Способ определения интерферон-гамма-продуцирующих т-лимфоцитов при хроническом лимфолейкозе


 


Владельцы патента RU 2526797:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" (RU)

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу определения интерферон-γ-продуцирующих Т-лимфоцитов при хроническом лимфолейкозе. Сущность способа состоит в том, что осуществляют ингибирование внутриклеточного транспорта - брефелдином А в клеточной культуре, далее подвергают немедленной обработке флуоресцеинизотиоционат-меченными анти-СD3 антителами, затем проводят стимуляцию синтеза интерферона-γ, фиксацию, пермеабилизацию, окраску фикоэритрин-меченными анти-интерферон-γ моноклональными антителами и осуществляют цитометрию, наблюдают совпадение флуоресцентной метки СD3-маркера в клеточной культуре с таковой, определяемой на основании контролируемого метода. Использование заявленного способа позволяет устранить воздействие химических агентов, активирующих синтез интерферона-γ, таких как форбол-12-миристат-13-ацетата и кальциевой соли иономицина на экспрессию молекулы CD3 на мембране лимфоцитов, что повышает точность определения интерферон-γ-продуцирующих T-лимфоцитов в организме человека. 3 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике в гематологии, и касается определения одного из показателей иммунологической реактивности организма при хроническом лимфолейкозе (ХЛЛ).

T-лимфоциты имеют богатый рецепторный аппарат - около 100 маркеров, внесенных в современную номенклатуру [1]. Маркеры CD2, CD5 и CD7 применяются для количественной оценки Т-лимфоцитов, однако, кроме T-лимфоцитов, они экспрессируются на других популяциях лимфоцитов (натуральных киллерах, B-лимфоцитах). Высокоспецифическим «неперекрывающимся» маркером T-лимфоцитов является маркер CD3, это делает CD3 наиболее часто используемым при характеристике иммунного статуса человека.

Известны методы количественного определения числа Т-лимфоцитов, требующие применения моноклональных антител к дискретным T-клеточным антигенным детерминантам: метод комплементзависимой цитотоксичности, АРААР (alkaline phosphatase/anti-alkaline phosphatase)-тест, метод поверхностной иммунофлуоресценции. Однако количественная оценка T-лимфоцитов может оказаться недостаточной или неинформативной у иммунокомпрометированных лиц, например у больных с лимфопролиферативными заболеваниями. При хроническом лимфолейкозе в дебюте заболевания, B-клеточных лимфомах на стадии лейкемизации, а также при их рецидивировании в периферической крови больных наблюдается преобладание лимфоцитов, относящихся к B-линии и практически не отличающихся от здоровой популяции лимфоцитов по морфологическим признакам. Соотношение T/B-клеток у пациентов при данной группе заболеваний на указанных этапах соответствует в среднем 1,5±0,54, в то время как в группе здоровых лиц оно составляет 4,9±0,29. Абсолютное количество T-лимфоцитов нередко (в 30% случаев) значительно выше принятых нормативов, что объясняется влиянием некоторых цитокинов, вырабатываемых опухолевым клоном и запускающих пролиферацию T-лимфоцитов и их подвидов [2]. Уровень экспрессии рецепторов на T-лимфоцитах у таких больных оказывается ниже, чем в референтных группах (3). Малоинформативным для оценки иммунного статуса этой категории онкогематологических больных является и содержание иммуноглобулинов сыворотки крови в связи с известной способностью опухолевых лимфоцитов к продукции патологических иммуноглобулинов [4]. Изложенное диктует необходимость поиска тестов, отражающих функциональные способности T-лимфоцитов у названной группы иммунокомпрометированных лиц.

Популяция T-лимфоцитов периферической крови представляет собой многофункциональную группу, в которой часть клеток синтезирует интерферон-γ. Определение способности T-лимфоцитов к продукции этого цитокина может дать дополнительную информацию о состоянии T-клеточного звена иммунитета, например противовирусной и противоопухолевой защиты. В исследованиях in vitro установлено, что количество T-лимфоцитов, продуцирующих интерферон-γ в неактивированных культурах мононуклеаров, оказывается крайне незначительным как у новорожденных, так и у взрослых. В то же время выявленная способность некоторых веществ активировать синтез цитокинов in vitro позволила проводить изучение стимулированной продукции цитокинов на уровне одной клетки. Форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) является активатором протеинкиназы C, центральной молекулы многих сигнальных путей, приводящих к индукции синтеза цитокинов. Для работы протеинкиназы C требуется Ca2+, поэтому ФМА применяется в сочетании с ионофорами кальция. Иономицин кальция является таким ионофором - жирорастворимым веществом, способным транспортировать ионы через липидный бислой клеточной мембраны. Сочетание ФМА с иономицином кальция считается наиболее эффективным для активации синтеза разных видов цитокинов лейкоцитами человека [5].

