Способ получения сыворотки крови животных для культивирования клеток животных тканей

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: сыворотку крови животных замораживают при (-15) - (-20)°С, затем оттаивают при комнатной температуре . После расслоения сыворотки верхние светлые слои отделяют и стерилизуют фильтрацией через миллипоровые фильтры. Способ позволяет улучшить ростовые свойства сыворотки. 7 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К, АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4820232/13 (22) 26.04.90 (46) 07.05.93. Бюл. N- 17 (71) Всесоюзный научно-исследовательский ветеринарный институт (72) Н. И. Гурьянов, P. Х. Юсупов, B. П. Коксин, В. А. Гурьянова и Г. Х. Ильясова (56) ТУ Ф С 42-7BC-85 Сыворотка крови плодов коровы жидкая, утв. МЗ СССР 4.04.85 г.

Авторское свидетельство СССР

М 1544800, кл. С 12 N 7/02, 22.02.88.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии для культивирования линий клеток.животных тканей и гибридом.

Целью изобретения является упрощение способа, снижение концентраций ингибиторов роста культур клеток и повышение ростовых свойств сыворотки крови животных, превосходящей по своим показателям сыворотку крови эмбрионов коров, Поставленную цель достигают более полным удалением ингибитороа роста культур клеток, содержащихся в нативной сыворотке крови животных, например, тяжелых фракций белка, остаточного гемоглобина, общих липидов и холестерина, путем замо- розки сыворотки при (-15) -(-20) С е последующим оттаиванием ее при плюсовой (комнатной) температуре, в результате чего сыворотка в емкостях расслаивается; проис- ходит своего рода фракционирование ее,по высоте столба: верхние слои ее светлые, легко подвижные, а у дна емкости слои Сыворотки темно-красные, маслянистые, трудно подвижные, далее проводят сбор светлых

Г (si)s С 12 N 5/00, А 61 К 35/14 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ

КРОВИ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ТКАНЕЙ (57) Использование: биотехнология. Сущность изобретения: сыворотку крови животных заморажиаают при (— 15) — (— 20) С, затем оттаивают при комнатной температуре. После расслоения сыворотки верхние светлые слои отделяют и стерилизуют фильтрацией через миллипороаые фильтры, Способ позволяет улучшить ростовые свойства сыворотки. 7 табл. слоев сыворотки крови до границы ее гемолизированных фракций, а затем стерилизацию через миллипороаые фильтры.

: Счщность изобретения заключается а том, что ингибиторы роста культур клеток из сыворотки крови животных удаляют путем заморозки с последующим оттаиванием, приводящим красслоению сыворотки на отдельные фракции, и сбора верхних светлых слоев сыворотки (до 80 — 90%) до границы ее гемолизироаанных фракций, стерилизации отделенной сыворотки через миллипоровые фильтры, Для четкого представления цели изобретения в табл. 1 приведены концентрации ингибиторов роста культур клеток и других качественных показателей а цельной естественной сыворотке крови взрослого крупного рогатого скота по ТУ 49.24 б-82 и а нативной сыворотке эмбрионов коров по ТУ

ФС 42 7ВС-85, утвержденным Минздравом

СССР 4 апреля 1985 года, последняя из каторых.считается лучшей для культивирования клетокживотных тканей (прототип 2) 1013783

Пример 1. Изучение ряда физико-химических показателей нативных cblBopoток крови кур, бычьей и эмбрионов коров, полученных на базе Казанского мясокомбината.

При изучении физико-химических характеристик нативных сывороток крови животных: определение общего белка, свободного гемоглобина, общих липидов, в

10 том числе общего холестерина, прозрачности и рН установлено. что концентрации в них свободного гемоглобина, общих липядов, в том числе общего холестерина, значительно превышают предъявляемые требования к сывороткам крови для культивирования клеток. Это касается также и нативной сыворотки крови эмбрионов коров, что можно видеть в табл. 2.

