Способ определения функциональной активности фактора в комплемента человека

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и описывает способ определения функциональной активности фактора B комплемента человека по его действию на клетки-мишени в бескальциевой среде, содержащей ионы магния, в присутствии реагента RB, являющегося сывороткой крови человека, избирательно лишенной активности фактора B, причем в качестве клеток-мишеней выбраны инфузории Tetrahymena pyriformis, суспензию которых вместе с испытуемым образцом, содержащим определяемый фактор B, и реагентом RB вносят в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту, при этом совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей фактора B комплемента в этих образцах. Изобретение обеспечивает более доступную мишень для действия комплемента, каковой являются инфузории Tetrahymena pyriformis. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности комплемента в сыворотке крови организма при диагностике ряда заболеваний. Активация комплемента может происходить по трем путям: классическим, альтернативным и лектиновым. Первые компоненты и факторы, участвующие в запуске соответствующего пути активации - разные, а мембраноатакующий концевой комплекс для всех путей один и тот же. Различаются также и условия среды: для запуска классического и лектинового пути требуются ионы кальция и магния. А для альтернативного пути - только магния. Главными отличительными факторами запуска активации по альтернативному пути являются факторы B и D. Эти факторы в других путях комплемента не участвуют.

Традиционный способ определения функциональной активности компонентов комплемента человека классического пути активации основан на способности комплемента лизировать в присутствии ионов кальция и магния клетки-мишени, каковыми являются эритроциты барана, сенсибилизированные кроличьими антителами к поверхностным антигенам эритроцитов. Для определения функциональной активности отдельных факторов альтернативного пути комплемента в тестируемом образце исследуют гемолиз эритроцитов кролика в присутствии ионов магния в бескальциевой среде, а также в присутствии реагента RX (где X - тестируемый фактор: B или D), характеризующийся отсутствием тестируемого фактора, но избыточным содержанием остальных компонентов, необходимых для осуществления лизиса. Размер фиксируемого гемолиза в этом случае определяется количеством функционально активного тестируемого фактора, находящегося в образце [1]. Для определения функциональной активности фактора B в качестве реагента RB используется пул не менее 10 сывороток здоровых доноров, прогретый при 50°C в течение 35 мин [1].

Недостатком гемолитического метода является необходимость наличия свежих эритроцитов кролика, что сопряжено с необходимостью содержания животного, а также зачастую индивидуального подбора подходящего животного-донора.

Преодолеть эти недостатки можно используя другую мишень для тестирования активности комплемента. Из литературы известно [2], что комплемент морской свинки способен обездвиживать инфузории Tetrahymena pyriformis. В работе, однако, не было изучено, какой из наблюдаемых эффектов: набухание микроорганизма, обездвиживание или дальнейший лизис, мог бы послужить в дальнейшем критерием для определения активности комплемента, а также какой из путей активации комплемента участвует в этом процессе. Кроме того, не было известно, можно ли такой подход использовать для определения активности отдельных факторов альтернативного пути активации комплемента. Получение необходимых для осуществления способа клеток Tetrahymena pyriformis существенно удобнее и дешевле, чем получение или приобретение эритроцитов кролика.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности фактора B комплемента человека с использованием доступной мишени для действия активного комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения функциональной активности фактора B комплемента человека по измерению его воздействия в присутствии реагента RB на инфузории Tetrahymena pyriformis с использованием прибора для биологических исследований БиоЛаТ-3 [3]. Было обнаружено, что при действии комплемента на инфузории в бескальциевой среде, специфичной для альтернативного пути, через определенный промежуток времени, зависящий от количества активного комплемента, начинается процесс обездвиживания инфузорий, протекающий со скоростью, также зависящей от количества активного комплемента. Скорость перехода подвижных инфузорий в неподвижные может быть использована для расчета количества функционально активного комплемента.

Способ определения предусматривает внесение в измерительные ячейки прибора суспензии инфузорий в буферном растворе, добавление в ячейки сыворотки крови в необходимом количестве как источника фактора B и реагента RB как источника остальных, кроме фактора B, компонентов комплемента и автоматический циклический подсчет оставшихся подвижными клеток во времени.

Метод расчета основан на определении константы скорости гибели клеток, которую удобно рассчитывать по тангенсу угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Величина константы скорости падения числа живых клеток, зависящая от количества активного фактора B комплемента, сравнивается с активностью фактора B комплемента в пуле не менее 10 сывороток здоровых людей, что выбирается в качестве стандарта. Тем самым достигается определение функциональной активности фактора B комплемента методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности фактора B комплемента человека с использованием доступной мишени для действия комплемента, каковой являются инфузории Tetrahymena pyriformis.

