Усовершенствованные способы получения дималеата 6,9-бис-[(2- аминоэтил)-амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона

 

Дималеат 6,9-бис-[(2-аминоэтил)-амино] бензо[g] -изохинолин-5,10-дион получают следующим образом. К раствору этилендиамина в ТГФ медленно добавляют 6,9-дифторбензо[g]изохинолин-5,10-дион с образованием дигидрофторидной соли 6,9-бис-[(2-аминоэтил)-ами-но] бензо[g] изохинолин-5,10-диона, которую затем растворяют при рН 5 в воде и уксусной кислоте, отфильтровывают и добавляют раствор малеиновой кислоты. Усовершенствованные способы позволяют получать целевое соединение со степенью чистоты выше 97%. 3 с. и 1. з.п. ф-лы, 4 ил.

Митоксантрон (Mitox), противоопухолевый 1,4-бис(аминоалкиламино)антрацен-9,10-дион, в настоящее время завоевал важное место в клинической терапии лейкозов и лимфемии, так же как в комбинационной терапии прогрессирующей мастопатии и овариальных злокачественных опухолей. Хотя Mitox наделен улучшенными показателями переносимости по сравнению с доксорубицином (doxorubicin = DX) и другими антрациклинами, это лекарство не лишено существенного побочного токсического действия, особенно связанного с миелосупрессией и кардиотоксичностью. В частности, серьезное беспокойство вызывает застойная сердечная недостаточность у пациентов ранее проходивших курс лечения антрациклинами (современный взгляд на терапевтические и токсикологические показатели митоксантрона см. Faulds, D. ; Balfour, J.A; Chrisp, P. ; Langtry, H.D. "Митоксантрон: обзор фармакодинамических и фармакокинетических свойств и терапевтического потенциала в химиотерапии рака", "Mitoxantrone, a Review of its Pharmacodynamic and Pharmacokinetic Properties, and Therapeutic Potential in the Chemotherapy of Cancer", Drugs. 1991, 41, 400-449).

Механизм клеточной деструкции Mitox, вероятно, является мультимодальным по своей природе: многие исследования предлагают в качестве основного клеточного процесса встраивание в ДНК. Также в качестве определяющего события, которое ведет к индуцированной препаратом Metox гибели клеток, предлагают компакт нуклеиновой кислоты и вмешательство ДНК-топоизомераз 11 активности, дающее в результате разрывы цепи ассоциированной с белком ДНК. Деструкцию клеток противоопухолевыми антрацен-9,10-дионами (включая Mitox) также относят к окислительному метаболизму, в результате которого образуются свободные радикалы, способные алкилировать ДНК и/или расщеплять ДНК, давая разрывы цепи не ассоциированной с белком ДНК. Однако обычно считают, что окислительно-восстановительная циклизация хиноновой части, вероятно, в большей мере касается кардиотоксической стороны воздействия препарата Mitox, чем механизма его противоопухолевой активности. Кардиотоксичность Mitox и DX также связывают со способностью хелатообразования с металлами присоединенных гидроксилов и хиноновых групп. Образование комплексов лекарственный препарат-металл может повышать окислительно-восстановительную циклизацию посредством катализируемой металлом реакции [Shipp, N.G.; Dorr, R.T.; Alberts, D.S.; Dawson, B. V. ; Hendrix, M. "Characterization of experimental mitoxantrone cardiotoxicity and its partial inhibition by ICRF-187 in cultured neonatal rat heart cells" ("характеристика экспериментальной кардиотоксичности митоксантрона и ее частичное ингибирование препаратом ICRF-187 в культивированных клетках сердца новорожденной крысы"). Cancer Res. 1993, 53, 550-556].

Значительная клиническая активность Mitox делает разработку соединений второго поколения, родственных антрацендиону, притягательной областью исследования. На сегодняшний день большинство работ посвящено исследованию вариаций в природе боковых цепей и повторного размещения гидроксильных заместителей и/или вторичных боковых цепей.