Пример 2. Сыворотки крови кур, бычков и эмбрионов коров, полученные по предлагаемому способу (ПСКК, ПСКБ и

ПСКЭК) из соответствующих нативных сывороток (СКК, СКБ и СКЭК).

Способ получения. 25

Технологический процесс по предлагаемому способу включает одну заморозку нативных сывороток крови при (- 15) — (-20) С в течение 24 — 48 ч с последующим оттаиванием их при комнатной температуре, сбор 30 светлых слоев сывороток, начиная сверху, до границы раздела их с гемолизированными фракциями, стерилиэующую фильтрацию и контроль качества полученных сывороток. Если сыворотка заморожена в 35 большой бутыли, то после нескольких часов выдержки при комнатной температуре, ее для более быстрого оттаивания помещают на ночь в термальную комнату при 37 С.

Для данных опытов использованы на- 40 тивные сыворотки крови кур, бычков и эмбрионов коров серии 4 — 88, полученные в лаборатории В КИ В И при Казанском мясокомбинате. Иэ них, соответственно, удалено 1,5 н. {15 ), 2 ч. (20 ) и 1 ч. (10 ) по 45 объему нижних гемолизированных фракций сывороток после их оттаивания.

Физико-химические показатели сывороток крови, полученных по предлагаемому . способу. 50

С использованием общепринятых методов в сыворотках крови по предлагаемому способу и нативных сыворотках определены концентрации общего белка. свободного гемоглобина, общих липидов, в том 55 числе общего холестерина, а также прозрачность и рН. Данные результаты приведены в табл, 3, Иэ табл. 3 видно, что концентрации общего белка, свободного гемоглобина, общих липидов, в том числе общего холестерйна, в сыворотках крови, приготовленных по предлагаемому способу, значительно ниже, чем в нативных сыворотках крови; у них улучшается прозрачность, а рН несколько возрастает, В целом об основных фиэикохимических показателях сывороток крови, полученных по предлагаемому способу, можно сказать следующее: концентрация общего белка в 1,19 — 1,51, свободного гемоглобина в 1,54 — 2.31, общих липидов в

1,84- 2,06, общего холестерина в 1,74- 2,74 раза меньше. чем в нативных сыворотках крови животных.

Фракционный состав белков у сывороток крови, приготовленных по предлагаемому способу, в сравнении с нативными сыворотками крови животных.

Проведен электрофорез сывороточных белков в пластинах линейного градиента полиакриламидного геля (5 — 10 ) на приборе фирмы Хийу Калур (ЭССР). Определена оптическая плотность элюатов альбуминов, а, Р, у -глобулинов. На основании полученных данных проведен расчет содержания отдельных фракций в относительных $, что отражено в табл. 4.

Из табл. 4 видно, что в сыворотках крови, полученных по предлагаемому способу, по сравнению с нативными сыворотками крови животйых возрастает относительная концентрация белков с малой молекулярной массой (альбумины) и снижается концентра- ция у-глобулинов — самых тяжелых сывороточных белков, а концентрации а. и Р

-глобулинов в относительных 7 остаются практически без изменения.

Ростовые свойства сывороток крови, полученных по предлагаемому способу, в сравнении с нативными сыворотками крови животных.

Проведены опыты по изучению ростстимулирующей активности указанных сывороток крови на постоянных линиях клеток.

Сыворотки брались в общепринятой 10%ной концентрации в среде Игла MEM (рН .

7,3) с глутамином и канамицином. Для работы взяты следующие культуры клеток: PK-15 — из почек взрослой свиньи, НГУК-1 — из опухоли гассерова узла крысы, Чего — из почечной ткани взрослой африканской зеленой мартышки, после 72-часового роста в матрасиках емкостью 200 мл. После смешивания суспенэии с сывороткой посевная концентрация клеточной суспензии становилась 60000 клеток/мл. Посевная клеточная взвесь рассеивалась по 2 мл во флакончики емкостью 10 см с посевной

18137 площадью 3 см . Плотность посева — 40000 а клеток/см . Клетки выращивались в термо- . стате при 37 С и подсчитывались через каждые 24 ч после посева. Динамики роста вышеназванных культур клеток по индексу 5 пролиферации с разными сыворотками крови представлены в табл. 5 — 7.

