Способ снижения гетерогенности секретированных моноклональных антител
Использование: изобретение относится к области биологии и касается способа снижения гетерогенности секретированных моноклональных антител. Предложение является пионерским. Сущность изобретения заключается в обработке культуральной жидкости, продуцирующей моноклональные антитела карбоксипептидазой В при соотношении секретированные гетерогенные моноклональные антитела: фермент 100:1, инкубировании смеси в течение 5 ч. выращивании при температуре 22-23сС и выделении целевого продукта в гомогенной форме. Положительный эффект предложения заключается в получении гомогенных антител, которые можно выделить в чистом виде гель-фильтрацией.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛ ИСТИН Е С К ИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
ОЪ (А)
Ql
С) (Э
1са (21) 4742089/14 (22) 27.09.89 (31) 2500787, 2500788 (32) 28,09.88 (33) US (46) 30,07.93. Бюл. ЬВ 28 (71) Эли Лилли энд Компани (US) (72) Ричард Марк Бартоломью, Томас
Чарльз Фурман, Родни Алан Джу и Джеймс
Патрик Макдонаф (US) (54) СПОСОБ СНИЖЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННОСТИ СЕКРЕТИРОВАННЫХ МОНОКЛОHARbHblX АНТИТЕЛ (57) Использование: изобретение относится к области биологии и касается способа сниИзобретение относится к биологии и касается способа снижения гетерогенности секретированных моноклональных антител.
Крупномасштабное производство моноклональных антител из клеток гибридом вызвало революцию в прогнозе, диагностике и лечении различных болезненных состояний, Моноклональные антитела также полезны в определении стадий различных природных состояний, таких как беременность. Однако, было установлено, что многие полученные из гибридов антитела проявляют гетерогенные формы, которые сильно мешают процессам очистки и выделения, необходимом для достижения высоких выходов из промышленных штаммов.
Катионнообменная хроматография показывает, что существует, по меньшей мере, три дискретных гетерогенных формы антитела, выделенного из клеток, выращенных ин витра. Эти формы могут появляться в различных относительных количествах. Эти. БЫ«, 1831500 А3 (sI)s С 12 P 21/08, А 61 К 39/395 жения гетерогенности секретированных моноклональных антител. Предложение является пионерским. Сущность изобретения заключается в обработке культуральной жидкости, продуцирующей моноклональные антитела карбоксипептидазой В при соотношении секретированные гетерогенные моноклональные антитела: фермент
100:1, инкубировании смеси в течение 5 ч, выращивании при температуре 22 — 23 С и выделении целевого продукта в гомогенной форме. Положительный эффект предложения заключается в получении гомогенных антител, которые можно выделить в чистом виде гель-фильтрацией. гетерогенные формы не обнаружены в таком же количестве в асцит-выделенных антителах, хотя производство высоких уровней антител из асцитов намного более трудоемкий и дорогой процесс для коммерческих целей.
Биохимическая основа для этой гетерогенности возникает из наличия избыточной аминокислоты или кислот, присоединенной к карбокси-окоччанию тяжелых цепей антитела. Терминальная аминокислота наиболее вероятно удаляется во время внутренней обработки или выделения антитела из клетки, тогда как предполагаемая последовательность аминокислот, полученная из
ДНК-последовательности гена антитела, действительно содержит дополнительную аминокислоту. Одной из этих трех гетерогенных форм является антитело, которое не содержит дополнительной терминальной аминокислоты в любой из своих тяжелых цепей. Вторая из трех дискретных гетеро1831500 генных форм содержит дополнительную аминокислоту в одной из своих тяжелых цепей, в то время как третья форма содержит ладание сверхчистыми одноформными антителами значительно увеличивает репродуктивность и логичность последующих модификаций, таких как реализации иммуноконъюгации или иммуномобилизации.
Способ снижения гетерогенности выделенных антител включает добавление карбоксипептидазы в культуральную жидкость, содержащую выделенные антитела при
СР1Р соотношении, достаточном для снижения гетерогенности указанных антител, затем выращивании культуральной жидкости в течение определенного времени и при температуре и рН, достаточных для редукции гетерогенности антител, 30
Способ осуществляется следующим образом.
Пример 1. Культура гибридомы
СЕМ231.6.7.