Для определения внутриклеточных цитокинов подходит метод лазерной проточной цитометрии с использованием моноклональных антител, напрямую конъюгированных с разными флуорохромами, при котором флуорохромы имеют существенные различия по длине волны испускаемого света. Известно, что длительная инкубация с химическими веществами способна повредить мембраны лимфоцитов и влияет на их рецепторный аппарат. Вследствие этого исследователи зачастую предпочитают обходиться без детекции мембранных структур. В этом случае анализируется цитокин-секретирующая функция не в конкретной популяции лимфоцитов, а во всем пуле этих клеток. Однако оценка цитокин-секретирующей функции всего пула лимфоцитов периферической крови при B-клеточных хронических лимфопролиферативных заболеваниях в большинстве случаев оказывается некорректной в связи с преобладанием в периферическом русле моноклональных опухолевых B-лимфоцитов.

При выявлении внутриклеточных цитокинов необходимым явлется ингибирование выхода синтезированных цитокинов из клеток. Такими блокаторами могут выступать вещества: брефелдин A (антибиотик, продуцируемый грибком Eupenicillium brefeldianum) и моненсин (ациклический природный антибиотик полиэфирного типа со свойствами ионофора, выделенный из Streptomyces cinnamonensis). Наибольшей эффективностью обладает брефелдин A, поэтому на практике он наиболее часто используется [6].

По завершении стимуляции синтеза и ингибирования внутриклеточного транспорта выполняются собственно иммунологические реакции - связывание моноклональных антител с антигенами, экспрессированными как на поверхности лимфоцитов, так и внутри клетки. При этом требуется фиксация и пермеабилизация лейкоцитов, в настоящее время в качестве наилучшего фиксирующего агента используется параформальдегид (0,5-2%), а в качестве пермеабилизующего - сапонин (0,05-0,1%) [7]. Только после процедур фиксации и пермеабилизации становится возможным связывание интерферона-γ, находящегося в цитозоле, с флуорохром-меченными моноклональными анти-интерферон-γ антителами.

Таким образом, прототип способа идентификации интерферон-γ-продуцирующих T-лимфоцитов является трудоемкой лабораторной методикой, этапы которой описаны в разных инструктивных материалах [5, 6, 7, 8]. Опубликован опыт применения ближайшего аналога способа [9].

Пошаговое воспроизведение прототипа лабораторной методики было выполнено при исследовании образцов венозной крови 10 доноров и 12 больных ХЛЛ. Для выявления стимулированного и спонтанного синтеза интерферона-γ T-лимфоцитами из образца крови в стерильных условиях готовили клеточные культуры двух видов. Подготовка клеточных культур включала в себя смешивание 1000 мкл крови с 1000 мкл среды RPMI 1640 и инкубирование с брефелдином A в течение 2 часов в среде CO2. Для подготовки стимулированной клеточной культуры проводилась инкубация с ФМА (при конечной концентрации вещества - 100 нг/мкл) и кальциевой солью иономицина (при конечной концентрации вещества - 1 мкг/мкл) в течение 18 часов. При подготовке клеточной культуры для оценки спонтанного синтеза интерферона-γ вместо ФМА и иономицина в клеточную культуру вносили аналогичные аликвоты разбавителей этих веществ.

После окончания культивирования обе клеточные культуры дважды отмывали средой RPMI 1640, инкубировали с флуоресцеинизотиоционат-меченными анти- CD3 моноклональными антителами в течение 20 минут в темноте и отмывали от несвязавшихся антител методом центрифугирования в течение 5 минут при 600 g забуференным фосфатно-солевым раствором.

Затем проводили фиксацию клеток 0,5% раствором параформальдегида: энергичное встряхивание на вортексе, инкубирование в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут, в процессе чего происходил частичный лизис эритроцитов. Выполняли однократную отмывку клеток. Пермеабилизация включала пятиминутную обработку клеток раствором сапонина при деликатном покачивании пробирок. Проводили 30-минутную обработку клеток фикоэритрин-меченными моноклональными антителами против интерферона-γ человека, после чего выполняли отмывку от несвязавшихся антител забуференным фосфатно-солевым раствором путем центрифугирования в течение 5 минут при 600 g.

Спонтанную и стимулированную клеточные культуры анализировали на лазерном проточном цитофлуориметре. Для этого на основе определения параметров малоуглового и бокового светорассеяния на точечном графике выделяли полигон лимфоцитов и проводили анализ лимфоцитов на наличие двух флуоресцентных меток. Кроме того, процентное содержание CD3+-лимфоцитов у каждого донора и больного определяли стандартным методом проточной цитофлуориметрии, прошедшим внутрилабораторный и внешний контроль качества. Для этого использовались моноклональные антитела к антигенам, экспрессия которых в пределах лимфоцитов не перекрывается (анти-CD3 и анти-CD19) и далее выполнялось лизирование эритроцитов NH4Cl-содержащим раствором, фиксирование и отмывка.