Относительно неисследованным вопросом является введение гетероатомов в антрахиноновый хромофор, но такое изменение может существенно влиять на взаимодействие молекул с биологическими объектами. В частности, гетероциклические аналоги антрахинонов а) должны в основном сохранять пространственные и плоскостные характеристики исходных лекарственных препаратов для опознания молекулы-хозяина, как при встраивании ДНК, и б) могут вводить дополнительные водородные связи и основные места, каждое из которых может повышать сродство лекарственного препарата к ДНК и/или влиять на взаимодействие с топоизомеразой 11. Кроме того, гетероаналоги могут быть наделены измененными окислительно-восстановительными свойствами.

Получено и проверено несколько аза-аналогов [Krapcho, A. P. "6,9-bis(substituted-amino)benzo[g]isoquinoline-5,10-dions" ("6,9-бис(замещенный-амино)бензо[g] изохинолин-5,10-дионы"), PCT Intl. AppL. WO 92/15300, 17.09.1992 (здесь включена в качестве ссылки); Krapcho, A.P. и др. : "6,9-bis[(2-aminoalkyl)aminobenzo[g] isoquinoline-5,10-dions" ("6,9-бис(аминоалкил)аминобензо[g]изохинолин-5,10-дионы"). Новый класс противоопухолевых антрацен-9,10-дионов с модифицированным хромофором: синтез и оценка противоопухолевого действия; J.Med.Chem. (1994), в печати (здесь включена в качестве ссылки).

Среди этих соединений соль дималеат 6,9-бис[(2-аминоэтил)-амино]бензо[g] изохинолин-5,10-диона является наиболее активной в экспериментальных противоопухолевых моделях.

Кроме того, соль дималеат 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]- бензо[g]изохинолин-5,10-диона не оказывает какого-либо существенного токсического воздействия на ткань сердца, как при разовом, так и при многократном применении на крысах и мышах, соответственно. После однократного применения у крыс доз, приблизительно равных LD₁₀ и LD₅₀ соль дималеат 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино[бензо[g]изохинолин-5,10-диона вызывает эритропению и тромбоцитопению в меньшей степени, чем Mitox.

Эти благоприятные показатели подтверждаются экспериментами на мышах после повторных применений препарата на моделях мышиной лейкемии в сравнении с митоксантроном в эквивалентных по активности дозах.

К сожалению химическое усовершенствование таких соединений столкнулось с непредвиденными проблемами вследствие низкого уровня чистоты данных соединений (менее 96%). Кроме того, аналитическое исследование этих соединений обнаруживает присутствие неизвестных примесей, которые образуются на последней стадии процесса получения и которые нельзя удалить из соединения доступными в настоящее время способами очистки. Так как неизвестные примеси составляют более 2%, а одна из этих неизвестных примесей составляет 1,3%, улучшение соединения серьезно усложнено вследствие того, что действующие правила требуют широкого исследования неизвестных примесей, если эти последние присутствуют в таком существенном количестве.

Краткое описание изобретения Заявители раскрывают новые усовершенствованные способы синтеза 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино] бензо[g] изохинолин-5,10- диона и его соли - дималеата. Применяя новые усовершенствованные способы синтеза настоящего изобретения, можно получить указанное соединение с выходом более 99%.

Краткое описание чертежей Фиг. 1 - регистрация методом высокоэффективной жидкостной хроматографии HPLC смеси соединения настоящего изобретения, пик 6, и идентифицированных примесей.

Фиг. 2 - анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии HPLC реального образца соединения настоящего изобретения - бис-малеата, полученного способом прототипа J.Med.- Chem. или WO 92/15300. Пики с большим временем удерживания (пики 7, 8 и 9) соответствуют неизвестным примесям.

Фиг. 3 - анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии HPLC соединения настоящего изобретения, полученного согласно способу A настоящего изобретения.

Фиг. 4 - анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии HPLC соединения настоящего изобретения, полученного согласно способу B настоящего изобретения.

Синтез соединения настоящего изобретения Соединение настоящего изобретения 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g] изохинолин-5,10-диона и его соль - дималеат получают двумя усовершенствованными способами, которые дают в результате соединение очень высокой степени чистоты.

Сам 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-дион в виде свободного основания нестабилен вследствие очень быстрой циклизации в растворе, ведущей к образованию соединений 1a и 1b, которые в хроматограмме HPLC образуют два разных пика, каждый из которых соответствует отдельному соединению (см. фиг. 1).

