектицидную, гербицидную и противовирусную активность. Кроме того, они являются полезными в качестве ионофоров. гало идированных углеводородах, таких как хлороформ и углеводородах, таких как диэтиленовый эфир, бенэол, толуол и теплый гексан.

A80l 90 имеет кислотную функиио, способную образовывать соли и сложноэфирные производные, и имеет по край-, ней мере одну гидроксипьную группу, которая может быть этериФицирована ипи может образовывать эфирные производные или уретановые проызводные.

Ациловый и алкиловый сложные эфиры и алкиловые эфирные производные А801,90, уретановые производные, фармацевтически приемлемые соли А80190 и этих производных также являются полезными в качестве антибиотиков, коксидиостатков и в качестве средств, которые увеличивают эффективность испольэова" ния кормов животными, Согласно цели изобретения в описании предлагается соединение Форму" лы Я):

Термин "ациловый означает от С, до С1, предпочтительно от С до С

1 у Э алкановый кислотный остаток, т. е, радикалы формулы в которой R представляет от С, до

С вЂ” алкил ипи водород, например Формил, ацетип, пропионип, бутирил и т.п.

Термин циклоалкип" означает циклические углеводородные группы, содержащие 3-7 углеродных атома, такие как циклопропип, циклобутип, циклогексил и другие, причем циклогексип является предпочтительныч, Биклоалкипьная группа может быть замешенной арильным остатком, например 2-(фенил) -циклопропилом, Термин "алкокси" означает низшую от С, до С 1 алкильную группу, имеющую замешенную кислородную Функцьао в ией, 1531861

6 такую как метокси, этокси, пропокси и т.п.

Термин арип" означает ароматичес. кий остаток, полученный удалением атома водорода из ароматического углеводорода, такой как, например, Аенил, пиридип ипи фурил, особенно фенил. Арипьный остаток может быть эамещенным различными группами. Заместитель на фенипьном ядре расположен предпочтительно в положении 4, Примерами являются 4-алкиларил, например

4-метилфенил (4-толип); 4-rалоидфе— нил, например 4-хлорфенил; 4-нитрофе- 15 нил, 4-арилоксиарил, например 4-феноксифенип, 4-алкоксифенип, например

4-метоксифенил; 4-(алкилкарбонип) -фенип, например 4-(метилкарбонип) -фенип или 4-(фенилкарбонип) -фенип. 20

Термин "алккп" означает С, -С 1 углеводород с линейной ипи разветвленной цепью, предпочтительно С, -С углеводород, например метип, этип, пропил, изопропип, н-бутип и т,д. An- 25 кипьная группа может быть замещенной арильным остатком, как это определено выпе, чтобы образовать арилалкипьный остаток, например фенилэтил ипи 2-фенипэткп, ипи галоидарипьным остатком, 30 чтобы образовать галоидарилалкипьный остаток, например 4-бромфенэтил.

Соли А80190 и его производных являются полезными для разделения и очистки антибиотиков. Особенно полезными являются фармацевтически приемлемые соли. Такие соли должны иметь малую или вовсе отсутствующую токсичность по отношению к теплокровным животным. Примерами солей являются со- 40 ли А80190 и его производных щелочных металлов, щелочно-земельных металлов и аминов.

Соли А801 90 щелочных металлов и щелочно-земельных металлов включают 4 соли натрия, калия, лития, цезия, рубидия, бария, кальция и магния.

Аминовые соли А80190 включают соли аммония и первичного, вторичного и третичного С, -С алкиламмония и оксиС -С 1 алкипаммония. Аминные соли включают соли, образующиеся по реакции А80190 с гидроокисью аммония, метил амином, в то рбутип амином, изоп ропипамином, диэтиламином, дииэопропиламином, этаноламином, триэтипамином, 3-амино-1-пропанолом и т.п.

Широко известно в ветеринарной фармацевтической области, что форма антибиотика обычно не является существенно важной при лечении животного антибиотиком. В большинстве случаев состояние животного изменяет форму лекарств а, отличающуюся от формы, которая была введена.

Солевая форма, в которой оно могло с, быть введено, не является, следовательно, существенно важной. Однако солевая форма може T быть выбрана по причинам экономии, удобства и отсутствия токсичности, Антибиотик А80190 может быть получен культивированием A80190 — проду- ° цирующего штамма Actinomadura ol igospoга при глубинных аэробных условиях в подходящей питательной среде до тех пор, пока не будет достигнута значительная антибиотическая активность. Антибиотик выделяют и тем использования .разнообразных методик выделения и очистки, известных в данной области техники.

Новый Actin6madura о1igospora микроорганизм данного изобретения, который продуцирует антибиотик А80190, выделен из образца почвы из Индии.

Впоследствии значительно улучшенный вариант, который продуцирует повышенные количества А80190 бып выделен

Ла-Верне Д.Доек ом. Культуры этих двух А801 90 — продуцирующих организмов сданы на хранение и стали частью коллекции культуры родов в Северном

Региональном Исследовательском Нентре (Сельскохозяйственные исследования), из которой они доступны публике под инвентарными номерами NRRL 15877 (родительский штамм) и NRRL 15878 (штамм измененной особи — вариантный штамм) .

Согласно таксономическим исследованиям два новых микроорганизма классифицируют как члены нового вида рода Act inomadura, для которого предлагается название Act inomadura ol igos- рога, „

Характеристики культур, Культивирование организма обычно слабое на химически определенной среде, но более хорошее на комплексной органической среде. Воздушные мишелин отсутствуют, за исключением следовых количеств на IPS У 4 и натрий-бутиратном агаре. Если присутствуют споры, то их окраска устрично-белая по системе Треснера и Баккуса. Ивет обратной стороны от желтовато-зеленого до коричневого. Не продуцируются раство1 5318Ы римые пигменты, за исключением продуцирования очень светло-коричневого растворимого пигмента в случае ISP

2 агара и темно-коричневого раство- 5 римого пигмента в декстрозо-дрожжевом агаре. В табл. l.ïðåäñòàâëåíà характеристика культур NRRL 15878 и

А.macra на различных агаровых средах. l0

Морфологические характеристики, Пепи спор продуцируют разбросанно на

ISP У 4 и натрий-бутиратном агаре.