Результаты опытов, указанных в табл. 5-7, на перевиваемых культурах кле- 10 ток РК-15, НГУК-1 и Чего, показали: а) ростстимулирующая активность нзтивных сывороток по индексу пролиферации клеток ниже, чем у сывороток по предлагаемому изобретению; 15 б) в опытах на культурах клеток НГУК-1 и Vего наиболее высокие индексы пролиферации отмечены в присутствии сыворотки крови кур, полученной по предлагаемому способу; . 20 в) при данной плотности посева (40000 клеток/см ) все постоянные линии клеток образовывали монослой через 48 ч. пики количества выросших клеток отмечены через 72 ч после посева;. 25

r) клетки, выращенные на средах Игла

М ЕЫв присутствии 10 сывороток по предлагаемому способу более жизнеспособны: . падение индекса пролиферации происходит медленнее, чем в присутствии нативных 30 сывороток крови животных.

Технико-экономическая эффективность предложенного способа устанавливается по показателям, изложенным ниже.

1. Ростстимулирующая активность как 35 нативных сывороток крови животных; так и сывороток, приготовленных. по предлагаемому способу, отвечает требованиям,. предъявляемым к сывороткам: так при посеве перевиваемых клеток с плотностью 33 — 40

66 тыс. клеток/см сыворотка считается пригодной, если она обеспечивает образование сплошного слоя клеток на 3 — 4 сутки от начала культйвирования, не вызывая в щетках изменений дегенеративного харак- 45 тера, и обеспечивает индекс пролиферации не менее 4 — 6, в отличие от прототипа, где . индекс пролиферации перевиваемых клеток 2,0 — 3.75. В вышеописанных опытах установлено, что при плотности посева-40 50 тыс. клеток/см индекс пролиферации в зависимости от вида сыворотки и линии клеток варьирует в следующих пределах, .:

Нативная сыворотка крови эмбрионов коров в наших опытах обеспечивала индекс 65 пролиферации указанных линий клеток от

6,16 до 7,48, а сыворотка крови эмбрионов коров, полученная по предлагаемому способу, --от 6,60 до 8,31. Нативная сыворотка крови кур обеспечивала индекс пролиферз83 6 ! ции от 6,00 до 8,03, а сыворотка, полученная из нее по предлагаемому способу — от 7,76 . до 8,86. Нативная сыворотка крови бычья обеспечивала индекс пролиферации культур клеток от 5,23 до 6,71. а сыворотка бычья по предлагаемому изобретению — от 6,77 до

7,70, примерно такой же, как с нативными .сыворотками и сыворотками по предлагаемому изобретению из крови эмбрионов ко-, ров и кур.

2. Наряду с ростстимулирующей активностью нативных сывороток крови и сывороток. полученных по предлагаемому изобретению, были установлены и другие их .отличительные ростовые свойства: а) при nepecede клеток в присутствии нативной сыворотки крови бычьей, практически с первых пассажей, наблюдается стертость границ между клетками; они теряют прозрачность и, наконец, изменяют форму, например клетки линии PK-15 становятся угловатыми; время сохранения монослоя 120 — 144 ч, т. е. нэ 24 — 48 ч меньше, чем у клеточных линий, вырзщива- емых с нативной сывороткой крови эмбрионов коров; б) довольно ранние дегенеративные изменения, которые наступают спустя 144—

168 ч после посева клеток s присутствии

10 нативных сывороток крови бычьей и кур в питательной среде, не отмечаются при выращивании-их нз среде Игла MEM с 107 сывороток. крови этих животных, приготовленных по предлагаемому способу; в) значительные скопления клеток, которые образуются при пересевах постоянных линий клеток PK-15. Н ГУК-1 и Чего на среде с 10 нативной сыворотки крови бычьей не отмечаются при выращивании их на среде с

10 сыворотки крови бычьей по предлагаемому изобретению; г) после образования монослоя клетки переживают в средах с предлагаемыми сыворотками крови животных, будучи прикрепленными к стеклу, при комнатной температуре 1 — 1,5 мес и более.