Кроме того, свободное основание очень хорошо растворяется воде; следовательно, его трудно экстрагировать органическими растворителями, с ним тяжело работать и очищать.

К тому же другие соли 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона, такие как дигидрохлорид, разлагаются при стоянии вследствие присущей им очень высокой кислотности. Действительно, соединение 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-дион при кислом pH (ниже 2.5) разлагается, образуя соединения 2a и 2b, в которых потеряна одна боковая цепь. Соединения 2a и 2b неразличимы в хроматограмме HPLC и образуют один пик (см. фиг. 1). Все указанные выше продукты разложения присутствуют в виде примесей в 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-дионе (см. фиг. 2 пики 3, 4 и 5). В противоположность этому дималеатной соли свойственная превосходная стабильность.

Способы прототипов, сообщающие методы синтеза 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона и его соли - дималеата, описаны в: 1) WO 92/15300 и 2) A.P.Krapcho и др. "6,9-бис(аминоалкил)аминобензо[g] изохинолин-5,10-дионы. Новый класс противоопухолевых антрацен-9,10-дионов с модифицированным хромофором: синтез и оценка противоопухолевого действия; J. Med.Chem. (1994), в печати.

Описанные процедуры синтеза используют в качестве ключевого промежуточного продукта 6,9-дифторбензо[g]изохинолин-5,10-дион. Это соединение реагирует с этилендиамином, что дает в результате 6,9-бис[(аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-дион.

Другой описанный способ включает реакцию 6,9-дифторбензо[g]изохинолин-5,10-диона с моно-трет-бутоксикарбонил-этилен-диамином (BOC-этилендиамином) и последующее удаление защитной ВОС-группы при помощи сухой HCl, что ведет к образованию дигидрохлорида 6,9-бис[(аминоэтил)амино] бензо[g] изохинолин-5,10-диона. Конверсия соли соляной кислоты в стабильный дималеат невозможна, так как HCl не обменивается с менее сильной малеиновой кислотой. Кроме того, соль соляной кислоты, будучи растворенной в воде, разлагается.

Кроме того, способы прототипов: 1) ведут к получению 6,9-бис[(аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона или его дималеата с чистотой не выше 96,1%; и 2) не избегают присутствия неидентифицированных примесей, которые образуются на последней стадии процесса.

На фиг. 2 показана HPLC хроматограмма типичной партии дималеата 6,9-бис[(аминоэтил)амино] бензо[g] изохинолин-5,10-диона, полученного согласно процедуре прототипа: присутствуют три неизвестных примеси (см. пики 7, 8 и 9), количество которых составляет более 2%, и один из них (а именно, пик 8) составляет 1,3%. Степень чистоты этого соединения нельзя увеличить и нельзя избежать присутствия неизвестных примесей: - повторяя суспендирование или кристаллизацию в различных растворителях или смесях растворителей, так как, количество примесей остается постоянным; - способом хроматографии на колонке;
- или осуществляя последнюю стадию синтеза в различных растворителях и при различных температурах.

Кроме того, согласно способам прототипов при разработке последней стадии осаждение соединения в виде соли - дималеата производят в присутствии суспензии сырого дигидрофторида. Полного растворения никогда не достигают. В масштабах данного процесса эта суспензия может вести к негомогенности продукта, что может задерживать другие соли и/или содержать нежелательные вещества (например, нерастворимые вещества, примеси). Полное растворение конечного продукта, по крайней мере на конечной стадии, является важным необходимым условием для получения химического соединения, предназначенного для использования в терапии млекопитающих.

Эти недостатки, типичные для процедур синтеза прототипов, создают серьезное препятствие для получения и создания соединения настоящего изобретения. Действующие правила не всегда позволяют применять для лечения человека лекарства с содержанием активного ингредиента менее 96%, особенно, если присутствуют неизвестные примеси в количестве более 2%. Особо предпочтительно избегать присутствия любых примесей в количестве более 0,5%.

Мы к своему удивлению обнаружили новые способы, которые позволяют получать 6,9-бис[(аминоэтил)амино)бензо[g]изохинолин-5,10-диона и его соль - дималеат со степенью чистоты более 97%, предпочтительно более 99%, при этом каждая содержащаяся в нем примесь присутствует в количестве менее 0,5%, а каждая неизвестная примесь - в количестве менее 0.2%, т.е., на пределе детектирования аналитическим способом.

