Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения при селективном переносе эмбрионов путем оценки молекулярно-генетического профиля гамет с помощью пцр-рв



Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения при селективном переносе эмбрионов путем оценки молекулярно-генетического профиля гамет с помощью пцр-рв
Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения при селективном переносе эмбрионов путем оценки молекулярно-генетического профиля гамет с помощью пцр-рв
Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения при селективном переносе эмбрионов путем оценки молекулярно-генетического профиля гамет с помощью пцр-рв
Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения при селективном переносе эмбрионов путем оценки молекулярно-генетического профиля гамет с помощью пцр-рв
Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения при селективном переносе эмбрионов путем оценки молекулярно-генетического профиля гамет с помощью пцр-рв

 


Владельцы патента RU 2550965:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, репродуктологии, и может быть использовано для оптимизации программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) с учетом молекулярно-генетических характеристик гамет при селективном переносе эмбрионов (ПЭ). Способ заключается в том, что на основании данных ПЦР-амплификации исследуемых и референсных генов, полученных в день трансвагинальной пункции яичников (ТВП) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), об уровне экспрессии мРНК генов факторов роста (AREG, EREG, IGF1, IGFBP4), ингибитора апоптоза (BIRC5) в клетках фолликулярной жидкости, соотношения уровня экспрессии мРНК протаминов (PRM2:PRM1) в сперме получают значения пороговых циклов (Ср) накопления продуктов реакции, вычисляют значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) по формуле, и если значение КЛДФ>0,22, делают заключение о благоприятном прогнозе наступления беременности. Изобретение позволяет выбирать эмбрион, имеющий высокий потенциал к имплантации, с целью снижения частоты многоплодных беременностей, а также прогнозировать наступление беременности в программе ЭКО при селективном переносе эмбрионов. 1 пр., 3 ил.

 

1. Область техники

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, репродуктологии, и может быть использовано для оптимизации программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) при селективном переносе эмбрионов (ПЭ), основываясь на данных о молекулярно-генетических характеристиках гамет.

2. Уровень техники

Внедрение в клиническую репродуктологию стратегии селективного переноса одного эмбриона (elective single embryo transfer, eSET) в сочетании с современными методами выбора эмбриона является одним из ведущих факторов успешного проведения лечения бесплодия методом ЭКО и ПЭ [2, 3, 5, 16, 20].

Задачей настоящего изобретения является оценка транскриптомного профиля гамет с целью оптимизации выбора эмбриона для селективного переноса и прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения.

Эта задача решается путем дополнения морфологической оценки гамет и эмбрионов данными молекулярно-генетического исследования уровня экспрессии мРНК генов факторов роста (AREG, EREG, IGF1, IGFBP4), ингибитора апоптоза (BIRC5) в клетках фолликулярной жидкости, соотношения уровня экспрессии мРНК протаминов (PRM2:PRM1) в сперме, полученной в день трансвагинальной пункции яичников и использованной для оплодотворения, с применением метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ), что позволяет неинвазивно и комплексно подходить к выбору эмбриона, имеющего максимальный шанс к имплантации в программе ЭКО и ПЭ, принимая во внимание исходный статус гамет и клинико-анамнестические данные супружеских пар с бесплодием.

Общепринятым способом определения качества гамет и эмбрионов в условиях in vitro является морфологическая оценка, которая, однако, не всегда позволяет объективно судить об их полноценности и прогнозе наступления беременности [1, 10, 11, 13]. С целью селективного переноса эмбрионов применяются следующие методы оценки качества эмбрионов: инвазивные (преимплантационная генетическая диагностика, скрининг); неинвазивные (системы непрерывного наблюдения за развитием эмбрионов (time-lapse embryo selection), протеомный и секретомный анализ сред культивирования эмбрионов [3, 4, 8, 12, 15, 21, 23].

Комплексная оценка женских и мужских гамет с целью селективного переноса эмбрионов ранее не выполнялась.

Ранее оценка ооцита проводилась только по морфологическим характеристикам или применялся инвазивный метод косвенной оценки по генетической диагностике полярных телец [1, 10].