Гибридому СЕМ231.6.7, которая выделяет моноклональное антитело СКМ231, получают из АТСС (Американской коллекции типов-культуры) 12301 Парклоун драйв, Роквил, Мэриленд 20852, Гибридома СЕМ
231.6.7 является частью коллекций штаммов
TCC и доступна специалистам как источник и вместилище штаммов антитела под номером АТСС НВ9620. Замороженные клетки быстро разморэживают, затем сразу промывают 10 мл среды HLI, дополненной 4.мМ
55 лутамина. Среда HLI поставляется фирмой
Вентрекс из Портланда, rp.Мзйн. Клетки подополнительные аминокислоты в обеих тяжелых цепях. 5
Настоящее изобретение включает способ специального отщепления дополни. тельной аминокислоты от тяжелых цепей гетерогенных антител, тем самым превращая все три формы в одну, по существу, чистую, гомогенную смесь. Разработка и применение технологии моноклональных антител зависит от доступности больших объемов по существу гомогенных антител.
Эта разработка в какой-то степени сдерживается невозможностью легкой очистки и характеристики различных гетерогенных форм выделенных антител. Настоящее изобретение полезно и особенно важно в том, что оно позволяет преобразовать большинство гетерогенных антител в одну по существу гомогенную форму перед очисткой. Это преобразование приводит к высокому выходу антитела с более определенными биохимическими характеристиками, а также к снижению загрязнения гетерогенными формами антитела при очистке. Более того, обмещают в T-колбу и выращивают до достижения высокой концентрации клеток.
Вращающиеся 250 мл колбы, содержащие среду HLl, дополненные 4 мМ глутамина, засеяли 300000 клеток/см СЕМ 231.6.7, которые выделяли антитело. Эти клетки выращивали при 37ОC 48 ч до достижения концентрации клеток 900000 клеток/мг. Затем в каждую вращающуюся колбу добавили другую аликвоту глутамина для доведения конечной концентрации культуры до 4 мМ глутамина, Вращающиеся колбы, содержащие клетки СЕМ 231.6.7, затем выращивали при 37 С еще 8 — 10 суток.
После конечного выращивания клеточную культуру вылили в две 250 мл колбы и центрифуговали при 10000 оборотах/минуту 12 мин в роторе Beckmann 1А8 на центрифуге. Выделили около 375 мл супернатэнта и предварительная количественная оценка показала, что концентрация антитела составляла около 80 мкг/мл. Культуральную среду затем концентрировали до 40 мл, используя 400 мл перемешиваемый концентратор клеток, снабженный фильтром УМ10
76 мм (производство Amicon Corporation, Scientific.Syg, что после 24 часов более 80 антител превратились в первичную гомогенную форму, в то время как контрольные пробы, выращиваемые без асцитической жидкости остались почти зквимолярными во всех трех гетерогенных формах, Пример 4. Преобразование антитела
СЕМ 231, используя способ CP.
Примерно 5 мг аликвоты концентрата антителэ СЕМ231 выращивали при 22-23 С
5 ч с 50 мкг карбоксипептидазы В. Карбоксипептидазу В представляет Calliochem
P.Î. Вох. 12087, Sor. Diego California 92112 и она имеет ферментную активность 295
1/мг. Следовательно, эта реакция соответствует 0Р1Р соотношению 3,0. После 5-часового выращивания, гетерогенность пробы оценили катион-обменной хроматографией на колонке Mono-SHR 5/5, рН 4;5 в 0,17М буфере ацетата натрия с градиентом 0,0-0,2
М Na Ct. Экспериментальные данные показали, что более 95 антител в пробе преобразовались в первичную гомогенную форму, в то время как необработанные антитела сохранили почти эквимолярное соотноше.ние гетерогенных форм, Формула изобретения
Способ снижения гетерогенности секретированных моноклональных антител путем отщепления аминокислоты или аминокислот от карбоксиконца одной или обеих цепей моноклональных антител посредством добавления кэрбоксипептидазы
В в культуральную жидкость, продуцирую1831500
Составитель С.Мельникова
Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор А,Обручар
Редактор
Заказ 2541 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СГСР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 щую моноклональные антитела при соотношении секретированные гетерогенные моноклональные антитела: фермент 1001:1, инкубирования смеси в течг.ние 5 ч, выра .цнвания при температуре 22-23"С и выделении целевого продукта в гомогенной форме,