Образование 6,9-бис[(аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона и его соли - дималеата можно осуществить, применяя один из следующих способов:
Способ A
Включает следующие новые отличительные признаки:
- реакцию 6,9-дифторбензо[g]изохинолин-5,10-диона с этилендиамином проводят способом обратного добавления, т.е., медленно добавляют твердый 6,9-дифторбензо[g] изохинолин-5,10-дион к раствору большого избытка диамина в ТГФ.

- сырой дигидрофторид 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g] изохинолин-5,10-диона, полученный из реакционной смеси, полностью растворяют в воде и уксусной кислоте при pH 5; затем раствор фильтруют и кристаллизуют из указанного раствора соль - дималеинат, добавляя раствор малеиновой кислоты в воде.

Обратное добавление и cкороcть добавления сами по себе являются определяющими для высокой степени чистоты продукта и позволяют получить очень высокий выход (92%). Также очень важен выбор растворителя: использование ТГФ вместо пиридина повышает выход. Растворение сырого дигидрофторида является важным для получения высокой степени чистоты и гомогенности конечного продукта. Кроме того, pH, при котором производят растворение, является критичным для того, чтобы избежать образования других нежелательных примесей. Процедура целиком описана ниже в Примере 1.

Способ B
Включает следующие новые отличительные признаки:
- промежуточный продукт 6,9-дифторбензо[g]изохинолин-5,10-дион реагирует с моно-ВОС-этилендиамином, и полученный промежуточный продукт 6,9-бис[2[[N(трет-бутоксикарбонил)амино] этил]амино]бензо[g]изохинолин-5,10-дион обрабатывают трифторуксусной кислотой, что ведет к образованию сырого трифторацетата 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин- 5,10-диона, который затем полностью растворяют в воде, pH доводят до 4,2 при помощи NaOH и фильтруют;
- указанный раствор сырого трифторацетата обрабатывают водным раствором малеиновой кислоты, что ведет к кристаллизации чистой соли - дималеата 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино] бензо[g]изохинолин-5,10-диона. Процедура целиком описана ниже в Примере 4.

Мы с удивлением открыли, что требуемый дималеат 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона можно получить реакцией замещения из соответствующего сырого трифторацетата, который можно получить путем удаления ВОС-защитных групп трифторуксусной кислотой.

Получение ключевого промежуточного продукта 6,9-дифторбензо[g]изохинолин-5,10-диона можно осуществить путем усовершенствованной многостадийной процедуры. Усовершенствования вводят с целью повышения выходов и масштаба процесса, что существенно для фармацевтической разработки 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино] бензо[g]изохинолин-5,10-диона.

Реакцию 1,4-дифторбензола с ангидридом пиридин-3,4-дикарбоновой кислоты в присутствии хлорида алюминия проводят, как описано, с модификацией: реакционную смесь разбавляют нитробензолом после регенерации избытка 1,4-дифторбензола и затем медленно выливают в воду, что ведет к образованию смеси 4-(2',5'-дифторбензоил)никотиновой кислоты и 3-(2',5'-дифторбензоил)изоникотиновой кислоты. Процедура прототипа требует добавки воды к полутвердой реакционной смеси после регенерации избытка 1,4-дифторбензола: эта процедура предельно опасна и не подходит для воспроизведения в большом масштабе вследствие высокой экзотермичности реакции хлорида алюминия с водой. Новая разработка позволяет медленно добавлять раствор оставшихся комплексов алюминия и избыток хлорида к большому избытку воды.

Затем полученную смесь 4-(2',5'-дифторбензоил)никотиновой кислоты и 3-(2',5'-дифторбензоил)изоникотиновой кислоты подвергают реакции кристаллизации в 20%-ной дымящей серной кислоте с таким усовершенствованием, что дальнейшее добавление 20%-ной дымящей серной кислоты порциями позволяет увеличить выходы до 81%.