Принимая во внимание актуальность описанной проблемы, необходимость выявления объективных маркеров качества эмбриона и гамет, в литературе имеются предшествующие данному исследованию аналоги. Так, в патенте группы авторов N.M. Orsi, N. Gopichandran, S. Barber, V. Sharma, J. J. Walker Британского Университета и Образовательного Госпиталя (Leeds (University of Leeds, The Leeds Teaching Hospitals NHSTrust) «Маркеры полноценности ооцита» (Markers of oocyte viability, №PCT/GB2009/050339, 07.04.2009) задекларировано использование иммуноферментного анализа для определения концентрации панели 50 цитокинов, вовлеченных в созревание ооцита, в индивидуальных образцах фолликулярной жидкости в программе ЭКО. Учитывая трудоемкость, большой объем необходимых исследований, высокую стоимость расходных материалов, предложенный нами метод имеет ряд преимуществ по сравнению с описанным аналогом.

В аналоге изобретения группы авторов М.-А. Sirard, A.-L. Nivet, A. Bunel, R. Labrecque Канадского Университета Laval (Universite Laval) «Яичниковые маркеры зрелости фолликула и их использование» (Ovarian markers of follicular maturity and uses thereof, №PCT/CA2012/000697, 24.07.2012) использовалась оценка уровня транскрипции нескольких, отличных от предложенных нами, молекул, связанных с процессом фолликулогенеза на разных стадиях созревания в программе IVM (in vitro maturation).

В запатентованном исследовании группы авторов S. Hammamah, S. Assou Французского Университета NSERM (Institute National De La Sante et De La Recherche Madicale) «Методы выбора полноценных ооцитов и эмбрионов с высоким имплантационным потенциалом» (Methods for selecting competent oocytes and competent embryos with high potential for pregnancy outcome, №PCT/EP2011/070990, 24.11.2011), использовалась оценка уровня экспрессии микро-РНК в кумулюсных клетках ооцита и эмбриона.

В исследовании соавторов М. Conti, A.M. Zamah, J.Chen Калифорнийского Университета (The Regents of the University of California) «Неинвазивные методы для оценки качества ооцита в программе ЭКО» (Noninvasive methods for assessing oocyte quality for in vitro fertilization, №PCT/US2012/071417, 21.12.2012) производилась оценка уровня экспрессии продуктов трансляции в средах для культивирования ооцита на моделях мышей с использованием методов оценки микроокружения, иммуноферментного анализа, что отличается от предлагаемого нами способа используемым методом протеомного анализа.

Во всех представленных аналогах не производился учет отцовского фактора (paternal contribution) [7, 14].

Диагностика качества сперматозоидов по критериям ВОЗ (2010 г.) или строгим критериям Крюгера, рекомендованным в 1999 г, не позволяет выявить ультраструктурные нарушения компактизации спермального хроматина, приводящие к нарушению оплодотворения или остановке развития эмбрионов на ранних этапах дробления или прерыванию беременности на ранних сроках [6, 17, 18, 19, 22].

Поиск предикторов качества спермы активно ведется в течение последних десятилетий. В 2006 г. исследователями D.D.J. Krawets, A. Stephen, D. Miller из Университета США Wayne State запатентован метод «Генетического тестирования для определения мужского фактора бесплодия» (Genetic testing for male factor infertility, №11357423, 21.02. 2006), в котором путем анализа микроокружения исследуются спермальные гены, ответственные за мужское бесплодие.

В качестве наиболее близкого аналога части нашего изобретения может быть представлено исследование группы авторов K. Steger, A. Paradowska, В. Barmann из Германского Университета Justus-Liebig-Universitat Gieben «Метод и быстрый тест для определния фертильности спермы» (Method and rapid test for determining the fertility of sperm, №PCT/EP2011/057942, 17.05.2011), в котором путем оценки концентрации протаминов и их соотношения оценивается качество спермы, при этом отсутствуют указания на прогнозирование наступления беременности, качество эмбриона, используется трудоемкий, длительный, дорогостоящий метод по сравнению с предлагаемым нами способом.

3. Описание изобретения

Предложен способ прогнозирования наступления беременности в программе ЭКО и селективном переносе эмбрионов путем комплексной оценки транскриптомного профиля гамет с помощью ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) путем оценки уровня представленности транскриптов ряда генов в клетках фолликулярной жидкости и спермы: в частности генов ростовых факторов (AREG, EREG, IGF1, IGFBP4), маркера апоптоза (BIRC5) в клетках фолликулярной жидкости, полученных в день трансвагинальной пункции яичников, а также соотношения уровня экспрессии мРНК протаминов (PRM2:PRM1) в сперме, использованной для оплодотворения.