Группа больных хроническим лимфолейкозом характеризовалась более выраженным варьированием по относительному содержанию в крови CD3+-лимфоцитов (2,5-43,0%) по сравнению с группой доноров (69,8-87,0%). В то же время в обеих группах количество CD3+-лимфоцитов, оцененное в стимулированных клеточных культурах, было значительно ниже по сравнению с таковым как в клеточных культурах без стимуляции, так и в цельной крови, определенном на основании контролируемого метода (табл.1). Выявленное различие может быть обусловлено влиянием ФМА и кальциевой соли иономицина на экспрессию CD3 на лимфоцитах, а именно на ее интернирование или частичное расщепление, что делает молекулу CD3 недоступной для дальнейшего связывания с моноклональными антителами. Таким образом, при оценке результатов в стимулированной культуре было зарегистрировано недовыявление CD3+-лимфоцитов как у доноров, так и больных хроническим лимфолейкозом.

Таблица 1
Относительное содержание CD3+-лимфоцитов в крови доноров и больных ХЛЛ, оцененное разными способами
Группы обследованных Результаты определения, %, Me (I кв.; III кв.)
I II III
в цельной крови (контролируемый метод) в спонтанной клеточной культуре в стимулированной клеточной культуре (прототип способа)
Доноры 72,9(70,3; 76,6) 69,3(65,8; 72,0) 25,6(13,6:39,3)
pI-III<0,001
pI-II=0,14
pII-III<0,001
Больные ХЛЛ 10,2(6,5; 16,4) 9,2(5,5; 16,4) 5,2(3,8; 10,8)
pI-III<0,05
pI-II=0,93 pII-III<0,05

Число CD3+-лимфоцитов, подсчитанное в клеточных культурах без стимуляции, не отличалось от результата, полученного в контролируемом методе. Это свидетельствует о том, что на определение CD3+-лимфоцитов в культуре крови не влияет добавление брефелдина A и длительная (20 часов) инкубация в среде RPMI 1640.

Таким образом был зарегистрирован существенный недостаток в прототипе способа, отражающийся на точности подсчета CD3+-лимфоцитов, а следовательно, и интерферон-γ T-лимфоцитов. Технической задачей настоящего изобретения являлось устранение указанного недостатка и повышение точности способа подсчета интерферон-γ-продуцирующих Т-лимфоцитов у больных ХЛЛ.

Сущность изобретения заключается в следующем. Из венозной гепаринизированной крови 25 доноров и 35 больных ХЛЛ, взятой в стерильную пробирку, готовили клеточную культуру, для чего смешивали 1000 мкл крови с 1000 мкл среды RPMI 1640; к полученной смеси добавляли 1 мкл брефелдина A, проводили тщательное перемешивание культуры на лабораторном вортексе. После этого приготовленную клеточную культуру немедленно обрабатывали анти-CD3 антителами, соблюдая необходимое соотношение объемов клеточной культуры и моноклональных антител: отделяли 100 мкл полученной клеточной культуры в другую стерильную пробирку, в нее вносили 20 мкл флуоресцеинизотиоционат-конъюгированных моноклональных антител к CD3 человека, клеточную культуру тщательно перемешивали на лабораторном вортексе и инкубировали в CO2-камере в течение 2 часов. Затем в клеточную культуру вносили активаторы синтеза цитокинов (ФМА и кальциевую соль иономицина) при перемешивании на вортексе и проводили инкубацию в CO2-камере в течение 18 часов. Дальнейшее проведение реакции выполняли при повторении всех этапов, предусмотренных прототипом, кроме этапа связывания с анти-CD3 моноклональными антителами. Оценка результатов иммунологической реакции выполнялась при сохранении прежних настроек лазерного проточного цитофлуориметра.

Сравнили результаты выявления CD3+-лимфоцитов в контролируемом методе и в стимулированной клеточной культуре доноров и больных ХЛЛ. Как видно из таблицы 2, процентное содержание CD3+-лимфоцитов среди клеток лимфоцитарного полигона при этом как у доноров, так и у больных не различалось. Таким образом, при применении описанного подхода нивелируется влияние активаторов синтеза цитокинов на понижение экспрессии CD3 на мембране и повышается точность метода определения интерферон-γ-продуцирующих T-лимфоцитов в крови.

