Способ диагностики туберкулеза



Способ диагностики туберкулеза
Способ диагностики туберкулеза

 


Владельцы патента RU 2525428:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к медицине, в частности к области медицинской диагностики, и описывает способ диагностики туберкулеза путем проведения иммуноцитогистохимического исследования и выявления экспрессии антигена микобактерии туберкулеза. Способ характеризуется тем, что исследование биологического материала, нанесенного на предметное стекло, проводится с помощью модифицированного иммуноцитогистохимического метода и включает следующие стадии: получение биологического материала: мазков/соскобов, клеточных осадков биологических жидкостей, фиксацию их в ацетоне; обработку 1% раствором бихромата калия; обработку 3% раствором перекиси водорода; нанесение моноклональных антител к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза в разведении 1:20; инкубацию при температуре 3-5 градусов Цельсия в течение 12 часов; нанесение системы детекции EnVision и инкубацию при комнатной температуре; нанесение диаминобензидина; докрашивание гематоксилином; заключение в бальзам или другую среду, микроскопирование, диагностирование заболевания при выявлении антигена микобактерии туберкулез. Способ обеспечивает повышение точности выявления антигена микобактерии туберкулеза, уменьшение стоимости диагностики и возможность его применения в практическом здравоохранении. 2 ил.

 

Данное изобретение относится к области медицинской диагностики, а именно к выявлению экспрессии антигена микобактерии туберкулеза путем постановки иммуноцитогистохимической реакции.

Наиболее известным морфологическим методом выявления и диагностики туберкулеза и ближайшим аналогом является бактериоскопическое исследование мазков/соскобов из очагов поражения, клеточных осадков биологических жидкостей на предмет обнаружения в них микобактерии туберкулеза (МБТ) с окраской препарата по Циль-Нильсену - так называемая простая бактериоскопия (Приказ Минздрава РФ №109 от 21.03.2003 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации"). Этот метод можно использовать и для парафиновых срезов, что имеет особую актуальность в патологической анатомии.

Методика этого способа диагностики заключается в следующем:

1. срезы/мазки помещают в дистиллированную воду;

2. погружают в раствор йодной кислоты, оставляют в ней на 10 минут;

3. промывают срезы/мазки в дистиллированной воде;

4. погружают срезы/мазки в раствор карбол-фуксина, оставляют на 30 минут;

5. промывают срезы/мазки в дистиллированной воде и просушивают при помощи фильтровальной бумаги;

6. наносят на срез/мазок 10 капель дифференцирующий кислотный буфер, оставляют на 1 минуту;

7. промывают срезы/мазки под проточной водой в течение 3 минут;

8. а. для срезов: наносят на срез 10 капель гематоксилина Майера, оставляют на 2 минуты;

б. для мазков: наносят на мазок 10 капель раствор метиленового синего и 5 капель активизирующего основного буфера, оставляют на 30 секунд;

9. промывают срезы в дистиллированной и проточной воде в течение 5 минут, мазки - под проточной водой;

10. дегидрируют в спиртах возрастающей концентрации, просветляют в ксилоле, заключают под покровное стекло (Приведенный пример окраски с использованием красителей фирмы ООО «БиоВитрум»).

Результат окраски: микобактерии окрашиваются в красный цвет на общем голубом или синем фоне. Морфологические характеристики: обычно микобактерии видны в виде тонких изящных палочек, но иногда можно обнаружить изогнутые или извитые варианты. Микроорганизмы, располагающиеся по одиночке, парами или в виде групп, хорошо выделяются на голубом фоне других компонентов препарата. Нередко бактериальные клетки могут располагаться в виде римской цифры V. Однако в случае обнаружения измененных форм кислотоустойчивых микроорганизмов положительный ответ должен быть подтвержден дополнительными методами исследования.