Препаративный пример 1
Получение ангидрида 3,4-пиридиндикарбоновой кислоты
В атмосфере азота суспензию 97%-ной чистой 3,4-пиридиндикарбоновой кислоты (152 г, 0,88 моля) в уксусном ангидриде (450 мл) нагревают с обратным холодильником и добиваются полного растворения. По достижении температуры кипения с обратным холодильником удаляют растворитель путем перегонки при атмосферном давлении (собирают около 400 мл) за период около 1 часа. Отмечают повышение температуры паров примерно от 132^oC до 140^oC и останавливают перегонку, когда внутренняя температура достигает 150-155^oC. Реакционную смесь охлаждают до 70^oC и добавляют по капле при перемешивании трет-BuOME (450 мл). Примерно при 40^oC осаждается темно-серное твердое вещество, в то время как температура самопроизвольно достигает 20-25^oC. Суспензию охлаждают далее до 0-5^oC и перемешивают в течение 2 часов. Темно-серый осадок собирают фильтрацией под слоем азота, промывают трет-BuOME (100 мл) и сушат в вакууме (20 торр; 30^oC; 2 часа), получая в результате ангидрид 3,4-пиридиндикарбоновой кислоты (100 г; выход 76%), который сразу используют на следующей стадии.

Ангидрид 3,4-пиридиндикарбоновой кислоты высоко чувствителен к атмосферной влажности, поэтому с ним нужно работать под азотом и хранить над P₂O₅. Т.пл.: 72-74^oC.

Препаративный пример 2
4-(2', 5'-дифторбензоил)никотиновая кислота и 3-(2', 5'-дифторбензоил)изоникотиновая кислота
Одновременно, но отдельно добавляют пятью порциями (каждые 15 минут) ангидрид 3,4-пиридиндикарбоновой кислоты (95,7 г, 0,67 моля) и AlCl₃ (367,3 г, 2,67 моля) к кипящему 1,4-дифторбензолу (650 мл, 90^oC). Примерно через 1 час после последнего добавления основную часть 1,4-дифторбензола удаляют путем перегонки при нормальном давлении до тех пор, пока не получают густую массу. Температуру снижают до 80^oC и добавляют нитробензол (150 мл) для растворения оставшейся массы. Еще теплый полученный раствор осторожно выливают в охлажденную льдом и перемешиваемую воду (1000 г льда и 530 г деминерализованной воды) (т. е., медленно прикалывают раствор в ледяную воду). Затем к смеси добавляют при 0-5^oC концентрированную HCl (37%, 160 мл) и продолжают перемешивание в течение примерно 3 часов. Путем фильтрации собирают серо-бежевый осадок (около 150 г влажного продукта), в то время как водный слой отделяют от нитробензола и экстрагируют при помощи AcOEt (6 x 500 мл). Слой нитробензола разбавляют петролейным эфиром (400 мл) и полученное небольшое количество осадка собирают путем фильтрации (около 2 г). Объединенные экстракты концентрируют в вакууме, а оставшееся сырое твердое вещество (около 45 г) вместе с ранее собранными осадками суспендируют в смеси AcOEt и петролейного эфира (1/1) (600 мл). Через два часа суспензию фильтруют при комнатной температуре и сушат в вакууме, получая смесь 4-(2',5'-дифторбензоил)никотиновой кислоты и 3-(2', 5'-дифторбензоил)изоникотиновой кислоты (147,3 г, выход 84%) в виде светло-бежевого твердого вещества. Т.пл.: 214-216^oC.

Препаративный пример 3
6,9-дифторбензо[g]изохинолин-5,10-дион
Раствор смеси 4-(2',5'-дифторбензоил)никотиновой кислоты и 3-(2',5'-дифторбензоил)изоникотиновой кислоты (120 г, 0.456 моля) в дымящей 20%-ной серной кислоте (180 мл) нагревают до 140^oC. Примерно через 30 минут к теплой реакционной смеси добавляют еще дымящей 20%-ной серной кислоты (120 мл) четырьмя порциями по 30 мл, каждые 20 минут. Через 20 минут после последнего добавления реакционную смесь охлаждают примерно до 80^oC и затем выливают в ледяную деминерализованную воду (3000 г льда и 3000 мл воды). pH полученной реакционной смеси доводят до 1 при помощи 40% NaOH (850 мл) и наблюдают образование желто-коричневого осадка. Примерно через 1 час стояния при 0-5^oC сырой осадок фильтруют и сушат в вакууме, получая сырой 6,9-дифторбензо[g] изохинолин-5,10-дион (98,5 г). Сырой продукт растворяют в кипящем ТГФ (1000 мл) и обесцвечивают теплый раствор при помощи активного древесного угля (9 г), фильтруют и концентрируют до объема примерно 300 мл после охлаждения при 0-5^oC в течение примерно 2 часов собирают посредством фильтрации желтое твердое вещество - аналитически чистый 6,9-дифторбензо[g]изохинолин-5,10-дион (90,6 г, выход 81%). Т.пл.: 197-199^oC.