Пример 1. Определение функциональной активности фактора B комплемента человека. В измерительные ячейки прибора БиоЛаТ-3 вносят 200 мкл суспензии приблизительно 800 клеток инфузории Tetrahymena pyriformis в вероналовом буферном растворе, pH 7,4, содержащем 0,05 М NaCl, 0,83 мМ Mg2+ и 3,3 мМ этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N′,N′-тетрауксусную кислоту (ЭГТА), и 100 мкл того же буфера, содержащего от 5 до 20 мкл испытуемой пробы и от 5 до 15 мкл реагента RB, представляющего собой пул не менее 10 сывороток здоровых людей, прогретый при 50°C в течение 35 мин. С помощью прибора БиоЛаТ-3 и совмещенного с ним компьютера определяют число живых клеток в ячейках каждую минуту. На основании динамики падения числа живых клеток во времени рассчитывают константу скорости реакции первого порядка, определяя тангенс угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Калибровочную кривую получают, измеряя падение числа живых клеток во времени для пула сывороток, выбранного в качестве стандарта (рис.1). На рис.1, представлен калибровочный график зависимости константы скорости обездвиживания инфузорий от количества активного фактора B (R2=0.999). Содержание активного фактора B в стандартной сыворотке принято за 200 мкг/мл в соответствии со средним значением (93-380 мкг/мл) согласно литературным данным [4].

Литература

1. Козлов Л.В., Соляков Л.С. Возможность участия зимогенных форм факторов B и D в активации альтернативного пути системы комплемента. Биоорганическая химия. 1982. Т.8. №3. С.342-348.

2. Sinclair I.J.B. The role of complement in the immune reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology. 1958. V.1. P.291-299.

3. Черемных Е.Г., Покатаев А.С., Гридунова В.Н. Прибор для биологических исследований. Патент РФ 2361913 опубл. 20.07.09 Бюл. №20.

4. Лора Ш. Фремю-Бачи В. Атипичный гемолитико-уремический синдром. Нефрология. 2012. Т.16. С.16-44. (Loirat С., Frémeaux-Bacchi V. Atypical hemolytic uremic syndrome. Orphanet J. Rare Dis. 2011. Sep 8; 6:60. doi: 10.1186/1750-1172-6-60).

1. Способ определения функциональной активности фактора B комплемента человека по его действию на клетки-мишени в бескальциевой среде, содержащей ионы магния, в присутствии реагента RB, являющегося сывороткой крови человека, избирательно лишенной активности фактора B, отличающийся тем, что в качестве клеток-мишеней выбраны инфузории Tetrahymena pyriformis, суспензию которых вместе с испытуемым образцом, содержащим определяемый фактор B, и реагентом RB вносят в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту, при этом совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей фактора B комплемента в этих образцах.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что рассчитывают тангенс угла наклона зависимости логарифма числа живых клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток, который равен константе скорости процесса и прямо пропорционален активности фактора B комплемента, и сравнивают с константой скорости процесса для стандартного образца, представляющего собой пул сывороток от 10 доноров крови.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для снижения заболеваемости респираторными инфекциями детей младшего школьного возраста.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования внутрибольничного инфицирования ребенка возбудителями кишечных инфекций.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов, используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено полностью человеческое моноклональное антитело, которое связывает инсулиноподобный фактор роста-II (IGF-II) и имеет перекрестную реактивность к IGF-I, а также его антигенсвязывающий фрагмент.

Представленная группа изобретений касается слитых белков, нуклеиновых кислот, кодирующих такие белки, экспрессирующей кассеты, обеспечивающей экспрессию нуклеиновой кислоты, вектора, включающего такую кассету, способа диагностики in vitro-боррелиоза, набора для такой диагностики, в которых используют упомянутые белки, а также вакцинной композиции для профилактики боррелиоза, включающей такие белки.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложено устройство для забора нуклеиновой кислоты, применение устройства для забора нуклеиновой кислоты, набор для амплификации нуклеиновой кислоты, а также способ амплификации нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, способное связываться с амплифицированным рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и с усеченным вариантом EGFR - de2-7 EGFR, и охарактеризованное последовательностями вариабельных доменов.