Для оценки уровня представленности транскриптов (мРНК) исследуемых генов в мазках используются методы обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с регистрацией накопления продуктов реакции в режиме «реального времени».

Изобретение получено на основании результатов лечения и статистического анализа 104 супружеских пар с трубно-перитонеальным и/или мужским фактором бесплодия, имеющих не более двух неэффективных циклов ЭКО и ПЭ в анамнезе, в которых возраст пациенток не превышал 35 лет, женщины имели нормальный овариальный резерв, фертильную и/или субфертильную сперму супруга.

В зависимости от исхода программы ЭКО все пациентки были разделены на 2 группы. К I группе, составившей группу контроля, были отнесены пациенты с благополучным результатом лечения бесплодия - рождением здорового ребенка (n=24). Среди II группы неуспешного завершения ЭКО и ПЭ было выделено три подгруппы. У пациентов IIа группы в результате применения ВРТ наступила беременность, но закончилась самопроизвольным прерыванием беременности ранних сроков (до 11 недель) (n=13). Группу IIb составили пациенты с биохимической беременностью, не подтвержденной далее ультразвуковыми данными, при которой на 14 день после переноса эмбрионов уровень β-субъединицы хорионического гонадотропина (β-ХГ) составлял не менее 30 мМЕ/мл, т.н. «преэмбрионические потери» (n=24). В IIс группу вошли женщины с отрицательным результатом, у которых уровень β-ХГ был менее 20 мМЕ/мл (n=43).

Представленные данные (фиг. 1) демонстрируют отличия между группами по уровню экспрессии мРНК генов изучаемых факторов в фолликулярной жидкости и сперме при различных исходах программы ЭКО и ПЭ.

На основании экспериментальных данных при сравнении групп женщин с наступившей беременностью и неблагоприятным завершением программы ЭКО и ПЭ были получены и проанализированы результаты с применением методов многофакторного статистического анализа (дискриминантный анализ), выбрана линейная функция, позволяющая прогнозировать наступление беременности для каждой супружеской пары.

Уравнение канонической линейной дискриминантной функции имеет вид:

где [IGF1], [IGFBP4], [EREG], [BIRC5], [AREG] - относительный уровень представленности мРНК соответствующих генов в клетках фолликулярной жидкости,

[PRM2:PRM1] - отношение уровней экспрессии мРНК соответствующих генов в сперме.

Относительный уровень экспрессии мРНК исследуемых генов вычисляется по формуле 2:

[I]=2^(NF-Cpi) (формула 2), где

где [1] - относительный уровень представленности мРНК исследуемого гена,

Cpi - значение порогового цикла соответствующего исследуемого гена в образце, определяемого автоматически программным обеспечением прибора;

NF - фактор нормировки, который вычисляется по формуле 3:

где Cp - значения пороговых циклов соответствующих референсных генов в образце, определяемых автоматически программным обеспечением прибора.

Отношение уровней экспрессии мРНК генов PRM2 и PRM1 в сперме вычисляется по формуле 4:

[PRM2:PRM1]=2^(Cp(prm1)-Cp(prm2) (формула 4), где

где Cp - значения пороговых циклов соответствующего протамина в образце.

Диагностическая возможность предложенной модели оценивалась с использованием ROC-анализа. Согласно фиг. 2, площадь под кривой (AUC) составила AUC=0,853±0,051 (95% ДИ 0,752-0,953, p<0,0001), что позволило характеризовать данную модель согласно экспертной оценке как очень хорошую. В качестве порога отсечения (точка cut off) выбрано значение функции, соответствующее максимальной сумме чувствительности и специфичности. В результате апостериорной классификации 80,6% (КЛДФ) исходных сгруппированных наблюдений классифицировано правильно. Получены значения точки cut off для КЛДФ1 - 0,22 для разделения супружеских пар с положительным и отрицательным исходом ЭКО и ПЭ.

Превышение значения канонической линейной дискриминантной функции относительно точки cut off классифицировалось как наступление беременности в результате ЭКО и ПЭ. Чувствительность предложенной модели в области порогового значения составила 83,3%, специфичность 81,4%, положительная прогностическая ценность 80,0%, отрицательная прогностическая ценность 87,5%.

