Способ получения ингибитора с @ /м @ зависимой эндонуклеазы

 

Использование: биохимия, получение ингибитора Ca/Mg-зависимой эндонуклеазы лимфоцитов. Сущность изобретения: в качестве объекта выделения используют лимфоциты периферической крови или селезенки человека, или крупного рогатого скота при злокачественных лимфопролиферативных заболеваниях, наиболее предпочтительно - при хроническом лимфолейкозе, из лимфоцитов выделяют клеточные ядра в растворах сахарозы возрастающей плотности (от 0,25 до 2,0 М), клеточные ядра экстрагируют растворами 0,3-0,6 М NaCI или KCI в присутствии 0,075-0,1 %-ного тритона X- 100, экстракты высаливают сульфатом аммония в количестве 80-85% насыщения и из обессоленного осадка выделяют ингибитор с помощью высокоэффективной жидкостной колоночной хроматографии.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4911591/13 (22) 28.12.90 (46) 23.09.92. Бюл. М 35 (71) Научно-производственный центр медицинский биотехнологии (72) Н.Н.Ходарев, И.В.Чупырина, И.А.Соколова, Т.И.Ткачева, С.С.Кирзон, Ф.E.Ðîìàíцев, О.А.Пчелинцева и И.И.Вотрин (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА

Са/Mg-ЗАВИСИМОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ (57) Использование: биохимия, получение ингибитора Са/Mg-зависимой эндонуклеазы лимфоцитов. Сущность изобретения: в качестве объекта выделения используют

Изобретение относится к биохимии, в частности к получению ингибиторов нуклеаз.

Ингибиторы нуклеаз могут быть использованы для дифференциального подавления активности отдельных ферментов в инкубационных смесях, содержащих несколько нуклеаз. Они также могут применяться для получения интактных препаратов нуклеиновых кислот и для аффинной хроматографии нуклеаз. Исследование ингибиторов нуклеаз важно для понимания механизмов регуляции этих ферментов в клетке.

Ингибитор Са/Mg-зависимой эндонуклеазы в литературе не известен и получен впервые. Известны природные ингибиторы бактериальных эндонуклеаз. В частности, получен ингибитор внеклеточной ДНКазы

Ассуповусез!ечог! з 2789. Ингибитор выде,, ЫЛÄÄ 1763488 A1 (и)5 С 12 N 9/16, 6 01 N 27/26 лимфоциты периферической крови или селезенки человека, или крупного рогатого скота при злокачественных лимфопролиферативных заболеваниях, наиболее предпочтительно — при хроническом лимфолейкозе, из лимфоцитов выделяют клеточные ядра в растворах сахарозы возрастающей плотности(от 0,25 до 2,0 М), клеточные ядра экстрагируют растворами 0,3-0,6 M NaCI или KCI в присутствии 0,075-0,1 (,-ного тритона X100, экстракты высаливают сульфатом аммония в количестве 80-85; насыщения и из обессоленного осадка выделяют ингибитор с помощью высокоэффективной жидкостной колоночной хроматографии. ляли из экстрактов мицелия культур, фракционируя их сульфатом аммония и хроматографируя на сефадексе G-100 и

KM-целлюлозе, Ингибитор был охарактеризован как лабильный белок с ph 7,8 — 8,2, специфичный к ДНКазе 1 А.levorls 2789 (1).

Известны также природные ингибиторы эндонуклеаз, полученные из тканей животных.

Например, из селезенки телят выделен ингибитор ДНКазы 1 (панкреатической), Ингибитор выделяли, фракционируя экстракт сульфатом аммония и хроматографируя активные фракции на геле окиси алюминия и

ДЭАЭ-целлюлозе. Ингибитор был идентифицирован как G-актин или близкородственный ему белок (2). Данный ингибитор не действует на Са/Mg-зависимую эндонуклеазу клеточных ядер, в частности из лимфоидных тканей. Природные ингибиторы

Са/Mg-зависимой эндонуклеазы в литературе не описаны и нами получен впервые.

1763488

Цель изобретения — получение природного ингибитора Са/Mg-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов.