Рассмотренный метод используется для массового обследования на туберкулез, в частности легких; преимущество его в быстроте получения результата и низкой стоимости исследования. Однако данный способ выявления МБТ обладает низкой чувствительностью, так как чтобы обнаружить микобактерии туберкулеза способом микроскопии, в 1 мл исследуемого материала должно содержаться не менее 10000 микробных клеток. Как указывается в вышеуказанном приказе, необходимо иметь в виду, что микроскопическое исследование не позволяет дифференцировать микобактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis (возбудителей туберкулеза) от нетуберкулезных («атипичных») микобактерий - возбудителей микобактериозов. На основании микроскопического исследования возможно сделать заключение только о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых микобактерий. Это объясняется тем, что в природе существует большое число нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий, вызывающих микобактериозы, а также кислотоустойчивых сапрофитов, не вызывающих заболевания человека. Микроскопически они неотличимы от Mycobacterium tuberculosis.

Отрицательный результат микроскопического исследования не исключает диагноз туберкулеза, так как в мокроте или других биологических материалах от пациента может содержаться меньше микобактерий, чем может выявить данное исследование. Все сказанное определяет особую актуальность разработки новых высокоспецифичных и чувствительных способов выявления микобактерии туберкулеза. В настоящий момент иммуноцитогистохимическая диагностика все шире используется в практической медицине.

Протокол постановки иммуноцитогистохимической реакции (В.Н.Эллиниди, Н.В.Аникеева, Н.А.Максимова. Практическая иммуногимтоцитохимия. Методические рекомендации. Санкт-Петербург, 2002) имеет следующие этапы:

1. А. мазки фиксируют в ацетоне 3-5 минут; сушат при комнатной температуре, рабочее поле обводят водостойким маркером со стороны мазка, с обратной стороны перманентным маркером;

Б. парафиновые срезы депарафинизируют в ксилоловом спирте 2 раза по 5 минут, затем в 96% этиловом спирте по 3 минуты 2 раза,

2. мазки/срезы промывают в фосфатно-солевом буфере (рН 7,3-7,5);

3. мазки/срезы помещают в 3% раствор перекиси водорода - 10 минут;

4. срезы промывают в дистиллированной воде, затем помещают в теплый цитратный буфер (рН 6,0) на 3 минуты, кипятят в нем 4 минуты, остужают при комнатной температуре;

5. мазки/срезы промывают в 2 порциях фосфатно-солевого буфера (рН 7,3-7,5);

6. наносят первые (специфичные) антитела;

7. инкубируют 1 час в термостате при температуре 37 градусов Цельсия;

8. промывают в 2 порциях буфера (рН 7,3-7,5), убирают излишки жидкости;

9. наносят систему детекции EnVision (Dako), инкубируют 45 минут при комнатной температуре;

10. промывают в 2 порциях буфера (рН 7,3-7,5);

11. наносят диаминобензидин на 1-2 минуты;

12. промывают в буфере (рН 7,3-7,5), затем промывают в дистиллированной воде;

13. слабо докрашивают гематоксилином;

14. срезы дегидратируют в спиртах: в 2 этиловых спиртах 96%, карбоксилоле, ксилоле, в каждом по 3 минуты;

15.заключают в бальзам или другую среду;

16. микроскопируют.

Но как показывает наш опыт, при использовании «стандартного» протокола постановки иммуноцитогистохимической реакции обнаружить антигены микобактерии туберкулеза не удается. В литературе нет данных об использовании данного метода для диагностики туберкулеза путем иммуноцитогистохимического выявления экспрессии антигена микобактерии туберкулеза.

Задача изобретения: создание способа диагностики туберкулеза путем проведения иммуноцитогистохимического исследования для повышения точности выявления антигена микобактерии туберкулеза и возможного его применения в практическом здравоохранении.

Для реализации этой цели впервые предложен модифицированный иммуноцитогистохимический метод исследования биологического материала (мазки/соскобы, клеточные осадки биологических жидкостей). Данный метод основан на специфической реакции антиген - антитело. Он отличается простотой постановки реакции, высокой специфичностью и чувствительностью. Препараты можно просматривать в обычном световом микроскопе и фотографировать.