Таблица 2
Относительное содержание CD3+-лимфоцитов в крови доноров и больных хроническим лимфолейкозом, оцененное разными способами
Группы обследованных Результаты определения, %, Me (I кв.; III кв.) p
в цельной крови (контролируемый метод) в стимулированной клеточной культуре по предлагаемому способу
Доноры 69,7±2,8 68,8±3,3 p=0,35
69,3(65,8; 72,0) 66,0(62,0; 71,3)
Больные хроническим лимфолейкозом 14,2±1,9 13,0±3,86 p=0,68
12,0(5,5; 16,4) 11,7(4,5; 12,3)

При анализе спонтанной и стимулированной клеточных культур регистрировали процент интерферон-γ+ клеток среди CD3+-лимфоцитов, что достигалось использованием методов программного обеспечения лазерного проточного цитофлуориметра. Провели расчеты, позволяющие использовать результаты лабораторного исследования стимулированного синтеза интерферона-γ T-лимфоцитами в практике клинического иммунолога. Для каждой пары наблюдений подсчитывали индекс стимуляции: процентное содержание интерферона-γ+ клеток среди CD3+-лимфоцитов в стимулированном тесте, деленное на процентное содержание интерферона-γ+ клеток среди CD3+-лимфоцитов в спонтанном тесте.

Разработанный способ определения интерферон-γ-продуцирующих T-лимфоцитов при ХЛЛ рекомендуется использовать в комплексной оценке состояния иммунной системы в этой группе онкогематологических больных. Повышение точности оценки рассматриваемого иммунологического показателя имеет несомненную практическую ценность.

Способ найдет применение в клинико-диагностических лабораториях учреждений, оказывающих специализированную, в том числе высокотехнологичную, медицинскую помощь больным лимфопролиферативными заболеваниями; предлагаемый метод исследования является технически доступным для специализированных лабораторий.

Пример

На основании результатов, полученных в группе здоровых доноров, были определены значения нормы изучаемых показателей. Для проведения статистического сравнительного анализа вычислено среднее значение со средней ошибкой, для выявления лиц с отклонениями установлен биологический разброс - 95% доверительный интервал (табл.3).

У больных хроническим лимфолейкозом зарегистрированы существенно более высокие значения содержания интерферон-γ+ T-лимфоцитов в спонтанной культуре, что, вероятно, связано с присутствием в группе больных лиц с напряжением противовирусного и противоопухолевого иммунитета.

Таблица 3
Показатели спонтанного и стимулированного синтеза интерферона-γ CD3+-лимфоцитами у доноров и больных ХЛЛ
Интерферон-γ+ CD3+ лимфоциты Группы обследованных P
Доноры, n=25 (M±m, 95%-интервал) Больные, n=35 (M±m)
В спонтанной клеточной культуре (%) 0,05±0,03 0,2±0,03 p<0,05
0,01-0,04
В стимулированной клеточной культуре (%) 20,7±4,43 21,4±5,19 p=0,89
12,0-29,4
Индекс стимуляции 1168,6±323,3 214,0±45,8 p<0,001
625,6-1620,1

В общей группе больных наблюдалось возрастание относительного числа интерферон-γ+ T-лимфоцитов в стимулированной клеточной культуре по сравнению с нестимулированной. Среднестатистическое значение индекса стимуляции у больных существенно отличалось от нормы в сторону понижения, что обусловлено более высокими значениями показателя в спонтанном тесте и присутствием в этой группе лиц, характеризующихся полным отсутствием эффекта стимуляции синтеза интерферона-γ. В группе больных в 20% случаев наблюдалось понижение относительного количества интерферон-γ+ CD3+-лимфоцитов в стимулированной клеточной культуре по сравнению с референтными значениями. У 11,4% больных отмечалось совпадение результатов спонтанного и стимулированного тестов, то есть была полная неотвечаемость T-лимфоцитов на стимуляторы.

Литература

1. Бурместер Г.-Р. Наглядная иммунология. / Г.-Р. Бурместер, А. Пецутто. - М.: БИНОМ, 2007. - 320 с.

2. Воробьев А.И. Руководство по гематологии: в 3 т. Т.1 Под ред. А.И. Воробьева. 3-е изд., перераб. и допол. М. - Ньюдиамед, 2002, 280 с.

3. Laboratory signs of T-cell anergy in chronic lympholeukemia / N.V. Isaeva, G.A. Zaitseva, T.P. Zagoskina, Y.A. Poponina // Cellular Therapy and Transplantation. - 2011. - Vol.3. - P.49

4. Сисла Б. Руководство по лабораторной гематологии. - М.: Практическая медицина, 2011. - 352 с.

5. Detection of intrercellular cytokines by flow cytometry / T. Jung, U. Schauer, C. Heusser, C. Neumann, C. Rieger // Journal of Immunological Methods. - 1993. - Vol.159. - P.197-207.