Группа изобретений относится к области медицины. Предложены способы диагностики хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и проведения различия между стадией I/II и III/IV ХОБЛ у человека, включающие определение количества белков теплового шока 27 (HSP27), 70 (HSP70) и 90 альфа (HSP90 альфа) и определение количества рецептора 4 интерлейкина-1 (ST2) или гистон-связанных-ДНК-фрагментов в образце.
Изобретение относится к лабораторной диагностике, а именно к клинической иммунологии. Cпособ определения стабилизации C3-конвертазы классического пути активации комплемента человека осуществляется путем проведения реакции лизиса эритроцитов барана 0,8% сывороткой крови человека в течение 10 мин.
Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для определения атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛПНП).
Изобретение относится к области медицины, в частности к терапии, кардиологии, и касается способа прогнозирования риска развития критического стеноза в коронарных артериях у пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС). Сущность способа: в сыворотке крови пациента определяют концентрацию матриксной металлопротеиназы - 9 (ММП-9) и/или С-терминального пропептида проколлагена 1 типа (PICP). При значении ММП-9 более 101,8 нг/мл и/или PICP 195,6 нг/мл прогнозируют неблагоприятное течение ИБС, менее этих значений - благоприятное течение без формирования в коронарных артериях критических стенозов. Применение способа обеспечивает повышение точности и специфичности способа. 4 пр.

Изобретение относится к биологи и медицине, а именно к иммуноанализу, в частности к электрохимическим способам определения содержания вирусов/антигенов вирусов кори. Изобретение включает образование иммунокомплекса по схеме «сэндвич» между антителами и вирусом/антигеном вируса кори с последующим присоединением конъюгата антител с сигналообразующей меткой, причем в качестве сигналообразующей метки используют магнитные нанокомпозитные частицы, которые перед стадией образования иммунокомплекса получают путем создания на поверхности магнитных наночастиц оксида переходного металла оксидкремниевого покрытия с последующим получением конъюгата с антителами, при этом формирование иммунокомплекса осуществляют путем его концентрирования на твердофазном химически инертном носителе за счет воздействия магнитным полем с последующим изъятием этого иммунокомплекса из среды, сформированной на носителе, а определение наличия и концентрации вируса/антигена вируса осуществляют по сигналу, генерируемому ионами переходного металла, образующимися в результате кислотной обработки иммунокомплекса. Настоящее изобретение направлено на упрощение процесса анализа, увеличение экспрессности и воспроизводимости. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, репродуктологии, и может быть использовано для оптимизации программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) с учетом молекулярно-генетических характеристик гамет при селективном переносе эмбрионов (ПЭ). Способ заключается в том, что на основании данных ПЦР-амплификации исследуемых и референсных генов, полученных в день трансвагинальной пункции яичников (ТВП) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), об уровне экспрессии мРНК генов факторов роста (AREG, EREG, IGF1, IGFBP4), ингибитора апоптоза (BIRC5) в клетках фолликулярной жидкости, соотношения уровня экспрессии мРНК протаминов (PRM2:PRM1) в сперме получают значения пороговых циклов (Ср) накопления продуктов реакции, вычисляют значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) по формуле, и если значение КЛДФ>0,22, делают заключение о благоприятном прогнозе наступления беременности. Изобретение позволяет выбирать эмбрион, имеющий высокий потенциал к имплантации, с целью снижения частоты многоплодных беременностей, а также прогнозировать наступление беременности в программе ЭКО при селективном переносе эмбрионов. 1 пр., 3 ил.