Предложенный метод отличается тем, что:

1. Перед нанесением перекиси водорода мазки обрабатываются 1% раствором бихромата калия, что способствует повышению проницаемости клеточных мембран и большей доступности выявляемого антигена для антител.

2. На мазки/соскобы в качестве первых (специфических) антител наносят моноклональные мышиные антитела к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза (производства Vector Laboratories), адаптированные нами для постановки иммуноцитогистохимической реакции: разведение первых антител 1:20, инкубация осуществляется при температуре 3-5 градусов Цельсия в течение 12 часов.

3. В качестве вторых антител используется система детекции Dako REAL™ EnVision™ Detection Sistem. Длительность инкубации в растворе вторых антител 1 час при комнатной температуре. Используемая система (ЕnVision) основана на HRP-меченом полимере, который конъюгирован с вторичными антителами. Меченый полимер не содержит авидин или биотин. Следовательно, неспецифическое окрашивание при взаимодействии авидина с эндогенным биотином в исследуемой ткани исключено или значительно снижено. Эта система является высокочувствительной и, как следствие, оптимальное разведение первичных антител в 20 раз выше, чем при традиционном использовании РАР-способа, и в несколько раз больше, чем те, которые традиционно использовались для традиционных ABC или LSAB-методов.

В рамках предложенного проекта впервые используются антитела к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза, адаптированные нами для постановки иммуноцитогистохимической реакции. Обработка раствором бихромата калия, пролонгированное время инкубации при низкой температуре первых антител и использование в качестве системы детекции EnVision позволило получить высокоспецифичный и надежный метод выявления антигена микобактерии туберкулеза. Проводимая при этом оценка локализации антигена микобактерии туберкулеза, с учетом характерных патогистологических изменений дает возможность значительно повысить точность и объективность диагностики туберкулеза.

Предложенный впервые новый подход к способу выявления микобактерии туберкулеза и комплекс методических приемов, выполняемых в процессе иммуноцитогистохимического выявления микобактерии, является обязательным. Невыполнения их не дает объективных результатов или искажает конечный результат исследований, не позволяет провести соответствующую интерпретацию полученных данных.

Предложенный способ осуществляется следующим образом:

1. мазки/соскобы фиксируют в ацетоне 3-5 минут; сушат при комнатной температуре, рабочее поле обводят водостойким маркером со стороны мазка, с обратной стороны перманентным маркером;

2. мазки/соскобы промывают в фосфатно-солевом буфере (рН 7,3-7,5);

3. обрабатывают 1% раствором бихромата калия 3-4 минуты;

3. мазки/соскобы помещают в 3% раствор перекиси водорода - 20 минут;

4. мазки/соскобы промывают в 2 порциях фосфатно-солевого буфера (рН 7,3-7,5);

5. наносят моноклональные антитела к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза в разведении 1:20;

6. инкубируют 12 часов при температуре 3-5 градусов Цельсия;

7. промывают в 2 порциях буфера (рН 7,3-7,5), убирают излишки жидкости;

8. наносят систему детекции EnVision (вторые антитела), инкубируют 60 минут при комнатной температуре;

9. промывают в 2 порциях буфера (рН 7,3-7,5);

10. наносят диаминобензидин на 1-2 минуты;

11. промывают в буфере (рН 7,3-7,5), затем промывают в дистиллированной воде;

12. слабо докрашивают гематоксилином;

13. заключают в бальзам или другую среду;

14. микроскопируют.

Для получения достоверных результатов и исключения возможности неспецифических реакций обязательным условием является проведение контролей на качество реактивов и специфичность антисыворотки.

Для проведения контроля специфичности антисыворотки в качестве первого слоя наносят буфер (результаты должны быть отрицательными).