6. Dynamics of GBF1, a Brefeldin A - Sensitive Arf1 Exchange factor at the Golgi / T.-K. Nui, A.C. Pfeifer, J. Lippincott-Schwartz, C.L. Jackson // Molecular Biology of the Cell. - 2005. - Vol.16. - P.1213-1222.

7. Enumeration of INF-gamma producing cells by flow cytometry. Comparison with fluorescence microscopy / U. Anderson, G. Hallden, U. Persson et al.//Journal of Immunological Methods. - 1988. - Vol.112. - P.139-142.

8. Kallel C. et al. Detection by flow cytometry of T cell subsets secreting IL-2 and UNFγ (Gamma): optimisation for the technic and the establishment of reference values // Pathology Biology (Paris). - 2007. - v.55 (5), h.222-229 (реферат).

9. Уровень CD3+-лимфоцитов, содержащих интерферон-γ, у больных туберкулезом легких и его изменение после включения в комплексную терапию полиоксидония. / Е.Э. Комогорова, Е.В. Костенко, В.А. Стаханов [и др.] // Иммунология. - 2004. - №4. - С.210-213.

Способ определения интерферон-γ-продуцирующих T-лимфоцитов при хроническом лимфолейкозе, включающий ингибирование внутриклеточного транспорта в клеточной культуре, стимуляцию синтеза интерферона-γ, связывание с флуоресцеинизотиоционат-меченными анти-CD3 моноклональными антителами, фиксацию, пермеабилизацию, обработку фикоэритрин-меченными анти-интерферон-γ моноклональными антителами и цитометрический анализ, отличающийся тем, что клеточную культуру, смешанную с ингибитором внутриклеточного транспорта - брефелдином A, подвергают немедленной обработке флуоресцеинизотиоционат-меченными анти-CD3 антителами, затем проводят стимуляцию синтеза интерферона-γ, фиксацию, пермеабилизацию, окраску фикоэритрин-меченными анти-интерферон-γ моноклональными антителами и цитометрию: наблюдают совпадение флуоресцентной метки CD3-маркера в клеточной культуре с таковой, определяемой на основании контролируемого метода, при этом регистрируют повышение точности анализа.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для дифференциальной морфометрической диагностики эритродермической формы грибовидного микоза и синдрома псевдолимфомы кожи.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования задержки внутриутробного роста плода. Для этого в венозной крови женщины на ранних сроках беременности определяют относительное содержание CD3+CD16+56+-лимфоцитов, уровня С3-компонента комплемента и растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNF-R).

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования течения и исходов бактериальных гнойных менингитов (БГМ) различной этиологии у детей.
Изобретение относится к области медицины, а именно к травматологии и ортопедии, и описывает способ прогнозирования послеоперационной регенерации у пациентов с ложными суставами длинных трубчатых костей, включающий исследования венозной крови пациента, анализ результатов ее исследования с выдачей прогноза послеоперационной регенерации по выбранным показателям, в плазме крови пациента определяют уровень содержания диеновых конъюгатов (ДК) и двойных связей (ДС) в липидах плазмы крови, количество липидов в плазме крови пациента, количество белка «острой фазы» - церулоплазмина, а также определяют процентное содержание высоко стойких эритроцитов в крови пациента, оценивают интегральные показатели изменения состояния молекулярно-биологических процессов в системе равновесия перекисного окисления липидов (ПОЛ) плазмы крови пациента и ее антиоксидантной защиты (АОЗ), при этом критерием возникновения дисбаланса в системе «ПОЛ-АОЗ» плазмы крови пациента выбирают в качестве интегрального показателя произведение содержания диеновых конъюгатов (ДК) и двойных связей (ДС) в липидах плазмы крови пациента, затем в случае, если измеренный показатель содержания двойных связей (ДС) составляет (29,6-37)10-7 М/мг липидов, измеренный показатель содержания диеновых конъюгатов (ДК) составляет (2,34-2,76)10-1 условных единиц, вычисленный по результатам измерений интегральный показатель в виде произведения ДС×ДК составляет (69,3-102,1)10-8 условных единиц, количество липидов в плазме крови пациента составляет 6,2-8,6 мг/мл, количество белка «острой фазы» - церулоплазмина в плазме крови пациента составляет 29,6-36,8 условных единиц, а процентное содержание высоко стойких эритроцитов в популяции эритроцитов в плазме крови пациента составляет (14,3-17,3)%, то прогнозируют прохождение процессов, сопровождающихся нарушением структуры мембран эритроцитов с проявлением замедленной консолидации поврежденного элемента опорно-двигательного аппарата с образованием не осложненного воспалительными процессами ложного сустава, а в случае, если измеренный показатель содержания двойных связей (ДС) составляет (41,6-49,4)10-7 М/мг липидов, измеренный показатель содержания диеновых конъюгатов (ДК) составляет (3,16-3,54)10-1 условных единиц, вычисленный по результатам измерений интегральный показатель в виде произведения ДС×ДК составляет (131,5-174,9)10-8 условных единиц, количество липидов в плазме крови пациента составляет 2,6-5,8 мг/мл, количество белка «острой фазы» - церулоплазмина в плазме крови пациента составляет 41,6-49,4 условных единиц, а процентное содержание высоко стойких эритроцитов в популяции эритроцитов в плазме крови пациента составляет (4,6-6,0)%, то прогнозируют прохождение процесса нарушения структуры мембран эритроцитов с проявлением замедленной консолидации поврежденного элемента опорно-двигательного аппарата с образованием отягощенного нагноением осложненного ложного сустава.