Пример 1
Дималеат 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин- 5,10-диона
К теплому раствору (55^oC) этилендиамина (154,4 мл, 2.29 моля) в ТГФ (1400 мл) добавляют порциями 6,9-дифторбензо[g]изохинолин-5,10-дион (70,1 г, 0,29 моля) в течение 2,5 часов (каждая порция = примерно 4,6 г/10 минут). Смесь перемешивают в течение 3 часов при той же температуре, и постепенно образуется синий осадок. После перемешивания при 25^oC в течение ночи суспензию фильтруют под слоем азота, промывают ТГФ (200 мл) и сушат в вакууме (15 торр, 60^oC, 3 часа), получая сырой 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-дион в виде соли - дигидрофторида (117 г).

Сырой продукт сразу растворяют в смеси воды (2340 мл) и AcOH (40 мл) для получения темно-синего раствора, pH которого составляет примерно 5, раствор фильтруют на фильтре из стекловолокна. Такое значение pH является очень важным для предупреждения разрушения продукта реакции. Отфильтрованный раствор постепенно обрабатывают при комнатной температуре 3М водным отфильтрованным раствором малеиновой кислоты (585 мл) до pH 3,5. Примерно после 30 минут выдерживания при 40^oC суспензию перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Синий осадок отфильтровывают и промывают дополнительным количеством воды (3 x 80 мл) и EtOH (3 x 100 мл), затем сушат в вакууме (15 торр, 60^oC, 4 часа), получая сырой дималеат 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона (168 г).

Сырой дималеат суспендируют в воде (3180 мл) и нагревают при 50^oC в течение 30 минут. После ночи перемешивания при 25^oC суспензию снова фильтруют, синий осадок промывают дополнительным количеством воды (3 x 100 мл) и это влажное вещество повторно суспендируют в воде (2400 мл) и выдерживают при перемешивании при комнатной температуре в течение примерно 40 часов.

Дималеат отфильтровывают, промывают дополнительным количеством воды (3 x 100 мл) и EtOH (3 x 100 мл), затем сушат в вакууме (15 торр, 60^oC, 4 часа; потом 40^oC в течение ночи), получая дималеат 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино] бензо[g]изохинолин-5,10-диона (146,7 г, выход 92%).

Исследование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии HPLC (вода, Уф/Вид детектор 486, помпа 510):
колонка: Lichrospher C18 (5 микрон) t.a.

элюент: H₂O/CH₃CN/диоксан = 75/20/5 Гептансульфонат натрия (20 ммолей) pH 3,0 с H₃PO₄
скорость потока: 1 мл/мин
детектор; УФ (245 нм)
время удерживания r.t.: 12 мин
HPLC чистота (площадь %) = 99,586%; см. фиг. 3, пик 4
Исследование методом ЯМР (спектрометр Brucker 200 МГц, химические сдвиги (δ) приведены в миллионных долях в сторону уменьшения поля от внутреннего стандарта - тетраметилсилана Me₄Si).

(δ, D₂O): 3,30 (м, 4H); 3,70 (м, 4H); 6,05 (с, 4H); 7,05 (с, 2H); 7,70 (д, 1H); 8,70 (д, 1H); 8,95 (с, 1H).

Пример 2
В атмосфере азота медленно в течение трех часов добавляют раствор ди-трет-бутилдикарбоната (290,8 г, 1,32 моля) в сухом ТГФ (1200 мл) к охлажденному (0^oC) и перемешиваемому раствору 1,2-этилендиамина (268 мл, 4 моля) в ТГФ (3600 мл). Через 3 часа выдерживания при 10^oC и примерно 16 часов при комнатной температуре растворитель удаляют в вакууме. Оставшееся желтое масло (примерно 230 г) растворяют в изопропиловом эфире (460 мл) и промывают солевым раствором (50 мл). После высушивания над сульфатом натрия (50 г) органический раствор концентрируют до небольшого объема и перегоняют при пониженном давлении (8 торр, 119-121^oC), получая N-трет-бутоксикарбонил-1,2-этилендиамин (161 г, выход 76% относительно ди-трет-бутилдикарбоната).