Оценка продукта реакции: антиген микобактерии туберкулеза выявляется в виде тонких или более утолщенных, изогнутых и извитых палочек коричневого цвета различной интенсивности окраски, разных размеров. Микобактерии могут располагаться одиночно или группами, принимая различные геометрические формы, иногда имеют сходство с кокками или в виде утолщенных образований, напоминающих мицелий грибов. Микобактерии могут располагаться в цитоплазме клеток, на клеточной оболочке и между клетками (свободно лежащие), в таком случае результат трактуется как положительный, при отсутствии продукта реакции результат трактуется как отрицательный.

Описанный способ подкреплен примерами конкретного выполнения. Было проведено исследование мазков с операционного материала от 16 больных с остеомиелитом, в 9 случаях был выявлен антиген микобактерии туберкулеза. В качестве примера приводим иммуноцитохимическое исследование мазка с операционного материала от больного Жданова А.А., 19.06.08 г.р., № и/б 2086, находившегося на лечении в период с 17.02.10. по 19.01.11 г. с диагнозом: туберкулезный (БЦЖ по клинико-лабораторным данным) остит проксимального эпиметафиза левой плечевой кости, осложнившийся абсцессом. Данный случай интересен тем, что при наличии клинико-лабораторных данных, свидетельствующих о развитии туберкулезного процесса, при микроскопии мазков операционного материала, окрашенных по Циль-Нильсену, микобактерии туберкулеза не были выявлены. В связи с этим было проведено иммуноцитогистохимическое исследование для уточнения этиологии заболевания. В результате проведенной нами иммуноцитогистохимической окраски мазков с операционного материала от данного больного были выявлены микобактерии туберкулеза, представленные на рисунке 1 и 2, где позиция 1 - микобактерии туберкулеза.

Положительный эффект от использования заявляемого изобретения заключается в следующем:

Иммуноцитогистохимический способ диагностики туберкулеза позволяет обнаружить антиген микобактерии туберкулеза в тех случаях, когда рекомендуемые способы, в частности бактериоскопия с окраской по Циль-Нильсену, не позволяет выявить возбудителя. Положительная иммуноцитогистохимическая реакция дает возможность говорить о наличии только микобактерии туберкулеза. Данный способ выявляет даже единичные микобактерии. Докраска гематоксилином помогает оценить локализацию антигена, характер морфологических изменений, что также способствует повышению точности диагностики.

Исследование надежно, специфично, чувствительно. Метод достаточно прост, возможно, его широкое применение в практическом здравоохранении для быстрого выявления микобактерии туберкулеза и, соответственно, своевременного назначения этиологической и патогенетической (противотуберкулезной) терапии.

Предлагаемый способ имеет экономическую значимость, т.к. при этом не требуется применения дополнительного лабораторного оборудования.

Способ диагностики туберкулеза путем проведения иммуноцитогистохимического исследования, включающий выявление наличия антигена микобактерии туберкулеза, характеризующийся тем, что берут мазки/соскобы, клеточные осадки биологических жидкостей, фиксируют их в ацетоне; сушат; промывают в фосфатно-солевом буфере, обрабатывают 1% раствором бихромата калия; помещают в 3% раствор перекиси водорода; промывают; наносят моноклональные антитела к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза в разведении 1:20; инкубируют при температуре 3-5 градусов Цельсия в течение 12 часов; промывают; наносят систему детекции EnVision и инкубируют при комнатной температуре; промывают; наносят диаминобензидин; промывают; слабо докрашивают гематоксилином; заключают в бальзам или другую среду, микроскопируют и при выявлении антигена микобактерии туберкулеза диагностируют заболевание.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способу ранней детекции мышечных дегенеративных заболеваний и к способу прогнозирования и/или определения терапевтической эффективности терапевтического средства и/или способа терапии заболеваний посредством измерения тетранор-PGDM (11,15-диоксо-9α-гидрокси-2,3,4,5-тетранорпростан-1,20-диовой кислоты) в образце мочи субъекта и сравнения его содержания относительно образца, выделенного у здорового индивидуума.