Ограничение метода

Из исследования были исключены женщины с противопоказаниями для проведения программы ЭКО и вынашивания беременности, наличием распространенных форм наружного генитального эндометриоза, синдрома поликистозных яичников, резекции яичников в анамнезе, хронического эндометрита, пациенты с выраженными изменениями спермограммы.

4. Реализация изобретения

В программе ЭКО у супружеских пар, сопоставимых между собой по клинико-анамнестическим, лабораторным параметрам после стимуляции суперовуляции в день трансвагинальной пункции яичников проводили аспирацию фолликулярной жидкости (n=104) индивидуально с промывкой иглы после каждого фолликула, в маркированные пробирки без гепарина. После идентификации и извлечения ооцит-кумулюсных комплексов образцов фолликулярной жидкости проводили выделение клеток путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 10 минут с последующим применением промывочных буферных растворов, что позволило снизить контаминацию клетками крови образцов фолликулярной жидкости. Далее в асептических условиях производилось ресуспендирование полученных клеток в 300 мкл 3 мМ раствора гуанидинтиацианата для сохранения рибонуклеиновой кислоты (РНК), выполнялось выделение РНК методом фенольной депротеинизации с последующим осаждением РНК изопропанолом и отмывками промывочными растворами. Объем образцов после выделения составлял 50 мкл. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) ставили в объеме 40 мкл (для реакции брали 33 мкл образца РНК) в течение 30 минут при температуре 40°C с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95°C в течение 5 минут. Для увеличения объемов образцов после ОТ и с целью предотвращения деградации ДНК копии ДНК разводили в 5 раз в ТЕ-буфере (Tris (гидрокиметиламинометан) и Этилендиаминтетрауксусная кислота). Праймеры и зонды для полимеразной цепной реакции (ПЦР) были подобраны с учетом структуры генов таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК исследуемых и референсных генов. Реакции амплификации целевых и референсных генов ставили в разных пробирках в двух повторах. В качестве референсных генов использовались: ген гипоксантилфосфорибозилтрансферазы-1 (HPRT1), ген ТАТА-бокс-связывающего протеина (ТВР), ген глюкуронидазы бета (GUSB) и ген β-2 микроглобулина (В2М). Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен «горячий старт» с применением парафина. Амплификацию осуществляли в режиме «реального времени» в объеме 35 мкл по следующей программе: 1 цикл - 80°C 30 сек, 94°C 1 мин; 50 циклов - 94°C 10 сек, 64°C 20 сек, использовали прибор «ДТ-964» производства ООО «НПО ДНК-Технология». Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 64°C. Уровень экспрессии мРНК измеряли в относительных единицах, определяемых методом сравнения индикаторных циклов (ΔΔCq) с нормировкой на экспрессию референсных генов и значение медианы (Me) в группе успешного исхода программы ВРТ. Аналогично описанной методике при помощи ОТ-ПЦР проводилось изучение уровня экспрессии мРНК генов протаминов {PRM-1, PRM-2) в 79 образцах спермы, полученных в день ТВП и использованных для оплодотворения.

Проводилась программа ЭКО и ПЭ со стимуляцией суперовуляции по стандартным протоколам. Оплодотворение проводилось методами стандартного ЭКО или с помощью ИКСИ (при наличии субфертильных отклонений спермограммы в день ТВП от нормы по критериям ВОЗ, 2010 г.) в равной доле (p=0,833) [22]. Культивирование эмбрионов осуществлялось в индивидуальных лунках четырехлуночного планшета в соответствии с номером образца фолликулярной жидкости. Выбор эмбриона осуществлялся на основании морфологической оценки. Большинство полученных эмбрионов имело хорошую морфологическую оценку (по D.K. Gardner, W.B. Schoolcraft, 1999), что позволило в половине случаев произвести селективный перенос одного или двух эмбрионов на стадии бластоцисты [9].

Пример использования изобретения

Производилась оценка транскриптомного профиля мужских и женских гамет, сформировавших в результате проведения оплодотворения in vitro 21 эмбрион. Выполнялась общепринятая морфологическая оценка полученных эмбрионов. Перенос эмбрионов производился на основании комплексной морфологической и предлагаемой нами молекулярно-генетической оценки гамет. Оценена эффективность программы ЭКО (фиг. 3).