Поставленная цель достигается тем, что для получения ингибитора используютлимфоциты периферической крови или селезенки крупного рогатого скота или человека при злокачественных формах лимфопролиферативных заболеваний — наиболее предпочтительно при хроническом лимфолейкозе (ХЛЛ), причем ингибитор вы деляют не из целостных клеток, а из изолированных клеточных ядер, Для этого клеточные ядра экстрагируют раствором, содержащим 0,3 — 0,6 М KCI с 0-0,1 -ным тритоном Х-100, экстракт фракционируют сульфатом аммония до 80 — 85 насыщения и активные фракции после растворения и диализа подвергают обессоливанию на колонках с G-25 и высокоэффективной жидкостной колоночной хроматографии на катионообменных колонках "Мапо S" (Фармация, Швеция), с элюцией градиентом хлористого натрия от 0 до 0,5 M. Способ позволяет получить препарат, обладающий выраженной ингибирующей активностью по отношению к Са/Mg-зависимой эндонуклеазе клеточных ядер лимфоцитов. Ингибирующая активность специфична, так как препарат не ингибирует ДНКазу 1 и микрококковую нуклеазу и связана с белком.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Лимфоциты периферической крови, полученные от коровы, большой хроническим лимфолейкозом, суспендировали s рpа сcт вBоoрpеe, содержащем 10 mM трисHCI, рН 8,0, 3 вМ MgCI2, 0,9 М сахарозу и

0,002 / тритона Х-100 (ТМ С-0,9); на 10 лимфоцитов использовали 10 мл среды. Суспензию гомогенизировали в гомогенизаторе

Э вел ьгейма-Поттера и наслаивали на 10 mM трис-HCI, рН 8,03 mM М9СЬ, 1,2 М сахарозу в соотношении 3:1. Пробы центрифугировали при 1500 — 2000 g 10 мин при 4 С. К осадкам добавляли 10 мл TMC-0,9, тщательно суспендировали и повторно центрифугировали в том же режиме, Осадки были представлены интактными клеточными ядрами.

Клеточные ядра суспендировали в 10 mM трис-HCI, рН 7,4 — 7,6, до конечной концентрации 2 мг/мл (по ДНК). К суспензии добавляли 3 объема 0,4 M KCI, 0,1 тритона Х-100 в 10 mM трис-HCI, рН 7,4 — 7,6 (конечные концентрации KCI и тритона Х-100 составляли

0,3 М и 0,075 соответственно) и перемешивали на ледяной бане 30 — 60 мин. После этого пробы центрифугировали при 24000 g

15 мин, 4 С, Осадки отбрасывали. В надосадках ("экстрактах") содержались неги5

55 стоновые белки хроматина и ингибирующие факторы. Специальные исследования относительно условий экстракции показали следующее. При конечной концентрации KCI в экстрагирующей смеси 0,3 М (см. выше) степень экстракции ядерных белков составляет

21 (степень экстракции определяли по формуле (а/а+Ь) * 100, где "а" — количество белка в экстракте, "b" — количество белка в осадке). При снижении конечной концентрации KCI (до 0,2 и 0,1 М) степень экстракции существенно снижалась, снижался и выход целевого продукта. При повышении концентрации KCI до 1,0 М степень экстракции белков возрастала до 45-50, однако активность ингибитора в экстракте не возрастала после концентрации 0,6 М. Введение в экстрагирующую смесь тритона Х-100 в конечной концентрации 0,05-0,075 повышало степень экстракции белков в присутствии 0,3 M KCI до 46, при этом активность ингибитора возрастала на 20-25 . Другие исследованные условия экстракции ядерных белков — ультразвуковая обработка ядер, экстракция гуанидинхлоридом в присутствии дитиотрейтола, применение только триона — Х-100 — давали худшие результаты.

Полученные экстракты фракционировали высаливанием сульфатом аммония. Для этого пробы обессоливали на сефадексе G25 и при непрерывном перемешивании добавляли сухой сульфат аммония до 80/ насыщения. Сформировавшийся осадок отделяли центрифугированием при 100000 g, 1 ч, 4 С; надосадок отбрасывали. Применение высаливания сульфатом аммония обеспечивало концентрирование образцов, освобождение от части балластных белков и стабилизацию ингибитора. Полученные осадки могли храниться при 4 С без потери активности 1 месяц. Понижение концентрации сульфата аммония до 70 приводило к снижению выхода ингибитора на 10-15 и снижению стабильности препарата. Повышение концентрации сульфата аммония до