Спорофоры, содержащие приблизительно 15

10 спор на цепь, в основном извилистые в виде вправо изгибающейся (R

Й) конфигура иии. Однако. наблюдаются также крючковатые спорофоры. Воздушные гифы (нити грибницы ) имеют тен- 20 денцию группироваться вместе. Форма . спор продолговатая и изменяется по размеру от 0,5 — 0,7 до О, 9 — 1,3 Н щ.

Усредненный размер спор составляет

1,! - 0,6 pm. Рисунок поверхности спор гладкий.

В табл. 2 приведена картина использования углевода штаммом NRRL

1 5878 по сравнению с А.масга, ISP (среду У 9 используют в качестве основной) . Добавление витамина В1 или использование среды Луйдемана способствует более хорошему культивированию, но не изменяет использование углерода. Использованы адонит, целлобиоза, 15 глюкоза и рибоэа. Сомнительное использование отмечают в случае фруктозы и ксилоэы. Арабиноза, целлюлоза, декстран, галактоэа, цис-инозит, инулин, лактоза, маннит, манноэа, мели- 40 зитоза, мелибиоэа, раффиноэа, раино3а, салицин, сахароза, трегалоза и ксилит не используются для культивирования.

В табл. 3 приведены данные об ус- 45 тойчивости штамма NRRL 15878 к разнообразным антибиотикам при укаэанных концентрациях и сравнение их с А.масга.

NRRL 15878 культивируют при температурах 15-41С при .концентрации до

27. NaC1 Он продуцирует каталазу, фосфатазу и уреаэу.

NRRL 5878 деградирует каэеин, ДНК, эскулин и желатииу, но не разлагает аденин, кальциевую соль яблочной кислоты, хитин, эластин, гуанин, гиппурат, гипоксантин, кератин, крахмал, тестостерон, крахмал, тироэин или хоан тин .

Анализ клеточной оболочки. Гидролиэованные цельные клетки содержат мезоиэомер диаминопимелиновой кислоты. Сахары, присутствующие в гидролизатах цельных клеток, следующие . глюкоза, манноза, мадуроэа и рибоэа. Типом клеточной оболочки согласно Бэккеру является шип Ш, а образец сахара является типом В. Качественный анализ метанолизатов цельных клеток на миколевые кислоты дает сомнительные результаты. Сомнительно, что культура содержит миколевые кислоты.

Бып обнаружен тип Рl фосфолипидного образца. Тип Pl не содержит азотных фосфолипидов и является характерньм для рода Act inomadura

Подлинность штамма. NRRL 15878 имеет клеточную оболочку типа 11!. Тип

В цельной клетки сахарного образца и

Тип Pl фосболипидного образца. Эта хомотаксономическая информация вместе с обшычи характеристиками культур согласуется с отнесением штамма к роду

Actinomadura по Лешевалье. Сравнение

его характеристик с таковыми в опубликованных описаниях известных видов

Actinomadura показывает, что культура подобна А.pelletieri

Культура напоминает Actinomadura

pelletieri главным образом по отсут-. ствию ули по крайней мере редкому наличию воздушных мицелий. Морфология спорофоров, когда они продуцируются, подобна описанной в литературу Рз.

Две культуры также обладают рядом физиологических характеристик. Однако культуральные и физиологические pasличия являются достаточными, чтобы отделить их в качестве отдельного вида А.pelletieri вызывает деградацию эластина, гипоксантина, кератина; гироэина, использует трегалоэу, восстанавливает (редуцирует) нитрат и культивируют при 45 С, однако NRRL 15878 не имеет этих характеристик. Последний использует адонит и целлобиозу, вызывает деградацм эскулина и ДНК и является устойчивым к лиэоциму, однако А.pelletieri не имеет этих характеристик. Следовательно, новая культура является видом, отличным от

А.pelletieri.

Иэ-за подобности культуры А.масга осуществляют одновременные лабораторные исследования NRRL 15878 и A.мас1О

ra которые обладают многими общими свойствами. Оба не способны вызывать деградацию аденина, кальциевой соли яблочной кислоты, хитина, эластина, гуанина, кератина, крахмала, тестостерона, тирозина и ксантина. Ни тот, ни другой не продуцирует Н

A.масга и NRRL 15878 разливаются по картине использования углерода, по деградации эскулина и поксантина, ус" тойчивости к антибиотикам, температурному пределу, продуцированию уреаэы и редуцированию нитрата.

А.масга и NPRL 15878 обладают многими обшлаги культуральными характеристиками, особенно отсутствием воздушных мицелей. Однако имеются и значительные различия. Обратная сторона

NRRL 15878 от зеленой до желтоватокоричневой окраски, А,масга на многих средах окрашивается в красный цвет.

Это отличие наиболее четко проявляется на глюкозо-аспарагиновом агаре.

На этой среде А.масга в отличие от

NRRL 1 5878 продуцирует розовое воз- . ! душное разрастание. Эти культуральные сравнения показаны в табл. 1.

Морфология NRRL 15878 подобная таковой А.Macra. Обе имеют плохо развитые воздушные мицелии. Поверхности спор гладкие. Различия и сходства между NRRL 15878 и А.масга изложены в табл, 4.

В табл. 5 показаны подробные сходства и различия NRRL 15878 и А.масга.