Разработанная нами математическая модель позволяет с диагностической эффективностью выше 80,0% классифицировать супружеские пары по исходам ЭКО и ПЭ в зависимости от совокупных данных по молекулярно-генетическому профилю фолликулярной жидкости и спермы в день трансвагинальной пункции яичников (ТВП) и может быть использована в качестве дополнительного критерия объективной оценки качества гамет, что особенно важно при проведении селективного переноса одного эмбриона.

В данной работе была продемонстрирована важность комбинации не только морфологической и молекулярно-генетической оценки качества гамет и эмбрионов, но и сочетанного анализа «материнского» и «отцовского вклада» в развитие эмбриона. Нами произведена попытка объяснения дифференцировки качества ооцитов и сперматозоидов, реализующихся в изменении потенциала развития эмбрионов, с позиции функционирования системы ростовых факторов в ооцит-кумулюсном комплексе (для ооцита) и структурной целостности спермального хроматина за счет протаминов на основании оценки профиля мРНК генов, вовлеченных в эти механизмы.

Список литературы

1. Назаренко Т.А. Стимуляция функции яичников. - М.: Медпресс - информ, 2008. - 272 с.

2. Тишкевич О.Л. Эффективность ЭКО и частота многоплодной беременности в зависимости от числа и качества переносимых эмбрионов у женщин разного возраста. // Проблемы репродукции. - 2008. - Т. 2, N. 2. - С. 8-12.

3. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии // Иммунология. - 1997. - N 5. - с. 7-14.

4. Assou S. А non - invasive test for assessing embryo by gene expression profiles of human cells: a proof of concept study. // Molecular Hum. Reprod. 2008. - Vol. 14, N. 12. - P. 711-719.

5. Assisted reproductive technology in Europe, 2006: results generated fron European registers by ESHRE / J. de Mouzon [et al.] // Hum. Reprod. - 2010. - Vol. 25 - P. 1851-1862.

6. Dadoune J. - P. Spermatozoal RNAs: What About Their Functions? // Microscopy research and technique. - 2009. - Vol.72. - P. 536 -551.

7. Douglas Т. C, Hammoud S. S. The human sperm epigenome and its potential role in embryonic development // Molecular Hum. Reprod. - 2010. - Vol. 16, N. 1. - P. 37-47.

8. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics / A. Revelli [et al.] // Reproductive Biology and Endocrinology. - 2009. - Vol. 7, N. 40. - P. 1-13.

9. Gardner D.K., Schoolcraft W.B. In vitro culture of human blastocysts. - Jansen R., Mortimer D. (eds.) Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond. - Carnforth: Parthenon Press, 1999. - P. 378-388.

10. Single embryo transfer / J.M.R. Gerris [et al.]. - Cambridge University Press, 2009. - 305p.

11. Huang Z., Wells D. The human oocyte and cumulus cells relationship: new insights from the cumulus cell transcriptome // Molecular Hum. Reprod. - 2010. -Vol. 16, N. 10. - P. 715-725.

12. Human cumulus cells as biomarkers for embryo and pregnancy outcomes / S. Assou [et al.] // Molecular Hum. Reprod. - 2010. - Vol. 16, N. 8. - P. 531-538.

13. Kempisty В., Jedrzejczak P., Jagodzinski P.P. Structure and role of protamines 1 and 2 in spermatogenesis and male infertility // Ginekol Pol. - 2006. - Vol. 77. - P. 238-245

14. Krawetz S.A. Paternal contribution: new insights and future challenges // Nature Reviews: Genetics. - 2005. - Vol. 6. - P. 633-642.

15. Lindeberg M. Molecular and morphological studies of folliculogenesis, oocyte maturation and embryogenesis in humans: thesis for doctoral degree (PhD). - KarolinskaInstitutet. - 2008. - P. 69.

16.Maheshwari A., Griffiths S., Bhattacharya S. Global variations in the uptake of single embryo transfer // Hum. Reprod. Update. - 2011. - Vol. 17, N. 1. - P. 107-120.

17. Miller D., Brinkworth M., lies D. Paternal DNA packaging in spermatozoa: more than the sum of its parts? // DNA, histones, protamines and epigenetics Reproduction. - 2010. - Vol. 139. -P. 287-301.

18. O′Flynn K.L., O′Brien B.A., Varghese A.C., and Agarwal A. The genetic causes of male factor infertility: A review // Fertil. Steril. - 2010. - Vol. 93, N. 1. - P. 1-12.