Отличительные признаки и полезная эффективность предлагаемого способа получения сывороток крови животных для культивирования клеток сводятся к следующему: а} удаление иэ нативных сывороток крови ингибиторав роста клеток проводят простым . и общедоступным способом, включающим их заморозку с последующим оттаиванием и сбор светлых слоев сыворотки, начиная сверху, до границы ее гемолизированных фракций; б) предлагаемый способ позволяет одновременно снижать в сыворотке концент-

ыЯ783 тных тканей, включающий взятие крови, отделение сыворотки, замораживание и оттаивание ее, отделение верхних светлых слоев и их стерилизацию, отличающийся

5 тем, что, с целью упрощения способа, снижения концентрации ингибиторов роста культур клеток и улучшения ростовых свойств сыворотки, замораживание сыворотки проводят при (- 15) — (- 20)ОС, а

10 оттаивание — при комнатной температуре, при этом стерилизацию проводят путем фильтрации через миллипоровые . фильтры;

Таблице 1

Сыворотке крови ро международной заявке .

М 82/02900

Сыворотка крови эмбрионов коров поТУ . ФС 42-7ВС-85 (прототип 2) Показатель

Сыворотка крови взрослого крупного рогатого скота по ТУ

49.24 б-82

Не более 0,300 ед. оптической плотности

Прозрачность (535 нм) Не более 0,450 ад. оптической плотности

6,0- 8.0

7,0-7,8

7,6 й.0,2 рН

Свободный гемоглобин

Не менее

50 мг $

Не более

60 мг г

Не более

20 мг/дл

40-200 мг ®

Общйе липиды

Холестерин

30-50 мг

1020Mr

4,5 + 2,5 г ®

90-170 мг

Общий белок, в том числе: альбумины а- глобулины

Р- глобулины - глобулины

6,3-7,7г ®

55" 5

35++ 5

10- - 5

Ниже 1

Ростстимулирующая активность на перевиваемых линиях клеток по индексу пролиферации

Не менее

4,0-5,0

Не менее

6,0- 7,0

Не менее

6,0 - 7,0 рацию общего белка. в том числе у глобулинов, свободного гемоглобина, общих липидов, в том числе общего холестерина; в) сыворотки крови животных, приготовленные по предлагаемому способу, лучше стимулируют пролиферацию клеток по сравнению с нативными образцами;

r) в культуральной среде с сывороткам и по предлагаемому изобретению культуры клеток более жизнеспособны, чем с нативными сыворотками.

Формуле изобретения

Способ получения сыворотки крови животных для культивирования клеток живоВ

We более.

30 мг/дл, Не более

10 мг/дл

3,0- 7,0 г/дл, 2,0-4,0 г/дл

0,4 -2,0 г/дл

0,4 - 2,0 г/дл

0,1- 1,0 r/äë

1813783

10 рН

Общий Остаточбелок, ный гег/дл моглобин

r/äë

Серия

Общие липиды, мг/дл

+ 42,0

1,6

+ 3,32 + 36,3

0,023 0,0 и 68,9

3,0

2-88

+ 7,19

0,004

=" 0,111

0,0007

+ 26,9

1,4

М2,4

1,0 .