Эти сравнения показывают, что

NRRL 15877 и NRRL 15878 культуры значительно различаются от других видов

Actinomadura и представляют штаммы нового вида, для которых предлагается название Actinomadura oligospora— новый вид. Штамм NRRL 15878 является типовым штаммом А.oligospora. Как и в случае с другими организмами характеристики А80190, продуцируюшей культуры данного изобретения, Actinomadura oligospora NRRL 15878 подвергаются изменению. Рекомбинанты, мутанты или варианты штамма могут быть получены путем обработки разнообразными

31861 известными физическими и химическими мутагенами, такими как ультрафиолетовый свет, рентгеновское излучение, гамма-излучение и химикалии, такие

5 как N-метил-N -нитро-Н-нитроэогуаниI дин. Природные и индуцированные варианты. мутанты и рекомбинанты Actznomadura oligospara NRRL l 5877, кото10 рые сохраняют характеристику А80190. продуцирования, рассматриваются частью данного изобретения.

Среда для выра1;;ивания, используемая для культивирования культур Actinomadura oligospora, может быть любой из ряда сред. Для экономиии при про-, дуцировании, получения оптимального . выхода и легкости выделения продукта некоторые среды для выращивания явля20 ютс я предпочтительными. Так, например, предпочтительным углеводным источником при крупномасштабном ферментировании (брожении ) является глюкоза, хотя могут быть использованы

25 также рибоза, ксипоза, фруктоза, галактоза, манноза, маннит, картофельный декстрин и т.п. Глицерин и липиды поддерживают незначительно или вовсе не поддерживают культивирование ипи продуцирование антибиотика, когда используются в качестве главного источника углерода. В сочетании с глюкозой они увеличивают биомассу, но уменьшают продуцирование антибиотика.

Предпочтительным источником азота является гидролизат коллагена, хотя полезными являются также энзим — гидролизованный казеин, пептоны из мяса, 40 рыбная мука, мука иэ печени и т.п.

Среди питательных неорганических солей, которые могут быть внесены в среду для выращивания, обычными являются растворимые соли, способные да45 вать цинковые натриевые, магниевые, 1 кальциевые, аммонийные; хлоридные, карбонатные, сульфатные, нитратные и подобные ионы.

Ценные следовые количества элементов, необходимые для роста и развития организма, также должны быть включены в среду для выращивания. Такие следовые количества элементов обычно встречаются в виде примесей в других

55 заменителях среды в количествах, достаточных для удовлетворения культивируемых требований организма. Пенообразование обычно не является проблемой, но малые количества (. т. е.

1531861

1l

0,2 мл/л ) антивспенинающего агента, такого как полипропиленгликоль, могут быть добавлены в крупномасштабнук, ферментационную бродильную среду, если это необходимо.

Для продуцирования значительных количеств антибиотика А80190 глубинная аэробная ферментация является предпочтительной. !О

Пример 1. Получение А80190.

А. Ферментация А80190 но нстряхиваемой колбе. Культуру Act inomadura

oligospora NRRL 15878 в ниде лиофилиэированной пилюли либо в виде сус- !5 пензии, содеркащейся в жидком азоте, используют для посева на среду следующего состава, мас.X: глюкоза 1,0; растворимый крахмал 2,0; дрожжевой экстракт О, 5; энэиматический гидролиэат каэеина (NZ амин А, Шеффилд Кемикал Ко, Норвич, Нью-Йорк) 5,0; СаСО

О, 1 . Деионизиров анная вода (количество раствора) 1 л. NaOH добавляют, чтобы повысить рН среды примерно до

7, 2 до с те рилиз а цни.

Наклонные плоскости и пластины готовят добавлением 2,57. агара к посевной среде. Микроорганизмы на наклонной плоскости инкубируют при 30 С в

I течение примерно 10-14 дней. Созревшую на наклонной плоскости культуру соскаблинают с помощью стерильного инструмента. Около одной четверти освобожденных спор и выращенной куль" 35 туры, полученных таким образом, используют для засева 50 мл посевной среды первой стадии.

Привитую среду первой стадии инкубируют в колбе Эрлеймейера емкос- 40 тью 250 мл при 30 С в течение 48 ч на встряхинателе с круговой орбитой н два дюйма (5 08 см) при скорости

250 об/мин. Эту среду (0,4 мл) используют для посева 50 мл продувируе- 45 мой среды, имеющей следующий состав, Х: глюкоза 3,0; NZ амин А 0 4 гидролиз ат колла гена О, 5; 1 ig SO< 7 Н 0

0,05; СаСО> 0,2. Холодная водопроводная вода (количество раствора) 1 л. 50

Предварительную стерилизацию осуществляют доведением рН до 7,0.

Продупирующую среду инкубируют в широкогорлой колбе Эрлеймейера емкос- 55 тью 250 мл при 30 - 32 С н течение

8-10 дней на встряхивателе с круговой орбитой н 5,08 см со скоростью

250 об/мин.

Б. Ферментаиия А80190 в большом объеме. Для обеспечения большего объема посевного материала используют 1О мл инкубиронанной среды первой стадии, полученной как это описано в разделе А, для прививки 400 мл питательной среды второй стадии, имеющей состав, одинаковый со средой первой стадии. Эту вегетационную среду.второй стадии инкубируют в широкогорлой колбе Эрлеймейера емкостью 2 л в течение 48 ч при 30 С на встряхивателе с круговой орбитой в 5,08 дм со скоростью 250 об/мин.

Полученную такыр образом вегетационную среду второй стадии (800 мл) используют для прививки 100 л стерильной продуцирующей среды, полученной как описано н раэделе А. Продупирующую среду подвергают джрментации в 165-литровой перемешиваемой йермен-.

1тапионной цистерне в течение 8-, 10 дней при температуре 30 - 32 С.

Слабый поток воздуха (О;12-0,25 об/об м/мин) и низкая скорость перемешинания (150 — 200 об/мин) в переметиваемом сосуде поддерживают уровень растворенного кислорода выше 307. насыщения воздухом °

Пример 2. Отделение А80190.