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам оценки влияния неблагоприятных химических факторов антропогенного происхождения на изменение поствакцинального иммунитета у детей к дифтерии.

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и может быть использовано для оценки чувствительности сосудистого эндотелия к напряжению сдвига. Способ заключается в следующем: до и после окклюзионной пробы определяют уровень нитритов и эндотелина в крови.

Изобретение относится к медицине, а именно к ревматологии, и может быть использовано для диагностики ранней стадии ревматоидного артрита. Для этого производят забор у пациента одновременно образцов костного мозга и синовиальной оболочки, из которых готовят препараты для иммуногистохимического и иммуноцитохимического исследований.
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан химерный пестивирус, где указанный химерный пестивирус включает вирус диареи крупного рогатого скота, который не экспрессирует его гомологичный Erns белок.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен L-фукоза α1→6-специфичный лектин, экстрагируемый из базидиального гриба или сумчатого гриба, характеризующийся пиковым значением молекулярной массы около 4500 m/z, определяемым при масс-спектрометрическом анализе MALDI-TOF.
Изобретение относится к медицине, в частности к области лабораторной диагностики рака молочной железы, и описывает набор реагентов для иммунногистохимической диагностики рака молочной железы, который позволяет одновременно или раздельно выявлять рецепторы эстрогена, прогестерона и HER2-рецепторы.
Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано для лечения респираторного дистресс-синдрома у новорожденных детей, находящихся на искусственной вентиляции легких (ИВЛ).

Группа изобретений относится к области медицины и может быть использована для получения костного мозга (КМ) от доноров-трупов. Для этого пунктируют крылья подвздошных костей в передней и задней трети крыльев, устанавливая в каждое по два троакара.