Данное изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложена гибридомная клеточная линия FP12H3-C2, депонированная под номером DSM ACC2750, продуцирующая антитело против бета-амилоида. Рассмотрены способы получения антитела, в том числе гуманизированного антитела, с использованием гибридомной линии по изобретению, а также способы диагностики ассоциированного с бета-амилоидом заболевания или нарушения у пациента или предрасположенности к такому заболеванию или нарушению, способ определения степени поражения ткани амилоидогенными бляшками, способ мониторинга минимальных остаточных признаков заболевания у пациента после лечения антителом или его активным фрагментом, способ прогнозирования чувствительности пациента, получающего лечение антителом или его активным фрагментом. Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в диагностике и терапии связанных с бета-амилоидом болезней, таких как болезнь Альцгеймера. 8 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл., 17 пр.
Изобретение относится к медицине, в частности к гигиене труда, профпатологии и аллергологии. Определяют анамнестические данные, клинические признаки, стаж работы в условиях аллергоопасных производственных факторов, «симптом элиминации», наличие симптомов заболевания непосредственно в период работы и ухудшения состояния после возвращения во вредные условия, концентрацию общего IgE в сыворотке крови. Оценивают каждый признак в баллах. Полученные баллы суммируют и в зависимости от полученной суммы баллов прогнозируют низкую степень риска развития профессиональных аллергодерматозов, среднюю степень риска или высокую степень риска. Способ повышает точность прогноза за счет оценки значимых показателей. 3 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования риска невынашивания беременности. Способ состоит в выделении ДНК из лейкоцитов периферической крови пациентки и проведении генотипирования. При выявлении генотипов C/G и G/G полиморфизма rs1052133 гена 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (OGG1) прогнозируют высокий риск невынашивания беременности. Изобретение обеспечивает выявление специфических генетических маркеров репродуктивных потерь с последующим использованием в комплексе предгравидарного обследования. 1 ил., 4 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно онкологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития и раннего выявления злокачественных новообразований. Для этого в периферической крови человека определяют абсолютное содержание естественных киллеров (CD16+ лимфоцитов) и концентрацию растворимого рецептора апоптоза (sAPO-1). При содержании CD16+ более 0,5×109 кл/л и концентрации sAPO-1 более 4000 пг/мл прогнозируют риск развития злокачественных новообразований. Использование данного способа позволяет выявлять злокачественные новообразования на ранних стадиях развития с использованием иммунологических методов. 4 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и отоларингологии, и касается способа прогнозирования затяжного течения острого ринофарингита при реактивации хронической цитомегаловирусной инфекции у женщин во втором триместре беременности. Сущность способа: определяют титр антител IgM к цитомегаловирусу (ЦМВ) и титры антител IgG к ЦМВ в парных сыворотках крови в баллах (1 балл - титр антител IgM к ЦМВ 1:200 и титры антител IgG к ЦМВ 1:200-1:400 при индексе авидности IgG к ЦМВ более 65% в парных сыворотках крови; 2 балла - титр антител IgM к ЦМВ 1:400 и титры антител IgG к ЦМВ 1:400-1:800 при индексе авидности IgG к ЦМВ более 65% в парных сыворотках крови; 3 балла - титр антител IgM к ЦМВ 1:400 и титры антител IgG к ЦМВ 1:200-1:800 при индексе авидности IgG к ЦМВ более 65% в парных сыворотках крови) (А), концентрацию интерферона-γ (пг/мл) в сыворотке крови в период разгара заболевания (В). Затем с помощью дискриминантного уравнения, включающего определяемые показатели, прогнозируют затяжное течение острого ринофарингита D. При D меньше граничного значения дискриминантной функции прогнозируют отсутствие затяжного течения острого ринофарингита у женщин при реактивации хронической цитомегаловирусной инфекции во втором триместре беременности. При D равной или больше граничного значения прогнозируют развитие затяжного течения острого ринофарингита у женщин при реактивации хронической цитомегаловирусной инфекции во втором триместре беременности. Изобретение обеспечивает прогнозирование затяжного течения острого ринофарингита при реактивации хронической цитомегаловирусной инфекции у женщин во втором триместре беременности. Вероятность правильного прогноза составляет 81,1%. 2 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и может быть использовано при оценке риска возникновения побочных эффектов на фоне применения гормональной контрацепции - этинилэстрадиол+дроспиренон. Способ заключается в том, что перед назначением контрацепции определяют полиморфный локус rs936306 гена CYP19A1. При наличии генотипа G/A диагностируют транзиторные нарушения в первые 6-6,5 месяцев приема контрацепции, а при наличии генотипа А/А диагностируют побочные эффекты, начиная с 7 месяца применения контрацептивов. Способ изобретения позволяет снизить развитие побочных эффектов от гормональной контрацепции, прогнозирования переносимости и безопасности гормональных контрацептивов и возможного влияния на функцию печени, систему гемостаза и липидный спектр крови. 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к репродуктивной иммунологии и гинекологии, и может быть использовано для диагностики иммунологической формы бесплодия у пар с бесплодием неуточненного генеза. Для этого у женщин с первичным и вторичным бесплодием неуточненного генеза оценивают относительное количество CD4+CD25+CD127- Т-клеток, которые определяют однократно в периимплантационном периоде в эндометриальной ткани. При содержании этих клеток менее 7,5% диагностируют иммунологическое бесплодие. Использование данного способа позволяет рассматривать дефицит CD4+CD25+CD127- Т-клеток как маркер иммунологической формы бесплодия как у женщин с привычным невынашиванием, так и с первичным бесплодием. 2 з.п. ф-лы, 3 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и описывает способ определения функциональной активности фактора B комплемента человека по его действию на клетки-мишени в бескальциевой среде, содержащей ионы магния, в присутствии реагента RB, являющегося сывороткой крови человека, избирательно лишенной активности фактора B, причем в качестве клеток-мишеней выбраны инфузории Tetrahymena pyriformis, суспензию которых вместе с испытуемым образцом, содержащим определяемый фактор B, и реагентом RB вносят в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту, при этом совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей фактора B комплемента в этих образцах. Изобретение обеспечивает более доступную мишень для действия комплемента, каковой являются инфузории Tetrahymena pyriformis. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

Наверх