Весь ферментационный бульон из двух 100-литровых цистерн объединяют (207 л) и фильтруют через Фильтрпресс с помощью Hyflo Supercel. Иице- ,лиальную спекшуюся массу на фильтре экстрагируют циркулирующим метанолом (40 л) через фильтр"пресс. Ацетон также может быть использован в качестве экстрагирующего вещества. Метанольный экстракт, концентрированный под накууммом до объема примерно .

15 л, объединяют с бульонным фильтра том (182 л). Смесь доводят до рН 9 с помощью I н. гидроокиси натрия, полученный раствор экстрагируют. равным объемом этилацетата. Этилацетатный экстракт концентрируют до объема примерно 700 мл. К концентрированному экстракту добавляют 1 л воды, рН доводят до 9,0 с помощью гидроокиси натрия, смесь экстрагируют дважды толуолом (l л), поддеркивая рИ при 9,0.

Толуольные экстракты объединяют и концентрируют под вакуумом, получая маслянистый остаток, содеркащий

А801 90.

Остаток растворяют в толуоле (100 мл) и вносят н колонку, содержа15 вают. Кристаллы являются А80190 в кислотной форме (т. пл. 115 - 120 С) .

Пример 7. Кристаллизация натриевой соли A80190 °

Натриевую соль A80I90 (1 г) растворяют в пентане (10 мл) и оставляют . стоять при комнатной температуре в течение трех дней (растворитель выпаривают до объема смеси примерно 5мл).

30 Образующиеся кристаллы отфильтровывают и высушивают под вакуумом, получая 593 мг кристаллической натриевой соли А80190 т.пл. 225 - 230 С.

Пример 8. Получение ацетилированного А80190.

А80190 (кислотная форма, 200 мг) растворяют в пиридине (4 мл), добавляют уксусный ангидрид (4 мл) и смесь оставляют стоять в течение 72 ч при

4О комнатной температуре. Добавляют во-. ду (10 мл), водный раствор экстрагируют хлороформом (50 мл) . Хлороформный экстракт промывают последовательно по 50 мл каждая 0,1 н. раствором

45 Нсl, водой содержащей 1Х Нансоя, водой. Затеи хлороформный экстракт концентрируют под вакуумом до получения остатка, который растворяют в ацетоне (100 мл) . Ацетоновый раствор концентрируют под вакуумом, чтобы удалить остаточный пиридин и уксусную кислоту. Эту стадию повторяют трижды, а полученный остаток растворяют в ацетоне (50 мл) . Добавляют во"

55 ду (50 мл) н полученный раствор оставляют стоять при комнатной температуре до завершения кристаллизации.

Кристаллы отделяют Ьильтрованием, промывают водой н сушат в вакуумной

153 щую 2 л силикагеля (фирма Ное1ш, 70

l 50 меш) в толуоле. Колонку элюнруют сначала толуолом (10 л), .а затем смесью толуол:этанол (49:1, 10 л) и (48: 2, 10 л), собирая фракции по l л.

Элюирование контролируют биоанализом и ТСХ. Фракции, содержащие А80190, объединяют и концентрируют. Остаток растворяют в диоксане и высушивают замораживанием, получая 13,6 г сырого А80190.

Пример 3. Очистка А80190.

Сырой А80190(20,4 r )., полученный из четырех цистерн объемом 100 л аналогично примерам 1 и 2, растворяют в ацетонитриле (200 мл) . Раствор вводят в колонку, содержащую 2 л силикагеля (фирма Moeln, 70 — 150 меш) и ацетонитрила. Колонку промывают аиетонитрилом (10 л ) и элюируют последова": тельно смесями ацетонитрнлацетона (9 5, 2 л),(9 1, 10 л),(4 1, 10л) и (7:3, 10 л), собирая фракции по 1 л.

Элюирование контролируют биоанализом, используя Bacillus subt ilia. Фракции, содержащие А80190, объединяют и концентрируют. Остаток растворяют в диоксане и высушивают замораживанием, получая 15,8 г очищенного А80190.

Пример 4. Кристаллизация

А80190.

Очищенный А80190 (28,2 г) раство;ряют в ацетоне (500 мл). Добавляют ,воду (500 мл) и рН доводят до 5, 0 с помощью разбавленной хлористоводородной кислоты. Полученный раствор оставляют при комнатной температуре в течение 20 ч для кристаллизации.

Кристаллы отделяют фильтрованием,про мывают водой и высушивают в вакуумной печи, получая 25,9 г кристаллического

А80190 (кислотная форма).

Пример 5. Получение А80190 натрневой соли.

А801 90 (кислотная форма, 300 мг) растворяют в ацетоне (30 мл), добавляют воду (10 мл) и рН доводят до 10 с помощью NaOH. Раствор концентрируют до маслянистого остатка, который растворяют в диоксане и высушивают замораживанием, получая белый порошок (т.пл. 145 — 150 ) . Мол. масса продукта по масс-спектрометрии с полевой десорбцией (ИСПД) составляет

850, ИК в СНСlз показывает максимумы полос поглощения при следующих частотах, см : 2962, 2934, 2885, 2825, 1719, 1569, 1455, 1397, 1377, 1358.

1861 l4

1314 1285, 1243, 1162, 1104, 1074, 1057, 1025, 897, 979, 936, 922, 895 и 847.

Пример 6. Другой способ по-, лучения натриевой соли А80190.

А80190 (кислотная форма, 5 r) растворяют в этилацетате (500 мг), добавляют воду (500 мл) . Смесь доводят

IO до рН 10 с помощью 5 NaOH, перемешивая в течение 15 мин, чтобы поддерживать рН. Этилацетатную фазу отделяют, промывают водой (500 мл) и концентрируют под вакуумом досуха. Остаток растворяют в диоксане (100 мл) и высушивают замораживанием, получая

4,1 r натриевой соли А80190.