Изобретение относится к медицине, в частности к области медицинской диагностики, и описывает способ диагностики туберкулеза путем проведения иммуноцитогистохимического исследования и выявления экспрессии антигена микобактерии туберкулеза.

Изобретение относится к способу ранней детекции мышечных дегенеративных заболеваний и к способу прогнозирования и/или определения терапевтической эффективности терапевтического средства и/или способа терапии заболеваний посредством измерения тетранор-PGDM (11,15-диоксо-9α-гидрокси-2,3,4,5-тетранорпростан-1,20-диовой кислоты) в образце мочи субъекта и сравнения его содержания относительно образца, выделенного у здорового индивидуума.

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам оценки влияния неблагоприятных химических факторов антропогенного происхождения на изменение поствакцинального иммунитета у детей к дифтерии.

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и может быть использовано для оценки чувствительности сосудистого эндотелия к напряжению сдвига. Способ заключается в следующем: до и после окклюзионной пробы определяют уровень нитритов и эндотелина в крови.

Изобретение относится к медицине, а именно к ревматологии, и может быть использовано для диагностики ранней стадии ревматоидного артрита. Для этого производят забор у пациента одновременно образцов костного мозга и синовиальной оболочки, из которых готовят препараты для иммуногистохимического и иммуноцитохимического исследований.
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан химерный пестивирус, где указанный химерный пестивирус включает вирус диареи крупного рогатого скота, который не экспрессирует его гомологичный Erns белок.