ЯМР (CDCl₃, δ): 1,3 (с, 2H, в обмене с D₂O), 1,4 (с, 9H); 2,7 (широкий т, 2H), 3,1 (дд, 2H); 5,4 (широкий с, 1H).

Пример 3
В атмосфере азота раствор 6,9-дифторбензо[g]изохинолин- 5,10-диона (15 г, 0,161 моля) и N-трет-бутоксикарбонил-1,2- этилендиамина (49 г, 0.305 моля) в безводном N-метилпирролидоне (300 мл) нагревают до 60^oC. Примерно через 4,5 часа реакционную смесь слегка охлаждают (50^oC) и выливают в перемешиваемую деминерализованную воду (1500 мл). Перемешивание продолжают в течение 2 часов при комнатной температуре и фильтрацией собирают темно-синий твердый осадок, который промывают водой. Сырой отфильтрованный осадок снова суспендируют в воде (1500 мл), фильтруют и сушат в вакууме. Сырой реакционный продукт растворяют в теплой смеси хлористого метилена и метанола (1/1, 500 мл), теплый раствор фильтруют на фильтре из стекловолокна и охлаждают до 10-15^oC в течение 2 часов. После выдерживания в течение 16 часов при комнатной температуре темно-синий кристаллический продукт собирают при помощи фильтрации и сушат, получая 27 г 6,9-бис[(2-N-трет-бутоксикарбониламиноэтил)амино]бензо[g]изохинолин- 5,10-диона. (выход 84%).

ЯМР (CDCl₃, δ ): 1,4 (с, 18H), 3,4-3,7 (м, 8H), 5,4 (м, 2H), 7,3 (с, 2H), 8 (д, J=6 Гц, 1H), 8,85 (д, J=6 Гц, 1H), 9,5 (с, 1H), 11 (м, 2H).

Пример 4
Трифторуксусную кислоту (32 мл, 0,42 моля) добавляют к суспензии 6,9-бис [(2-N-трет-бутоксикарбониламиноэтил) амино] бензо[g] изохинолин-5,10-диона (22 г, 0,042 моля) в хлористом метилене (330 мл). После перемешивания в течение примерно 16 часов при комнатной температуре реакционную смесь разбавляют EtOH (100 мл) и концентрируют в вакууме. Оставшееся масло снова разбавляют этанолом (300 мл) и опять концентрируют до небольшого объема. К оставшемуся маслу добавляют деминерализованную воду (220 мл) и регулируют pH до значения 4.2 при помощи водного 20% КОН (45 мл). Полученный темно-синий раствор фильтруют на фильтре из стекловолокна и смешивают с водным 3М раствором малеиновой кислоты (45 мл, 0,135 моля). pH раствора снова доводят до 3,4 при помощи 20% КОН (24 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение примерно 40 часов. Сырой малеат собирают фильтрацией и повторно суспендируют в деминерализованной воде (200 мл), нагревают до 50^oC в течение 1 часа и выдерживают при перемешивании еще в течение 16 часов при комнатной температуре. Темно-синее твердое вещество отфильтровывают, промывают водой (2 x 50 мл) и этанолом (2 x 50 мл) и сушат в вакууме, получая 18,6 г соли - дималеата 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона (выход 80%).

Исследование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии HPLC (вода, Уф/Вид детектор 486, помпа 510):
колонка: Lichrospher 018 (5 микрон) t.a.

элюент: H₂O/CH₃CN/диоксан = 75/20/5 Гептансульфонат натрия (20 ммолей) pH 3,0 с H₃PO₄
скорость потока: 1 мл/мин
детектор: УФ (245 нм)
время удерживания r.t.: 12 мин
HPLC чистота (площадь %) = 99,285%;
см. фиг. 4, пик 3
Исследование методом ЯМР (спектрометр Brucker 200 МГц, химические сдвиги (δ) приведены в миллионных долях в сторону уменьшения поля от внутреннего стандарта - тетраметилсилана Me₄Si).