Водные промывки оставляют при комнатной температуре на ночь, а образующиеся кристаллы фильтруют и высушиl5 153 печи при 50 С, получая 192 мг крис-. таллического ацетилиронанного А80 90 (т.пл. 87 — 89 С) . Мол . масса равна

870 по масс-спектрометрии с быстрой атомной бомбардировкой (МСБАБ), ИК в

ClIC1 показывает максимумы полос поз глощения при следующих частотах,см :

3021, 3018, 2935, 2825, 1726, 1454, 1373, 1311, 1244, 1162, 1104, 1078, 1058, 1025, 867, 976, 934 и 925.

Пример 9 ° Получение пропионил-производного А80190.

А80190 (кислотная форма, 200 мг) растноряют в пиридине (4 мл), добавляют пропиононый ангидрид (4 мл) и смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение 72 ч, Добавляют воду (10 мл) и раствор экстрагируют хлороформом (50 мл) . Хлороформный экстракт промывают последовательно по

50 мл каждая О, 1 н. раствором НС1, водой, содержащей 17. NaHCO» и водой, Хпороформный экстракт концентрируют под вакуумом, чтобы получить остаток, который растворяют в ацетоне (100 мл) . Ацетоновый раствор концентрируют под вакуумом, чтобы удалить остаточные

I пиридин и уксусную кислоту. Эту ста-, дию повторяют трижды. Остаток растворяют в ацетоне (50 мл), добавляют воду (50 мл) и смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение

16 — 20 ч до завершения кристаллизации. Кристаллы отделяют фильтрованием, промывают нодой и высушивают в о вакуумной печи при 50 С, получая

170 мг кристаллического пропионилпроиэводного А80190 (т.пл. 83 — 85 С) .

Мол . мас с а равна 884 по МСПД и МСБАБ, ИК н СНС1з показывает максимум полос поглощения при следующих частотах, см : 3018, 2976, 2935, 2827, 1725, 1460, 1376, 1313, 1160, 1105,1082, 1058,!024, 987, 979, 945, 935 и 893.

)) р и м е р ы 10 - 12, Следукщие сложно-эфирные производные А80190 могут быть получены по методике примеров 8 и 9: н-гептаноильное производное А801 90, валерил-производное

А801 90, трет-бутирил-производное

А80190.

Пример 13. Получение 4-бромфенилуретан-производного А80190.

А801 90 (кислотная форма, 7 г) растворяют в. бенэоле (100 мл) и при лев ремешивании добавляют 4-бромфенилизо иианат (3 r) н бенэоле (100 мл), Смесь перемешивают при комнатной тем1861 16

380)90.

Пример ы 16 — 23. Следующие уретановые.производные могут быть получены, используя методику примера )3: фенилуретан-производное 18О190; 4-метилфенилуретан-производное А801 90;

4-йодфенилуретан-производное А80190;.

4-фторфенилуретан-производное А80190; циклогексилуретан-производное А80190;

2-фенилэтилуретан-производное А80)90;

55 пературе в течение 168 ч. Реакцию контролируют ежедневно ТСХ на силикагеле, используя аиетонитрил: ацетон

5 (1:1) в качестве проявляющего растворителя, и детектируют с помощью распылительного вещества — смесь ванилина и H SO<. Реакция завершается эа

168 ч. Образующийся осадок отделяют

I ð фильтрованием, а фильтрат, содержащий производное и некоторое количество непрореагированшего ASO)90, концентрируют и лиофилизируют, получая

7 5 г продукта реакции.

Этот продукт растворяют в ацетонитриле (50 мл) и вводят в колонку, содержащую 800 мл силикагеля (фирма

Woe1m, 70 — 150 меш) в ацетоннтриле.

Колонку проянляют ацетонитрилом, со20 .,бирая первую фракцию, имеющую объем

500 мл, пять последующих фракций по

100 мл каждая, а затем шесть фракций по 500 мл каждая. Элюирование контролируют с помощью ТСХ на силикагеле.

25 Кристаллы образуются в четвертой фракции после стояния при комнатной температуре в течение ночи. Кристаллы отделяют фильтрованием и высушинают под вакуумом, получая 639 мг

30 4-бромфенилуретан-произнодного

А801 90.

Фильтрат высушивают, Остаток растворяют в диоксане (50 мл1 и лиофилиэируют, получая дополнительное количество продукта (477 мг) . Пятую по десятую фракции объединяют и концентрируют досуха. Остаток растворяют в ацетонитриле (50 мл) и лиофилизируют, получая дополн ительно 2, 3 ) амо рфно40 ro 4-бромфенилуретан-производного

А80190, Это соединение имеет следующие хара кте рис тики: т. пл. 142 — 145 С, (.) ) ), = +4 С (c 10, СНС1 ) . Мол. масса 1025 (YCBAB) .

45 Пример ы 14 — 15, Следующие уретановые производные А80190 получают, используя методику примера 13:

4-хлорфенипуретан-производное А80190 и 4-нитрофен илуретан-произнодное

I8

17

1531861

2-фенип-циклопропилуретан-производное

А80190; 4-феноксифенипуретан "производное А80190.

Пример 24. Получение метилэфирного производного А80190.

А80190 в кислотной форме растворяют в метаноле, добавляют воду (1/2 объема). Раствор оставляют до тех пор, пока не образуется эфирное производное. Раствор выпаривают под вакуумом. Продукт реакции хроматографируют, используя, например, сйликагель и получая метилэфирное производное

А80190.

Пример ы 25 — 27. Используя методику, подобную в примере 24, и соответствующий спирт ипи тиол получают следующие эфирные производные

А80190: н -пропилэфирное производное

А80190; метилтиоэфирное производное

А80190; н -бутилэфирное производное

A80I90.