Изобретение относится к биологическим исследованиям и медицине и предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия фенола, поступающего из среды обитания, на здоровье населения.
Изобретение относится к области медицины, а именно к травматологии и ортопедии, и описывает способ прогнозирования послеоперационной регенерации у пациентов с ложными суставами длинных трубчатых костей, включающий исследования венозной крови пациента, анализ результатов ее исследования с выдачей прогноза послеоперационной регенерации по выбранным показателям, в плазме крови пациента определяют уровень содержания диеновых конъюгатов (ДК) и двойных связей (ДС) в липидах плазмы крови, количество липидов в плазме крови пациента, количество белка «острой фазы» - церулоплазмина, а также определяют процентное содержание высоко стойких эритроцитов в крови пациента, оценивают интегральные показатели изменения состояния молекулярно-биологических процессов в системе равновесия перекисного окисления липидов (ПОЛ) плазмы крови пациента и ее антиоксидантной защиты (АОЗ), при этом критерием возникновения дисбаланса в системе «ПОЛ-АОЗ» плазмы крови пациента выбирают в качестве интегрального показателя произведение содержания диеновых конъюгатов (ДК) и двойных связей (ДС) в липидах плазмы крови пациента, затем в случае, если измеренный показатель содержания двойных связей (ДС) составляет (29,6-37)10-7 М/мг липидов, измеренный показатель содержания диеновых конъюгатов (ДК) составляет (2,34-2,76)10-1 условных единиц, вычисленный по результатам измерений интегральный показатель в виде произведения ДС×ДК составляет (69,3-102,1)10-8 условных единиц, количество липидов в плазме крови пациента составляет 6,2-8,6 мг/мл, количество белка «острой фазы» - церулоплазмина в плазме крови пациента составляет 29,6-36,8 условных единиц, а процентное содержание высоко стойких эритроцитов в популяции эритроцитов в плазме крови пациента составляет (14,3-17,3)%, то прогнозируют прохождение процессов, сопровождающихся нарушением структуры мембран эритроцитов с проявлением замедленной консолидации поврежденного элемента опорно-двигательного аппарата с образованием не осложненного воспалительными процессами ложного сустава, а в случае, если измеренный показатель содержания двойных связей (ДС) составляет (41,6-49,4)10-7 М/мг липидов, измеренный показатель содержания диеновых конъюгатов (ДК) составляет (3,16-3,54)10-1 условных единиц, вычисленный по результатам измерений интегральный показатель в виде произведения ДС×ДК составляет (131,5-174,9)10-8 условных единиц, количество липидов в плазме крови пациента составляет 2,6-5,8 мг/мл, количество белка «острой фазы» - церулоплазмина в плазме крови пациента составляет 41,6-49,4 условных единиц, а процентное содержание высоко стойких эритроцитов в популяции эритроцитов в плазме крови пациента составляет (4,6-6,0)%, то прогнозируют прохождение процесса нарушения структуры мембран эритроцитов с проявлением замедленной консолидации поврежденного элемента опорно-двигательного аппарата с образованием отягощенного нагноением осложненного ложного сустава. Способ обеспечивает значительное повышение эффективности и информативности, объективности прогнозирования у пациентов с ложными суставами длинных трубчатых костей. 1 з.п. ф-лы, 4 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования течения и исходов бактериальных гнойных менингитов (БГМ) различной этиологии у детей. Для этого определяют в цереброспинальной жидкости иммуноцитохимическим методом наличие CD31 и S100 позитивных клеток в 1-2 день заболевания. При содержании CD31 более 0,5% и наличии S100 позитивных клеток прогнозируют неблагоприятное течение БГМ. При содержании CD31 менее 0,5% и отсутствии S100 позитивных клеток прогнозируют благоприятное течение заболевания. Применение предложенного способа ликворо-цитологического прогноза течения БГМ у детей позволяет прогнозировать на ранних сроках болезни благоприятное и неблагоприятное течение заболевания, проводить мониторинг состояния сосудов микроциркуляторного русла головного мозга в ходе заболевания и корректировать терапию. 1 табл., 2 ил., 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования задержки внутриутробного роста плода. Для этого в венозной крови женщины на ранних сроках беременности определяют относительное содержание CD3+CD16+56+-лимфоцитов, уровня С3-компонента комплемента и растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNF-R). Вычисляют прогностический индекс (PI) по формуле: PI=-0,8911X1-0,0321Х2-2,3669Х3+11,0779, где X1 - относительное содержание CD3+CD16+CD56+-лимфоцитов, %; X2 - концентрация С3-компонента комплемента, мг/дл; Х3 - концентрация sTNF-R, нг/мл. При PI<0 прогнозируют задержку внутриутробного роста плода во второй половине беременности, а при PI>0 делают заключение о низком риске развития данного патологического состояния. Предлагаемый способ является малоинвазивным, позволяет с ранних сроков гестации выявить группу риска по формированию задержки внутриутробного роста плода, что дает возможность осуществления превентивных мероприятий, направленных на профилактику данного патологического состояния. 