( δ, D₂O): 3,30 (м, 4H), 3,70 (м, 4H), 6,05 (с, 4H), 7,05 (с, 2H), 7,70 (д, 1H), 8,70 (д, 1H), 8,95 (с, 1H).

Лечение
Соединение настоящего изобретения можно использовать в качестве активного ингредиента терапевтических композиций с целью регрессии и/или временного ослабления раковых заболеваний у млекопитающих, при этом препарат вводят в количестве примерно от 1 мг до 0,4 г на кг веса тела. Предпочтительной является дозировка примерно от 1 мг до 50 мг на кг веса тела в день. Таким образом, разовая доза для пациента весом около 70 кг, вводимая за 24 часа, может составлять примерно от 70 мг до 3,5 г активного соединения. Прием препарата можно регулировать для того, чтобы совмещать с другими методами лечения, такими как радиационная терапия.

Фармацевтические композиции могут быть в форме таблеток, капсул, желатиновых капсул, суппозиториев, лиофилизованных порошков и растворов для внутривенного введения.

Формула изобретения

1. Способ получения дималеата 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона, отличающийся тем, что осуществляют стадии: а) медленно добавляют 6,9-дифторбензо[g]изохинолин-5,10-дион к раствору этилендиамина в тетрагидрофуране, при этом диамин находится в большом молярном избытке по отношению к диону, с образованием дигидрофторидной соли 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона; b) растворяют дигидрофторидную соль 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино] бензо[g] изохинолин-5,10-диона в воде и уксусной кислоте при рН по существу 5; с) фильтруют раствор со стадии b); d) добавляют раствор малеиновой кислоты в воде к отфильтрованному раствору со стадии с) с образованием кристаллического дималеата 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона.

2. Способ получения дималеата 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона, отличающийся тем, что осуществляют стадии: а) проводят реакцию 6,9-дифторбензо[g] изохинолин-5,10-диона с моно-трет-бутоксикарбонил-этилендиамином с образованием 6,9-бис[(2[[N-(трет-бутоксикарбонил)амино] этил] амино] бензо[g] изохинолин-5,10-диона; b) удаляют защиту в 6,9-бис[(2[[N-(трет-бутоксикарбонил)амино] этил] амино]бензо[g]изохинолин-5,10-дионе трифторуксусной кислотой с образованием трифторацетатной соли 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино] бензо[g] изохинолин-5,10-диона; с) осуществляют замену трифторацетатной соли 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона на соль малеиновой кислоты обработкой водным раствором малеиновой кислоты с образованием кристаллической дималеиновой соли 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино]бензо[g]изохинолин-5,10-диона.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что используют 6,9-дифторбензо[g] изохинолин-5,10-дион, полученный следующим образом: а) раствор смеси 4-(2',5'-дифторбензоил)никотиновой кислоты и 3-(2',5'-дифторбензоил)изоникотиновой кислоты в дымящей 20%-ной серной кислоте нагревают до 140^oC; b) примерно через 30 мин к тепловой реакционной смеси добавляют еще дымящую 20%-ную серную кислоту четырьмя порциями, каждые 20 мин; с) через 20 мин после последнего добавления реакционную смесь охлаждают примерно до 80^oC и выливают в ледяную деминерализованную воду; d) рН полученной реакционной смеси доводят до 1 при помощи 40% NaOH, при этом образуется желто-коричневый осадок; е) примерно через 1 ч выдерживания при 0 - 5^oC сырой осадок фильтруют и сушат в вакууме, получая сырой 6,9-дифторбензол[g]изохинолин-5,10-дион; f) сырой реакционный продукт растворяют в кипящем ТГФ и обесцвечивают теплый раствор при помощи активного древесного угля, фильтруют и концентрируют; g) после охлаждения при 0 - 5^oC в течение примерно 2 ч собирают посредством фильтрации желтое твердое вещество - аналитически чистый 6,9-дифторбензо[g] изохинолин-5,10-дион.

4. Дималеат 6,9-бис[(2-аминоэтил)амино] бензо[g]изохинолин-5,10-диона, имеющий степень чистоты более 97%.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4