Изобретение относится к медицине и описывает способ детекции поврежденных влажностью влагочувствительных реагентов, где указанные реагенты приводят в контакт с образцом, содержащим воду, и далее выявляется присутствие в образце анализируемого вещества, по его реакции с указанными влагочувствительными реагентами, причем указанный способ включает: (a) измерение отражения света при длине волны, характерной для продуктов указанной реакции указанных влагочувствительных реагентов с анализируемым веществом в двух заданных временных точках после контакта указанных реагентов с указанным образцом; (b) измерение в тех же двух заданных временных точках отражения света при длине волны, характерной для эталонного инфракрасного красителя, причем указанный краситель объединен с указанными влагочувствительными реагентами и имеет характерную длину волны, отличающуюся от длины волны, измеряемой в п.(a), по меньшей мере на 120 нм; (c) расчет соотношения показателей отражения, измеренных при длинах волн согласно пп.(a) и (b), и заключение о том, что реагенты имеют сниженную, чем ожидалось, активность и повреждены влажностью, на основании различия в указанном соотношении для указанных двух заданных временных точек. Способ обеспечивает более точное идентифицирование качества индикаторных полосок. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 ил.
Изобретение относится к области медицины, а именно к неврологии и гастроэнтерологии, и может быть использовано для диагностики аутоиммунного поражения различных структур вегетативной нервной системы (ВИС), регулирующих моторику желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Диагностику аутоиммунного поражения вегетативных структур желудочно-кишечного тракта проводят путем исследования сыворотки крови больного. При этом в образце сыворотки крови определяют антитела к α3-субъединице нейронального ацетилхолинового рецептора (α3-АХР) и рилизинг-гормону гонадолиберину (GnRH) методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) по взаимодействию с экстрацеллюлярным участком α3-субъединицы нейронального АХР и рилизинг-гормоном GnRH, а уровень антител к α3-АХР и GnRH определяют окрашиванием, используя в качестве хромогена тетраметилбензидин. Оптическое поглощение света измеряют на ИФА-анализаторе при длине волны 450 нм в единицах оптической плотности (OD). При повышении уровня антител к α3-АХР более 0,24 OD, a к GnRH менее 0,25 OD вплоть до полного их отсутствия относительно контроля диагностируют аутоиммунное поражение периферического отдела вегетативной нервной системы на уровне парасимпатических интрамуральных ганглиев и микроганглиев желудочно-кишечного тракта, а при уровне антител к GnRH более 0,25 OD и к α3-АХР менее 0,24 вплоть до полного их отсутствия диагностируют аутоиммунное поражение интрамуральных ганглиев и микроганглиев метасимпатического отдела желудочно-кишечного тракта. Способ обеспечивает определение вовлечения в аутоиммунный процесс с высокой точностью структур вегетативной нервной системы, регулирующих моторику ЖКТ, и выявление поражаемой молекулярной мишени, в частности парасимпатических и/или метасимпатических структур ВНС желудочно-кишечного тракта.
Изобретение относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, может быть использовано для титрования групповых антител системы АВО. Для определения титра естественных антител в каждую колонку нейтральной гелевой карты вносят 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов и 25 мкл одного из приготовленных разведений сыворотки крови. Инкубируют полученные смеси 20-25 минут при температуре 21-23°C. Далее центрифугируют и определяют титр по предельному разведению, при котором выявляется видимая агглютинация в толще колонки гелевой карты. Для определения титра полных иммунных антител используют 100-200 мкл сыворотки крови, разводя ее в четыре раза. Затем прогревают сыворотку в разведении 1:4 в течение 10 минут при температуре 70°. Готовят последующие разведения прогретой сыворотки с разведением 1:4. Далее в каждую колонку нейтральной гелевой карты вносят 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов и 25 мкл одного из приготовленных разведений. Инкубируют полученные смеси 20-25 минут при температуре 21-23°C, центрифугируют и определяют титр исследуемых антител. Для определения титра неполных иммунных антител используют 100-200 мкл сыворотки крови, разводят ее в четыре раза. Затем прогревают разведенную сыворотку крови в течение 10 минут при температуре 70°C. Готовят последующие разведения прогретой сыворотки с разведением 1:4. Далее в каждую колонку гелевой карты с реактивом Кумбса вносят 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов и 25 мкл одного из приготовленных разведений. Инкубируют полученные смеси, оставляя гелевую карту или карты с реактивом Кумбса на 20-25 минут при температуре 37°C. После чего гелевую карту или карты с реактивом Кумбса центрифугируют и определяют титр исследуемых антител по предельному разведению, при котором выявляется видимая агглютинация в толще колонки гелевой карты. Использование ланного способа позволяет предотвращать антитело-опосредованной реакции отторжения при проведении АВО-несовместимых трансплантаций органов. 2 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и представляет собой способ диагностики наружного генитального эндометриоза, включающий исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют уровень липопротеинов высокой плотности и при величине 0,77 ммоль/л и выше диагностируют наружный генитальный эндометриоз. Изобретение позволяет повысить точность и упростить процедуру диагностики наружного генитального эндометриоза. 3 пр.
Изобретение относится к лабораторной диагностике, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для определения функциональной активности ионизированного кальция (ФАИ Ca2+) в сыворотке крови человека. Способ определения ФАИ Ca2+ основан на проведении реакции лизиса эритроцитов барана 10% сывороткой крови человека при температуре 37°C в течение 10 мин в присутствии 0,55 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты в буферном растворе в течение 10 мин. После инкубации определяют степень ингибирования лизиса эритроцитов, при наличии ингибирования активности комплемента менее 30% оценивают повышенную функциональную активность ионизированного кальция в организме человека, от 31% до 70% - нормальную, более 71% - пониженную. Использование простого и быстрого в осуществлении способа позволяет выявлять доклинические состояния иммунодефицита, может служить специфическим маркером для иммуномодулирующей терапии, проводить углубленное исследование патогенеза аутоиммунных заболеваний, дает возможность их ранней профилактики и позволяет контролировать эффективность проводимой терапии. 5 пр., 6 табл.