5 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для дифференциальной морфометрической диагностики эритродермической формы грибовидного микоза и синдрома псевдолимфомы кожи. Для этого проводят гистологическое исследование биоптатов пораженной кожи путем световой микроскопии, иммунофенотипирование клеток инфильтрата, дополнительные морфометрические исследования базальных кератиноцитов в гистологических препаратах биоптатов пораженной кожи. При этом при схожей гистологической картине, описываемой при эритродермической форме грибовидного микоза и синдроме псевдолимфомы кожи как акантоз, гиперкератоз, паракератоз, отек и расширение сосудов дермы, лимфогистиоцитарные инфильтраты, расположенные в верхней трети дермы, одинаковом иммунофенотипе клеток инфильтрата при эритродермической форме грибовидного микоза и синдроме псевдолимфомы кожи, представленном CD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD43+, CD45RO+ лимфоцитами, проводят дополнительно морфометрические исследования всех клеток эпидермиса. Далее рассчитывают относительный объем эпидермиса и митотический индекс эпидермальных клеток. При увеличении относительного объема эпидермиса в 2,2 и более раза по сравнению с нормальной кожей и увеличении митотического индекса эпидермальных клеток в 2,7 и более раза по сравнению с нормальной кожей диагностируют эритродермическую форму грибовидного микоза, а при неизмененных по сравнению с нормальной кожей относительном объеме эпидермиса и митотическом индексе эпидермальных клеток диагностируют синдром псевдолимфомы кожи. Изобретение обеспечивает ускорение и точность дифференциальной диагностики указанных видов лимфом кожи, что позволяет выбрать тактику раннего адекватного рационального лечения пациента. 2 табл., 2 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу определения интерферон-γ-продуцирующих Т-лимфоцитов при хроническом лимфолейкозе. Сущность способа состоит в том, что осуществляют ингибирование внутриклеточного транспорта - брефелдином А в клеточной культуре, далее подвергают немедленной обработке флуоресцеинизотиоционат-меченными анти-СD3 антителами, затем проводят стимуляцию синтеза интерферона-γ, фиксацию, пермеабилизацию, окраску фикоэритрин-меченными анти-интерферон-γ моноклональными антителами и осуществляют цитометрию, наблюдают совпадение флуоресцентной метки СD3-маркера в клеточной культуре с таковой, определяемой на основании контролируемого метода. Использование заявленного способа позволяет устранить воздействие химических агентов, активирующих синтез интерферона-γ, таких как форбол-12-миристат-13-ацетата и кальциевой соли иономицина на экспрессию молекулы CD3 на мембране лимфоцитов, что повышает точность определения интерферон-γ-продуцирующих T-лимфоцитов в организме человека. 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине и описывает способ детекции поврежденных влажностью влагочувствительных реагентов, где указанные реагенты приводят в контакт с образцом, содержащим воду, и далее выявляется присутствие в образце анализируемого вещества, по его реакции с указанными влагочувствительными реагентами, причем указанный способ включает: (a) измерение отражения света при длине волны, характерной для продуктов указанной реакции указанных влагочувствительных реагентов с анализируемым веществом в двух заданных временных точках после контакта указанных реагентов с указанным образцом; (b) измерение в тех же двух заданных временных точках отражения света при длине волны, характерной для эталонного инфракрасного красителя, причем указанный краситель объединен с указанными влагочувствительными реагентами и имеет характерную длину волны, отличающуюся от длины волны, измеряемой в п.(a), по меньшей мере на 120 нм; (c) расчет соотношения показателей отражения, измеренных при длинах волн согласно пп.(a) и (b), и заключение о том, что реагенты имеют сниженную, чем ожидалось, активность и повреждены влажностью, на основании различия в указанном соотношении для указанных двух заданных временных точек. Способ обеспечивает более точное идентифицирование качества индикаторных полосок. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 ил.