Пример 28 . Хроматографичес кая идентификация А80190.

I. ТСХ на силикагеле. Система: ацетонитрил — ацетон (1: 1) . Rf О. 59.

Детектирование: Вас il lus subt il is.

Распыление смесью ванилин — H

II, ЖХВП (жидкостная хроматография высокой производительности), Адсорбент: pBondapak С 1 (4х300-мм колонка), Система растворителей: ацетонитрил — тетрагидрофуран - вода (6:1:3), содержащая 17. НзРО . Доводят рН до

3,0 с помощью NH

3,0 мл/мии. Время удерживания 9,7 мин.

Пример 29. А80190 получают по методике примера 1, но используя

Actinomadura oligosporus NRRL 15877 культуру.

Пример 30, Рацион цыплят, модифицированный А80190 для борьбы с кокцидиозом.

В табл. 6 приведен сбалансированный, высококалорийный рацион, приспособленный к откармливаемым цыплятам для быстрого привеса.

Эти вещества смешивают в соответ» ствии со стандартными методиками сме1 шивания кормов. 11ыплята, откормленные таким рационом с водой, устойчивь к кокцидиозу.

Пример 31. Рацион мясного скота, улучшенный добавкой А80190.

В табл. 7 приведен сбалансированный сильно раздробленный рацион для мясного скота.

Смешанный корм сжимают в кормовые гранулы. При среднеежедневной норме поглощения, равной 15 Фунтов корма на животное, в корм вводят приблизительно 300 мг А801 90 (Na-соль) на животное в день.

П р н м е р 32. Рацион для свиней, улучшенный добавкой А80190.

В табл. 8 показан сбалансированный рацион для опоросных свиней.

Для 200 фунтов (90,72 кг) этого рациона премнкс получают добавлением

f5 А80190 (10 r) к малому количеству экстрагированного растворителем соевого корма. Этот премикс затсм добавляют к 200 фунтам описанного свиного рациона, смешивая стандартными способами. Этот лечебный корм обеспечивает уровень 100 г А80190 на 1 т .сновного рациона, Лечебным кормом откармливают свиноматок в течение одного дня, предпочтительно 7 — 10 дней до опороса, введение этого корма после опороса также является желательным.

Свиноматок откармливают при нормах l, 0 — 10 r A80190 на 100 фунтов (45,36 кг) корма, Лечебный корм пред30 оставляется с водой, Обычно свиноматки потребляют примерно 6 — 8 фунтов (2,72 — 3,63 кг) рациона в день °

Пример 33. A80190 — рецептура для поросят.

А801 90 растворяют в малом количе», стве этанола. Этот этанольный раствор суспендируется в полиэтиленгликоле

200, Суспенэию концентрирует так, чтобы каждая единичная доза имела

40 объем примерно 0,5 — 2 мл. Такие сус: пензии дают молодым свиньям при нор-. мах О, 5 — 50 мг на фунт три раза в день путем принудительного откорма.

Пример 34. Улучшенный рацион (премикс) для борьбы со свиной дизентерией приведен в табл. 9.

Этот премикс добавляют к обычному свиному рациону, используя стандарт..ные методики смешивания кормов, полу50 чая конечный уровень активного соединения 100 г/т.

Показ сииергического действия

А80190 с никарбазином осуществлен следующим образом: бройлерных цыплят

55 однонедельного возраста распределяют в клетки по пять птиц и откармливают, лечебным и контрольным рационами в течение одного дня, после чего заражают ооцистами, вызывающими кокциди19 1 53 1861

Цыплят содержат на соответствующих рационах в течение определенного периода времени, обычно 7 дней, Для лечения используют четыре группы цып лят. гс

Балльные оценки кишечного повреждения A80190 (ppm) приведены в табл. 1О.

Балльные оценки цекального повреж. дения А80190 (ppm) приведены в табл. 11.

Привес (г/цыпленок) А80190 (ppm) приведен в табл. 12.

Фо рмула изо6 ре тек ия

Способ получения полиэфирного антибиотика А80190 формулы

Испытание. Цыплят инокулируют

200,000 ооцистами Einuria acегоulina (штамм Липли 59); 60,000 ооцистами

Еinurià maxima (штамм FS-177) и

40,000 ооцистами Е1паг1а tenella (штамм FS-155) .

Ие Ne. к ой о фо К ме ц (у, OR

НО С

Ме

25 ипи его соли, включающий культивирование штамма микроорганизма Actinomadura oligosporus ИВЫ 1 5877 или штамма микроорганизма А.oligosporus

NRRL 15878 на питательной среде ° со30 держащей усваиваемые источники углерода, азота и неорганических солей в . условиях глубинной аэробной ферментации при 30 — 32 С с последующим вью делением антибиотика. в которой R является водородом или

-C0NHR

19

R, — алк ил, арил, алк ил-арип, а р ила лк ил, г ало идар ил, н ит ро а рип, гало ида рилалк ил, алкоксиарип, арилоксиарил, арипциклоалкил, ациларил и циклоалкип, ипи ацил, алкил сложно эфирное или алкилэфирное производное, Та блица 1

NRRf, 15878

А.масга

Агаровая среда

Xoроший (влажная поверхность) ISP У 2

Рост:

61. Зелен. желтый. Коричневый

Отсутствует

Очень светло-коричне— вый

Плохой

93. )желтовато-серый

Следы. черно-белый

Несколько разбросанных отдельных комков

Отсутствует

Плохой

ОС:

БИ;

РП:

Посредственный

5. Молочный. Розовый

Отсутствует

ISP К 3

Рост .