Изобретение относится к области офтальмологии и представляет собой способ прогнозирования развития пороговой стадии ретинопатии недоношенных у детей без офтальмоскопических признаков заболевания, отличающийся тем, что на сроке по 33 неделю гестационного возраста в сыворотке крови определяют содержание фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и при уровне VEGF, равном или превышающем 1300 пг/мл, прогнозируют развитие пороговой стадии ретинопатии недоношенных. Изобретение обеспечивает возможность коррекции тактики ведения недоношенных детей на этапах выхаживания. 2 ил., 1 табл., 5 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики спонтанной формы вторичной иммунной недостаточности у детей с первичным перитонитом. Способ заключается в том, что в пробе венозной крови определяют относительное содержание активированных классических моноцитов с фенотипом CD14bright CD16-HLA-DR+ от общего количества моноцитов с фенотипом CD14bright методом многоцветной проточной цитометрии и при его значении более 68,8% диагностируют спонтанную форму вторичной иммунной недостаточности. Использование заявленного способа позволяет с высокой специфичностью и чувствительностью диагностировать спонтанную форму вторичной иммунной недостаточности. 1 табл., 1 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу качественной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований околоушной слюнной железы по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости. Способ включает исследование ротовой жидкости пациента, при этом выполнение забора ротовой жидкости у пациента производится до или не ранее чем через 30 минут после приема пищи пациентом, центрифугирование ротовой жидкости пациента при 3000 об/мин в течение 15 минут, разбавление ротовой жидкости физиологическим раствором в соотношении 1:100 и повторное центрифугирование при 3000 об/мин в течение 15 минут, размещение готового для исследования материала ротовой жидкости пациента в кювету и выполнение стандартного метода иммуноферментного анализа на плашке на основе моноклональных антител, с последующим анализом результатов исследований, при этом ротовую жидкость забирают у пациента для качественной дифференциальной экспресс-диагностики новообразований околоушной слюнной железы по количеству содержания биомаркеров в ротовой жидкости, в качестве биомаркера выбирают матриксную металлопротеиназу 8 / matrix metalloproteinase 8 (ММП 8 / ММР 8) и определяют его количественное содержание в ротовой жидкости пациента, при этом за количественное содержание биомаркера ММП 8 в ротовой жидкости группы клинического контроля принимают уровень 23,85-39,65 нг/мл, и при содержании ММП 8 в количестве 611,32-792,00 нг/мл диагностируют аденому околоушной слюнной железы пациента, а при содержании ММП 8 в количестве 496,86-570,33 нг/мл диагностируют рак околоушной слюнной железы пациента, также определяют количественное содержание матриксной металлопротеиназы 9 / matrix metalloproteinase 9 (ММП 9 / ММР 9) в ротовой жидкости пациента, при этом за количественное содержание биомаркера ММП 9 группы клинического контроля принимают уровень 108,14-180,47 нг/мл, и при содержании ММП9 в количестве 326,43-458,23 нг/мл диагностируют аденому околоушной слюнной железы пациента, а при содержании ММП 9 в количестве 782,13-906,60 нг/мл диагностируют рак околоушной слюнной железы пациента, затем по полученным результатам определения содержания биомаркеров в ротовой жидкости пациента прогнозируют тактику лечения пациента. Способ обеспечивает значительное повышение точности, чувствительности дифференциальной экспресс-диагностики, достижение высокой вероятности выявления процессов доброкачественных и злокачественных новообразований в организме пациента как на ранних стадиях заболевания, так и на более поздних, а также значительное упрощение подготовки пациента в определенных временных рамках для забора и хранения диагностического материала. 2 з.п. ф-лы, 6 пр.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности, к патологической гистологии. Способ прижизненной диагностики латентного течения инфекционной анемии цыплят включает морфологическую оценку мазков крови и пунктата костного мозга больных цыплят. В мазках крови и пунктата костного мозга выявляют вирусиндуцированные апоптозные тельца, и при наличии в поле зрения 3-5 и более апоптозных телец ставят диагноз на инфекционную анемию цыплят. Изобретение обеспечивает снижение трудоемкости способа и сроков постановки диагноза, а также позволяет диагностировать скрытое течение инфекции. 9 табл., 3 пр., 6 ил.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, а именно к исследованию биомолекулярных взаимодействий и детектированию биомолекул с использованием поверхностного плазмонного резонанса. Описаны биологический сенсор, а также способ создания биологического сенсора с использованием тонких пленок на основе графена, оксида графена или однослойных или многослойных углеродных нанотрубок. Биологический сенсор состоит из подложки, металлической пленки, на поверхность которой нанесен промежуточный связующий слой, выполненный из тонкой пленки из графена, или тонкой пленки оксида графена, или тонкой пленки из углеродных нанотрубок. На поверхность промежуточного связующего слоя конформно и однородно адсорбирован биоспецифический слой. В качестве биоспецифического слоя может выступать слой молекул связывающего партнера анализируемого вещества или слой из комплекса биологических молекул, способных химически взаимодействовать с молекулами связывающего партнера и образовавших с ними комплекс. Также в качестве биоспецифического слоя может выступать слой гидрогеля, на который осаждены молекулы связывающего партнера и/или комплекс из молекул связывающего партнера и биологических молекул, которые могут образовывать химическую связь с молекулами связывающего партнера. Описанный способ получения биологического сенсора включает в себя стадии нанесения металлической пленки, промежуточного связующего слоя и биоспецифического слоя. Достигается высокая чувствительность биосенсора в сочетании с высокой биоспецифичностью; расширение спектра применения устройства; защита металлической пленки от воздействий внешней среды; возможность детектирования крупных биологических объектов. 2 н. и 25 з.п. ф-лы, 9 ил.
Наверх