85 и 90 не приводило к изменению результатовв, Осадок, полученный после высаливания, растворяли в минимальном объеме 10

mM трис-HCI, рН 7,4 — 7,6 и обессоливали на колонках с сефадексом 6-25. Обессоленный образец, содержащий 1 — 1,5 мг белка в 1-2 мл, наносили на катионообменную колонку

"Mono S" (система FPLC, Фармация, Швеция), предварительно уравновешенную тем же буфером. Скорость нанесения составляла 0,1-0,2 мл/мин. После нанесения образца колонку промывали 5 — 7 мл того же буфера со скоростью 1 мл/мин, после чего

1763488 начинали элюцию сорбированных белков линейным градиентом NaCI от 0 до 0,5 M в том же буфере. Скорость элюции — 1 мл/мин, давление — 1,0-1,5 МРа, обьем градиента — 10 мл. Собирали фракции обьемом

0,5 или 1,0 мл и анализировали их на ингибиторную активность.

Активность ингибитора определяли следующим образом. Готовили инкубационные пробы, содержащие 40 мкл 10 mM трисHCl, рН 7,6, 10 mM М9С!ъ 1 mM СаСЬ, 10 п1М 2-меркаптоэтанол и 10 ед Са/Mg-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов здоровых животных. Пробы готовили в лунках 96-луночных микроплат.

За единицу активности фермента принимали его количество, достаточное для полного расщепления 0,1 мкг ДНК il-фага за 2 часа инкубации при 37 С в средах, содержащих

10 mM MgClz, 1 mM СаС!г. Полноту расщепления контролировали электрофорезом в гелях 0,8 агарозы.

К инкубационным пробам добавляли 10 мкл каждой фракции градиента и инкубировали на льду 5 — 10 мин. Затем в пробы вносили 1 мкг ДНК Л -фага и инкубацию продолжали в течение 2 часов при 37 С.

После этого в пробы вносили 5 мкл 50 глицерина с 2,5 бромфенолового синего и наносили их на горизонтальный блок геля

0,8 агарозы, Электрофорез проводили при напряжении 150 В; гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в отраженном ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм, Во фракциях, соответствующих концентрации NaCI от 0,25 до 0,3 М, обнаруживалось сохранение интактной (нерасщепленной) ДНК А-фага, что говорит о присутствии в них ингибитора Са/Mg-зависимой эндонуклеазы.

За единицу активности препарата ингибитора было принято такое его количество, которое обеспечивало ингибирование 10 ед

Са/Mg-зависимой эндонуклеазы на 1 . Выход ингибитора составлял 12000 ед/мг ДНК исходных ядер, удельная активность — 600 ед/мкг белка, очистка — в 100 раз по отношению к экстракту, По данным электрофореза в полиакриламидных гелях cдодецилсульфатом натрия и обработок препарата различными протеазами, ингибирующая активность препарата связана с полипептидами размерами от 60 до 67 к0.

Пример 2. Все операции проводили аналогично примеру 1, за исключением то го, что использовали лимфоциты периферической крови людей, больных хроническим тивности обнаружить не удалось.

Пример 5, Все приемы выполняли аналогично примеру 1, за исключением того, что определяли действие ингибитора на

45 Са/Mg-зависимую эндонуклеазу клеточных ядер лимфоцитов селезки здоровых животных и человека. 120 ед препарата ингибировали активность фермента селезенки крупного рогатого скота на 100, а селезен50 ки человека — на 80 .

Пример 6. Определяли действие ингибитора на коммерческие препараты

ДНКазы (панкреатической), ДН Казы II (селезенки свиньи) и микрококковой нуклеазы.

55 Количества фермента подбирали так, чтобы электрофоретическая картина расщепления

ДНК А -фага была. сходна с таковой для используемых количеств Са/Mg-зависимой эндонуклеазы. Соответствующие количест5

40 лимфолейкозом, и активность ингибитора определяли непосредственно к экстрактах клеточных ядер, Пример 3. Для препаративного выделения ингибитора использовали селезенку