Изобретение относится к области медицины, а именно к неврологии и гастроэнтерологии, и может быть использовано для диагностики аутоиммунного поражения различных структур вегетативной нервной системы (ВИС), регулирующих моторику желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Диагностику аутоиммунного поражения вегетативных структур желудочно-кишечного тракта проводят путем исследования сыворотки крови больного. При этом в образце сыворотки крови определяют антитела к α3-субъединице нейронального ацетилхолинового рецептора (α3-АХР) и рилизинг-гормону гонадолиберину (GnRH) методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) по взаимодействию с экстрацеллюлярным участком α3-субъединицы нейронального АХР и рилизинг-гормоном GnRH, а уровень антител к α3-АХР и GnRH определяют окрашиванием, используя в качестве хромогена тетраметилбензидин. Оптическое поглощение света измеряют на ИФА-анализаторе при длине волны 450 нм в единицах оптической плотности (OD). При повышении уровня антител к α3-АХР более 0,24 OD, a к GnRH менее 0,25 OD вплоть до полного их отсутствия относительно контроля диагностируют аутоиммунное поражение периферического отдела вегетативной нервной системы на уровне парасимпатических интрамуральных ганглиев и микроганглиев желудочно-кишечного тракта, а при уровне антител к GnRH более 0,25 OD и к α3-АХР менее 0,24 вплоть до полного их отсутствия диагностируют аутоиммунное поражение интрамуральных ганглиев и микроганглиев метасимпатического отдела желудочно-кишечного тракта. Способ обеспечивает определение вовлечения в аутоиммунный процесс с высокой точностью структур вегетативной нервной системы, регулирующих моторику ЖКТ, и выявление поражаемой молекулярной мишени, в частности парасимпатических и/или метасимпатических структур ВНС желудочно-кишечного тракта.
Изобретение относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, может быть использовано для титрования групповых антител системы АВО. Для определения титра естественных антител в каждую колонку нейтральной гелевой карты вносят 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов и 25 мкл одного из приготовленных разведений сыворотки крови. Инкубируют полученные смеси 20-25 минут при температуре 21-23°C. Далее центрифугируют и определяют титр по предельному разведению, при котором выявляется видимая агглютинация в толще колонки гелевой карты. Для определения титра полных иммунных антител используют 100-200 мкл сыворотки крови, разводя ее в четыре раза. Затем прогревают сыворотку в разведении 1:4 в течение 10 минут при температуре 70°. Готовят последующие разведения прогретой сыворотки с разведением 1:4. Далее в каждую колонку нейтральной гелевой карты вносят 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов и 25 мкл одного из приготовленных разведений. Инкубируют полученные смеси 20-25 минут при температуре 21-23°C, центрифугируют и определяют титр исследуемых антител. Для определения титра неполных иммунных антител используют 100-200 мкл сыворотки крови, разводят ее в четыре раза. Затем прогревают разведенную сыворотку крови в течение 10 минут при температуре 70°C. Готовят последующие разведения прогретой сыворотки с разведением 1:4. Далее в каждую колонку гелевой карты с реактивом Кумбса вносят 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов и 25 мкл одного из приготовленных разведений. Инкубируют полученные смеси, оставляя гелевую карту или карты с реактивом Кумбса на 20-25 минут при температуре 37°C. После чего гелевую карту или карты с реактивом Кумбса центрифугируют и определяют титр исследуемых антител по предельному разведению, при котором выявляется видимая агглютинация в толще колонки гелевой карты. Использование ланного способа позволяет предотвращать антитело-опосредованной реакции отторжения при проведении АВО-несовместимых трансплантаций органов. 2 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и представляет собой способ диагностики наружного генитального эндометриоза, включающий исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют уровень липопротеинов высокой плотности и при величине 0,77 ммоль/л и выше диагностируют наружный генитальный эндометриоз. Изобретение позволяет повысить точность и упростить процедуру диагностики наружного генитального эндометриоза. 3 пр.
Изобретение относится к лабораторной диагностике, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для определения функциональной активности ионизированного кальция (ФАИ Ca2+) в сыворотке крови человека. Способ определения ФАИ Ca2+ основан на проведении реакции лизиса эритроцитов барана 10% сывороткой крови человека при температуре 37°C в течение 10 мин в присутствии 0,55 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты в буферном растворе в течение 10 мин. После инкубации определяют степень ингибирования лизиса эритроцитов, при наличии ингибирования активности комплемента менее 30% оценивают повышенную функциональную активность ионизированного кальция в организме человека, от 31% до 70% - нормальную, более 71% - пониженную. Использование простого и быстрого в осуществлении способа позволяет выявлять доклинические состояния иммунодефицита, может служить специфическим маркером для иммуномодулирующей терапии, проводить углубленное исследование патогенеза аутоиммунных заболеваний, дает возможность их ранней профилактики и позволяет контролировать эффективность проводимой терапии. 5 пр., 6 табл.
Наверх