+ 66,7

1,9

4-88

+7,25

0,011

++ 0,125

0.0006

1-89 и 28,3

0,0

«4 40,2

1,6

+ 7,34

0,009 и 74,3

1,6

+0,106

0,0007 и 7,64

0,004

"- 124,2

1,8 243,0

1,1 и 7,12

0,0023 и 75,4

2,7

«+ 0,185

0,0015

5-88

+ 188,6

3,3 и 0,184

0,0009 - 100,2

2,6 и 6,11

0,018

4-88

+ 7,67

0,009

+ 0,103

0,0006

+é 5,58

0,020 и 7,81

0,009

1-89

+ 153,3 ..1,9 и 304,3

5,4

2-88

+ 3,48

0,020

+ 37,7

1,4 и 80,4

3,2

+ 7,65

0,004

+ 0,170

0,0015

+ 33,6

1,3

+141,0

5,1

+ 81,6

1,6 3,39

0,018

+ 7,73

0,009

+. 0,112

0,0009

4-88

+ 70,8

0,6 ф 29,6

1,3 и 314,3

3,3

"= 0,155

0,0009

+ 7,63

0,010

1-89

+ 3,14

0,012

Сыворотки крови

Сыворотка крови эмбрионов коров (СКЭК) прототип,2

Сыворотка крови бычья (СКБ) Сыворотка крови кур (СКБ) й2,97

0,007

+ 3,18

0,020 и 90,2

2,7

" 67,3

1,3

Общий холестирин, мг/дл

1аблица 2

Прозрачность (оптическая плотность, е.

1813783

Таблица 3

Прозрач-. ность (оптическая

ПЛОТНОСТЬ, е. рН

Общий белок, г/дл

Вид сыворотки крови

+ 66,7

1,9 и 2,97

0,007

+ 26,9

1,4 и 32,4

1,0 + 7,25

0,011

+ 0,125

0,0006

+ 17,5

1,4

+ 36,2

1е9 и 18,6

0,6

+ 2,50

0,012 и 7,34

0,006

= 0,103

0,0004 и 6,11

0,018

СКБ

+ 188:,6

3,3:

7,67

0,009 и 90,2

2,7

+ 0,184

0.0009

+ 100,2

2,6

ПСКБ

+ 91,4

3.3 и 39,6

1,0 и 4,92

0,023

+ 7,71

0,007 и 39,0

1,3 и 33,6

1,3 и 81,6

1,6

СКК и 0,112

0,0009.. и 141,0

5,1

+ 7,73

0,009

«+ 3,39

0,018

ПСКК

+ 7,75

0,009

+ 33,0 . 0,6

+ 18,8

1,4

+70,5 .

1,9

+ 0,096

0,0006 и 2,24

0,012

Таб,лица 4

Белковые фракции, относительные ®

Общий Geлок, г/дл

Глобулины

Альбумийы и 2,97

0,007

СКЭК (прототип 2) и 41,62

0,12 и 39,80

0,19

+ 13,13

0,27 5,44

0,02 и 12,60

0,07 39,83

0,17

ПСКЭК. +250

0,012 и 4,58

0,05 и 42,98

0,16

«+ 41,50

0,40

СКБ

+ 13,05

0,23

+ 33,82

0,48. 6,11

0,018

+ 11,63

0,14 .

ПСКБ

«+ 4,92

0.023 ; 12,11 0,07 + 37,75 . 0,51

«+ 13,55

0,32 и 36,59

0,31

+ 37,20

0.30 и 8,46 .0,11

+ 3,39

0,018

СКК

+ 12,04

0,05 . 42,31

0,29

ПСКК и 8,29

0,10 и 2,24

0,012 и 41,28 0,28 и 11,35

0,18

+ 38,46

0,15

СКЭК (прототип 2) ПСКЭК

Вид сыворотки крови животных

Свободный гемоглобин, мг/дл

Общие липиды, мгlдл

Общий холестерин, мг/дл., + 0,157

0,0009

1813783

Таблица 5

Динамика роста культуры клеток РК-15

Та бл и ца.б

Динамика роста культуры клеток НГУК-1

1813783

Таблица 7

Динамика роста культур клеток Чего

Составитель В. Титов

Редактор С. Кулакова . Техред М.Моргентал Корректор Л. Пилипенко. Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина. 101

Заказ 1812 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5