КРС, больного спонтанным ХЛЛ, Все процедуры выполняли как описано выше, за исключением того, что клеточные ядра выделяли следующим образом, В опыт брали 0,2 кг селезенки, Образец измельчали в мясорубке. Полученную массу переносили в 5-литровую колбу и заливали 2 л охлажденного буфера А (0,9 NaCI, 0,5 Na-цитрат, 10 мМ трис-HCI, рН 7,6). Колбу переносили в баню со льдом и содержимое перемешивали, интенсивно вращая колбу 30 мин. Полученную суспензию фильтровали через 4 слоя марли и фильтрат центрифугировали при 5000 g 30-40 мин. К осадку добавляли 1 л буфера В (0,25 М сахарозы, 0,4 нонидет

P-40, 5 мМ СаС!г, 50 мМ трис-HCI, рН 8,5) и гомогенизировали порциями по 60 мл в гомогенизаторе Поттера. Гомогенат фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали при 5000 g 30 мин, По данным микроскопии осадок более, чем на

90 состоял из лимфоцитов. К осадку добавляли 500 мл буфера С (1,0 Мсахароза,,5 мМ СаС!, 50 мМ трис-HCI, рН 8,5, 0,4 нонидет P-40) и интенсивно гомогенизировали. Гомогенат центрифугировали при 50000

g 30 мин. Осадки суспендировали в буфере

С и наслаивали в 100-мл центрифужных пробирках на 20 мл буфера Е (2,0 M сахароза, 50 мМ трис-НС!, рН 8,5, 5 мМ СаС!2) и центрифугировали при 70000 g 2 часа.

Пример 4. Для выделения ингибитора использовали клеточные ядра, полученные из лимфоцитов периферической крови здорового животного. Все этапы проводили аналогично примеру 1. Ингибирующей ак1763488

Действие ингибитора на различные нуклеазы.

ДНК-А, фага

Ингибратор, к-во на пробу е

Количество на пробу

Степень ингибрирования

Фермент

Ca/Mg-энда ЛПК

KPC

10 ед

120

1 мкг

Са/Mg-эндо селезенки человека

120

10 ед

79,8 %

1 мкг

Са/Mg-эндо селезенки теленка

10 ед

1 мкг

ДН К-аза 11 селезенки свиньи

2ед

120

40%

1 мкг

0,15 мкг

120

ДНК-аза I

1 мкг

2ед

120

Микрококковая н клеаза

1 мкг

П р и м е ч а н и е, Единицы измерения ДНК-азы 1, ДНК-азы 1(, микрококковой нуклеазь приведены в соответствии с используемыми фирмами — производителями (см."Методы" ).

Составитель Н. Ходарев

Редактор Н. Козлова Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Л, Ливринц

Заказ 3430 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ва составили 0,15 мкг ДНК для ДНКазы 1, 2 ед/Мкг ДНК для ДНКазы 11 и 2 ед/мкг

ДНК для микрококковой нуклеазы. 120 ед препарата не оказывали влияния на активность ДНКазы (и микрококковой нуклеазы, нр ингибировали ДНКазу на 40% (см. таблицу).

Таким образом, способ позволяет-получить из клеточных ядер лимфоцитов больных хроническим лимфолейкозом ингибитор Са/Mg-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов. Ингибитор отсутствует в клеточных ядрах лимфоцитов здоровых особей и проявляет специфичность к Са/Mg-зависимой эндонуклеазе, не действуя или ингибируя в меньшей степени некоторые другие нуклеазы — ДНКазу I, ДНКазу И и микрококковую нуклеазу. Это позволяет применять его для дифференциального ингибирования Са/Mg-зависимой эндонуклеазы, а также может быть использовано в диагностике хронического лимфолейкоза. Для полученного ингибитора предлагается термин "лейкозин".

Формула изобретения

Способ получения ингибитора Са/Mg5 зависимой эндонуклеазы, заключающийся в том, что клеточные ядра лимфоцитов периферической крови и селезенки человека или крупного рогатого скота при злокачественных формах лимфопролиферативных забо10 леваний, выделяют из лимфоцитов путем дифференциального центрифугирования в растворах сахарозы возрастающей плотности от 0,25 до 2,0 М, экстрагируют раствором хлористого калия или хлористого

15 натрия в концентрации от 0,3 до 0,6 M в присутствии тритона Х-100 в концентрации от 0075 до 0,1%, полученный экстракт высаливают сульфатом аммония в количестве

80 — 85 насыщения, осадок обессоливают

20 на сефадексе G = 25 и ингибитор очищают путем жидкостной хроматографии высокого разрешения.