Способ консервирования тромбоцитов

 

Изобретение относится к криобиологии. Цель изобретения - повышение морфо-функциональной сохранности тромбоцитов. Тромбоциты инкубируют в защитном растворе , содержащем аутоплазму и криопротектор глицерин в концентрации 5-7,5% или 1,2 пропандиол в концентрации 2-3%, после чего замораживают со скоростью 1- 2°/мин до температуры кристаллизации защитной среды, далее со скоростью 0,4-0,6°/мин до -6 - -7°С, затем со скоростью 5-10°/мин до-80 -196°С.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„. Ж „„1822782 А1 (и)э А 61 К 35/14

ГОСУДАРСТВЕ НЮЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4680905/14 (22) 18.04.89 (46) 23.06.93. Бюл. t4 23 (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (72) А.М.Компаниец. А,B.Íèêîëåíêî, С.Т.Олейник, В.И,Луговой и И.А,Иванова (56) Brodthagen U.À.. Armltage W.J.,—

GryobIology, 1985, 22, 1, 1-9, (54) СПОСОБ KOHCEPBVIPOBAHVIR ТРОМБОЦИТОВ

Изобретение относится к криобиологии, Известны способы консервирования тромбоцитов под защитой ДМСО и ДМАЦ.

Однако ДМСО является токсичным, что требует его полного удаления из суспензии тромбоцитов после отогрева, в результате которого теряется дополнительно до 30 ( клеток, ухудшаются из функции. ДМАЦ не обеспечивает достаточной сохранности одной из основных функций тромбоцитов— гемостатической, что приводит к резкому снижению или полной потере их агрегационной активности.

Известны способы консервирования тромбоцитов под защитой глицерина.

Однако тромбоциты, консервированные этими способами. имеют низкий показатель реакции на гипотонический шок, (РГШ), который является важным показателем их функциональной полноценности, коррелирующим с приживаемостью.

Источ н и к л и тературы РГШ,g

10 +3

15+ 4

16,26 +.2,03 (57) Изобретение относится к криобиологии.

Цель изобретения — повышение морфо-функциональной сохранности тромбпцитов.

Тромбоциты инкубируют в защитном растворе, содержащем аутоплаэму и криопротектор глицерин в концентрации 5-7,5 или 1,2 пропандиол в концентрации 2-3 (, после чего замораживают со скоростью 12 /мин до температуры кристаллизации защитной среды, далее со скоростью

0,4-0,6 /мин до -6 — -7"С, за1ем со скоростью 5-10 /мин до -80 — -196 С.

Наиболее близким к предлагаемому является способ консервирования тромбоцитов путем замораживания их со скоростью

37 град/мин до -196 С под защитой 0.5 М (4,6ф.,) глицерина и последующего отогрева на водяной бане при+37 С, Недостатком этого способа, как и всех остальных способов консервирования тром-„Q0 боцитов под защитой глицерина, является Я снижение устойчивости тромбоцитов к ги- Я потоническому шоку (18 + 2$).

Цель изобретения — повышение сохран- 0р ности функциональной полноценности тромбоцитов за счет повышения их устойчивости к гипотоническому шоку.

Поставленная цель достигается тем, что в способе консервирования тромбоцитов, включающем замораживание их до -1960C в защитной среде, содержащей криопротектор глицерин, глицерин берут концентрации 5-77(или используют криопротектор

1,2-пропандиол в концентрации 2-3, а замораживание осуществляют сначала со скоростью 1-2 град/мин до температуры

1822782

55 кристаллизации защитной среды, Далее со скоростью 0,4-0,6 град/мин до (-6) - (-7) С и затем со скоростью 5-10 град/мин до (-80)(-196) С.

Пример 1. Концентрат тромбоцитов получали методом диференцированного центрифугирования крови, заготовленной в пластикатные контейнеры "Гемакон". Иэ

500 мл крови получали один тромбоконцентрат (ТК), содержащий 0,6-0,8 10 тромбоцитов в 20-25 мл плазмы. Непосредственно перез замораживанием готовили растоворы криопротекторов на аутологической плазме с рН 6,5. ПРи необходимости объединяли

344 ТК от доноров, идентичных по группе крови и резус принадлежности. Перед замораживанием к суспензии ТК медленно, постоянно перемешивая, со скростью 0,3 мл/мин добавляли равный объем криопротектора глицерина или 1,2-пропандиола в разных концентрациях. Время экспозиции тромбоцитов в защитном растворе при 2022 С вЂ” 30 мин. Затем клеточную взвесь разливали в контейнеры и помещали в камеру программного охлаждения устройства УОП