ОС:

ВИ:

Отсутствует

От посредственного до плохого

РП:

Рост:

ISP У 4

ЯМе

И 1 Ме о

Ме

Избыточный

39. Зел.-желтый. Красный

Ус тричный

43. Краснткоричневый

56. Темно-коричневый

0 i с. О тс ут с твует

Очень. светло-коричневый

1531861

ОС:

ВМ:

РП:

Рост:

ОС:

ВМ:

РП:

Рост:

Отсутствует

Хо роший

Устричный

Отсутствует

Отсутствует

1$РУ5

48.

ISP Н 7

48.

ОС:

ВМ:

РП:

Рост:

ОС:

ВМ:

РП:

Рост:

Чапека

93.

Эмерсона

Xo porn

ОС:

267 .

PII:

Рост:

Отсутствует

Хороший (влажная поверхность)

90. Зеленовато-желтый. 26, Жел тый

Отсутствует

Лс -ОС:

Глюкоза+

+парагин

BY.:

РП:

Рост:

Отсутствует

Томатная паста

Овсяная

Хороший

Рост: мука

ОС:

39.

ВМ:

Отсутствует

РП:

Рост:

Дрожжи+ декстроза

ОС:

59.

78.

Темно -к о р ичн е в ый

Незначительные следы

Се рый

Темно-коричневый

Посредственный

Темно-желтый

Че рный

BY!

PII:

Рост:

ОС:

Бутират натрия

93, Желтовато-серый

Следы: че рно-белый

Несколько разбросанных отдельных комков

Отсутствует

Плохой

93. Желтовато-серый

Отсутствует

Отсутствует

Плохой (влажная поверхность)

79,1. Зел. †.желтый, Желтый. Ко ричневый

Отсутствует

Светло-коричневый

Посредственный

93. Желто -се рый

Отсутствует

Отсутствует

Хороший (к ромк и, шелушащиеся с обратной стороны)

77. Молочный. Желт.коричневый

Отсу тс твует

Избыточный (влажная поверхность)

79, l Зел. -желтый.

Желтый. Коричневый

Отсутствует

Избыточный (влажная поверхность)

81 ° Теми.-эел.-жел.— коричневый

Отсутствует

Темно -ко рич не вый

Хороший

93, Жел то -се рый

22

Продолжение табл.3

Молочный. Розовый

Отс утств уе т

Пос редс твенный

V, Устричный

Отсутствует

Отсутствует

Посредственный

Желто-серый

Отсутствует

Отсутствует

Черный

Следы: 5 Ге

3 ел . -жел тый.

Красно-коричневый

Отсутствует Хороший

S Желто-розовый

Посредственный

Белый — 7 са I

Желт.-розовый

Отсутствует

Зел. -желтый.

Красный, Устричный

Следы. 2 Белый (только кромки)

Отсутствует

Избыточный (влажная поверхность) 24

Продолжение табл.1

1 531861

Посредс твенный ф. Белый

Отсутствует

Посредственный

93. Желто -серый

Отсутствует

Отсутствует

ВМ:

Отсутствует

Отсутствует

Посредственный

26 ° S Желто-розовый

Отсутствуе т

Отсутствует

РП:

Кальциевая Рост: соль яб- 0C: почкой ВМ: кислоты РП:

П р и м е ч а и и е. ОС - обратная сторона, BN - воздущный мицелий, РП вЂ” растворимый пигмент.

Продол»кение табл. 2

) г 1 з

Таблица 2

Источник углерода NRRL 15878 А.масга

1 2

D Мелибиоза

Раффино з а

1-Рамноза

25 Рибоза

Салицин

Сахароза

Трегалоза

Ксилит

30 D-Ксилоэа

НН

НП

НП

НП

35 ли испольэуетс,я, НП вЂ” не проводили испытания.

Антибиотик

Концентрация NRRL 15878 А.масга

П р и м е ч а н и е + — устойчив (отсутствуют эоны ангибирования); — - чувствителен (зоны ингибирования).

Контрольный

Адо»»ит

L-Арабиноза

Целлобиоз а !

Церлюло з а

Декст ран

Р-Фруктоз а

D-Галактоза

D-Глок оз а

Бис-иноэит

Инулин

D-Лак то за

Маннит

D-Манноза

D-Мелезитоза

Ба ци тра цин

Цефалотин

Гентамицин

Линкомицин

Неомицин

Олеандомицнн

Пенициллин С

Рифампин

Стрептомицин

Тетрациклин

Тебрамицин

Ванкомицин

10уд.

301» г

10ы r

21»г

30р г

15»» г

10 ед, 5и г

10»» r

30»» r

1Ор r

30р г

П р и м е ч а н и е. + — используется; — — не используется;

+ - сомнительный ес-.

1531861

Таблица 4

Сходства

Различия

Антибиотическая устойчивость

Морфология

Физиологические свойства

Картина использования угле рода

Культуральные характерис тики

Синтез полиэфира

Дефицит воздушных гифов

Деградация эскулина, деградация гипоксантина, редуиирование нитрата

Форма и размеры спор

Температурный предел

Продуиирование уреазы

Тест

Образование воздшуных гифов

Картина использования угле рода

Редко

Редко (си. табл. 2) Различная

Каталазная де градация. аде нина кальциевой соли яблочной кислоты казеина митина

ДНК элас тина эксулнна мелатины гуанина гипоксантина

Красноораюкевый

Бес цве тный кератина крахмала тестостерона тирозина ксантина

Культивирование в жидкой среде

Культивирование на бутирате Na

Продуцирование H

Меланоидные пигменты

Толерантность к NaCl Х

Таблица 5

NRRL 1 5878 А.масга

1 531861

27 (см., табл. 3)

Не проводили

Коричн.о рянж.

Коричневый

R -I1

Гладкая

15 — 37

Различная

Зелен.- коричн.