6 6.000.000 производства ОП ИПКиК АН

УССР. Замораживание осуществляли со скоростью 2,0" /мин до температуры замерзания защитного раствора, при которой инициировалось льдообраэование внеклеточной воды. с этого момента со скоростью

0,5 /мин до -6 С, затем 7 /мин до -196 С, погружали в жидкий азот. Отогрев производили в водяной бане при 37 С. Образцы из контейнеров переводили в пластикатные мешки, 30-40 мин термостатировали при

37 С, затем 10 мин центрифугировали, надосадок удаляли и к оставшимся тромбоцитам осторожно приливали аутологическую плазму с температурой 37 С, Для оценки сохранности гемостатической функции деконсервированных тромбоцитом исследовали их агрегационную активность под воздействием АДФ, реакцию на гипотонический шок и ретрактильную активность. В каждом опыте проводили 5 повторов, в которых анализировали по 7 контейнеров. Статистическую обработку проводили по методу ФишераСтьюдента.

Оптимальная концентрация глицерина

5-7,5, 1,2-пропандиола 2-3;(,.

Пример 2, Способ осуществляли аналогично примеру 1. Концентрация глицерина в ТК-5, 1,2-пропандиола — 2,5ь, Скорость охлаждения до температуры кристаллизации варьировали.

Оптимальная скорость охлаждения на 1 этапе — 1-2 /мин.

5

Пример 3, Способ осуществляли как в примере 1, концентрация криопротекторов глицерина и 1,2-ПД 5 и 2 („соответственно, конечную температуру 1-го этапа варьировали.

Оптимальной конечной температурой 1 этапа является температура кристаллизации, которая лежит в пределах от -1,0 до

-1,5 С. При охлаждении защитного раствора создается начальное переохлаждение внеклеточного раствора, в результате кристаллизации происходит разогрев всей суспенэии до этой температуры, ие выдерживается оптимальная скорость охлаждения, как следствие, ухудшение сохранности гомостатической функции, а также уменьшение их количеств, снижение показателей ретракции, реакции на гипотонический шок, Пример 4. Способ осуществляли аналогично примеру 1. Концентрация глицерина в ТК 5 („1,2-ПД-2,5 . Варьировали скорость охлаждения от температуры кристаллизации до -6 С.

Из представленных данных следует, что оптимальные скорости охлаждения на 2 этапе 0,4-0.6 /мин.

Пример 5. Способ осуществляли аналогично примеру 1. Концентрация глицерина 5 („1,2-ПЛ-2,57. Варьировали конечную температуру 2 этапа охлаждения.

Оптимальная конечная температура 2 этапа (-6) - (-7) С.

Пример 6. Способ осуществляли аналогично примеру 1. Концентрация глицерина 5, 1,2-ПД-2,5 (,. Варьировали скорость этапа, конечная температура которого была -196 С.

Пример 7. Способ осуществляли аналогично примеру 1. Концентрация глицерина 5, 1,2-ПД-2,5 . Варьировали конечную температуру в 3 этапа, Оптимальная ко ечная температура 3 этапа (-80) - (-196 )С.

Пример 8. Способ осуществляли аналогично примеру 1 и по прототипу. Данные сохранности тромбоцитов в зависимости от способа консервирования говорят о том, что в случае консервирования предлагаемым способом показатели реакции на гипотонический шок, ретракции и агрегации достоверно выше, чем в прототипе.

Формула изобретения

Способ консервирования тромбоцитов путем замораживания их до -196 С в защитной среде, содержащей криопротектор глицерин,отличающийся тем, что,с целью повышения сохранности функциональной полноценности клеток за счет повышения устойчивости их к гипотоничес ому шоку, 1822782

Составитель

Техред М.Моргентал

Корректор С.Лисина

Редактор

Заказ 2169 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат IlsTOHT", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 глицерин берут в концентрации 5-7 или используют криопроектор 1,2-пропэндиол в концентрации 2-3, а замораживание осуществляют сначала со скоростью 1-2 град/мин до температуры кристаллизации защитной среды, далее со скоростью 0,4-0,6 град/мин до -6...-7 С и затем со скоростью

5-10 град/мин до -80...-196 С,