Коричневый

R - È

Гладкая

15 — 42

Продолговатая

От 0,5-0,7 до

0,9-1,3р m

Овальная

От 0,8-1,0 до

1,2-2,0 рт

Содержание

Составная часть редуцирование нитрата

Фосфатаза

Синтез полиэфира

Картина устойчивости к тибиотикам

Устойчивость к лизо циму

Окраска обратной стороны

Растворимый пигмент

Пепи спор

Нове рхно сть спо р

Температурный предел, С

Продуцирование уреазы

Форма спор

Размеры спор

Молотая желтая кукуруза

Соевая мука со снятой кожицей, экстрагированная растворителем, тонко размолотая, 50Х белка

Животный жир (топленый говяжий жир)

Высушенная рыбная мука с растворимыми веществами (607. белка)

Кукурузная барда с растворимыми веществами

Дикальций фосфат, кормовой сорт

Карбонат кальция

Витаминный премикс (представляющий витамины А, D, Е, К и В, холин, ниацин, панто!

1 геновую кислоту, рибофлавин, биотин с глюкозой в качестве наполнителя )

Следы минерального премикса (представляющего MnSO<- ZnO, КС, FeSO, СаСО )

2-амино-4-оксимасляная кислота (ок с иан ало г ме т ионин а)

А80190 (Na-соль) Продолжение табл.5

Таблица Ь

Х к г (фун ты) 50 453, Ь (1000) 31, 09 282,05 (621,8) 6, 5 58, 97 (130) 5, 0 45, 36 (100)

4, 0 36, 29 (80) 1, 8 1Ь, 33 (36)

0,9 7,26 (16) 0,5 4,54 (10) 02 1 81 (4) 0,1 О, 9l (2)

0,01 0,09 (0,2) 29

1 53!861

Таблипа7

Соде ржан ие

Составная часть

А кг (фунты) 67, 8 615, 08 (1356)

10 90, 72 (200) Тонко размолотая кукуруза

Молотая кукурузная початка

Обезвоженная люцерновая мука, 17Х белка

Соевая мука со снятой кожицей, экстрагированная растворителем, 50Х -белка

Тростниковосахарная меласса

Иочевина

А 80190 (Na-соль)

Дикальций фосфат, кормовой сорт

Карбонат кальция

Хлорид натрия

Следы минерального премикса

Витамины А и D премикс

Витамин E премикс "

Пропнонат кальция

45,36 (100) (199, 912) (1 00) (12, 0) (О, 088) 90, 68

45, 36

5,44

0,04

9, 9956

0,6

О, 0044 (10,0) (10,0) (6, О) (О, 6) (1,4) (l,0) (3, О) 4,54

4,54

2,72

0,27

О, 635

О, 454

1,36

0,5

0,3

0,03

0,07

0,05

0,15

Содержащий на фунт (453,6 г): 2,000.000 М.Е, витамина А, 227.200 N.E. витамина D и 385,7 г соевого корма с добавлением 1Х масла.

Сухая кукурузная барда с растворимыми веществами, содержащими 20.000 М.Е. О-альфа-токоферилацетата на @унт.

Табл ица8

Содержание

Составная часть кг/т (фунт/т) 65,10 590,59 (1 302) Молотая желтая кукуруза

Соевая масляная мука со снятой кожицей, экстрагированная растворителем

Высушенный свекловичный жом

Дикальций фосфат

Карбонат кальция

Свиной витаминный премикс

Соль (NaC1)

Холин хлорид, 25Х

Следы минерального премикса

167,83 (370) 90,72 (200) 26,31 (58) 10,89 (24) 9, 98 (22) 4,99 (11) 3, 175 (7) 1, 36 (3) 18,50

10,00

2,90

1,20

1,10

0,55

0,35

0,15

1 531 861

Продолжение табл.8

Содержание

Составная часть

Х кг/т (фунт/т) Витамин А — премикс +»

Окси-аналог метнонина

О 10 О 91 (2)

О, 05 0,454 (1) Таблица 9

Соде рж ан ие г/кг

Составная часть

150, О

20,0

Актив ное соединен ие

Силикат кальция

Карбонат кальция (мука иэ устричной скорлупы) 830,0

Таблица 10

Никарб а.з ии (ppm)

8 (12

20.

3,50

0,13

0,0

5,94

0,19

0,50

0,0

8,63

5,13

l,63

0,56

0,0

О

l 25

9,13

9,13

8,88

8,90

8,66

0,08

1,19

0,0

0,0

Ф

l кг премикса содержит следукнцие составные части: 77.161 Е. Государственной фармакопеи ClllA (USP) витамина Dy, 2,205 И.Е, витамина Е; 441 мг рибофлавина; 1,620 мг пантогенной кислоты;

2,205 мг ниацина; 4,4 мг витамина В,; 441 мг витамина К; 19,180 мг холина; 110 мг дюлиевой кислоты; 165 мг пирндоксина, 110 мг тиамина и 22 мг биотина.

«» 1 кг премикса содержит следующие составные части: 50 r марганца в виде сульфата марганца, 100 г цинка в виде карбоната цинка, 50 r желеэа в виде сернокислой, соли эакиси желеэа, 5 г меди в виде окиси меди, 1, 5 r йода в виде йодида калия и 150 г максимум и 130 r минимум кальция в виде карбоната кальпия. " 1 кг премикса содержит 6,6138 00 USP Е. витамина А.

- 34

1531861

Т а б л и ц à 11

Никарбаэин (p pm) 16 20

0,0

0,19

0,06

1,19

0,56

О,О

Таблица 12

Никарбаэин (ppn) 20

261

272

279

251

266

283

Составитель И. Тареева

Редактор А.Мотыль Техред Л.Олийнык Корректор М.Максимишинец

Заказ 7971/59 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, X-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. ужгород, ул. Гагарина, 101

О

125

О

125

3,44

3,19

3,50

3,17

3,19

0,33

147

159

174

211

222

279

2,63

2,38

0,92

l,00

0,54

236

268

279

258

276

l,75

0,31

0,19

0,58

284

258

289

- l