19. Carreau S. RNA dynamics of fertile and infertile spermatozoa. // Molecular Reproduction & Development. - 2010. - Vol. 77. - P.158-166.

20. Scott L. The biological basis of non - invasive strategies for selection of human oocytes and embryos / [et al.] // Hum. Reprod Update. - 2003. - Vol.9? N. 3. - P. 237-249.

21. The differential transcriptome and ontology profiles of floating and cumulus granulosa cells in stimulated human antral follicles / S. Koks [et al.] // Molecular Hum. Reprod. - 2010. - Vol. 16, N. 4. - P. 229-240.

22. World Health Organization reference values for human semen characteristics / T.G. Cooper [et al.] // Hum. Reprod. Update. - 2010. - Vol. 14, N. 5. - P. 431-446.

23. Youle R.J., Strasser A. The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2008. - Vol. 9, N. 1. - P.47-59.

Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения при селективном переносе эмбрионов путем оценки молекулярно-генетического профиля гамет с помощью ПЦР-РВ, отличающийся тем, что на основании данных ПЦР-амплификации исследуемых и референсных генов, полученных в день трансвагинальной пункции яичников (ТВП) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), об уровне экспрессии мРНК генов факторов роста (AREG, EREG, IGF1, IGFBP-4), ингибитора апоптоза (BIRC5) в клетках фолликулярной жидкости, соотношения уровня экспрессии мРНК протаминов (PRM2:PRM1) в сперме получают значения пороговых циклов (Ср) накопления продуктов реакции, вычисляют значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) по формуле

если значение КЛДФ>0,22, делают заключение о благоприятном прогнозе наступления беременности.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биологи и медицине, а именно к иммуноанализу, в частности к электрохимическим способам определения содержания вирусов/антигенов вирусов кори.
Изобретение относится к области медицины, в частности к терапии, кардиологии, и касается способа прогнозирования риска развития критического стеноза в коронарных артериях у пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС).

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и описывает способ определения функциональной активности фактора B комплемента человека по его действию на клетки-мишени в бескальциевой среде, содержащей ионы магния, в присутствии реагента RB, являющегося сывороткой крови человека, избирательно лишенной активности фактора B, причем в качестве клеток-мишеней выбраны инфузории Tetrahymena pyriformis, суспензию которых вместе с испытуемым образцом, содержащим определяемый фактор B, и реагентом RB вносят в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту, при этом совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей фактора B комплемента в этих образцах.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для снижения заболеваемости респираторными инфекциями детей младшего школьного возраста.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования внутрибольничного инфицирования ребенка возбудителями кишечных инфекций.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов, используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено полностью человеческое моноклональное антитело, которое связывает инсулиноподобный фактор роста-II (IGF-II) и имеет перекрестную реактивность к IGF-I, а также его антигенсвязывающий фрагмент.

Представленная группа изобретений касается слитых белков, нуклеиновых кислот, кодирующих такие белки, экспрессирующей кассеты, обеспечивающей экспрессию нуклеиновой кислоты, вектора, включающего такую кассету, способа диагностики in vitro-боррелиоза, набора для такой диагностики, в которых используют упомянутые белки, а также вакцинной композиции для профилактики боррелиоза, включающей такие белки.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложено устройство для забора нуклеиновой кислоты, применение устройства для забора нуклеиновой кислоты, набор для амплификации нуклеиновой кислоты, а также способ амплификации нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, способное связываться с амплифицированным рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и с усеченным вариантом EGFR - de2-7 EGFR, и охарактеризованное последовательностями вариабельных доменов.

Данное изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложена гибридомная клеточная линия FP12H3-C2, депонированная под номером DSM ACC2750, продуцирующая антитело против бета-амилоида. Рассмотрены способы получения антитела, в том числе гуманизированного антитела, с использованием гибридомной линии по изобретению, а также способы диагностики ассоциированного с бета-амилоидом заболевания или нарушения у пациента или предрасположенности к такому заболеванию или нарушению, способ определения степени поражения ткани амилоидогенными бляшками, способ мониторинга минимальных остаточных признаков заболевания у пациента после лечения антителом или его активным фрагментом, способ прогнозирования чувствительности пациента, получающего лечение антителом или его активным фрагментом. Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в диагностике и терапии связанных с бета-амилоидом болезней, таких как болезнь Альцгеймера. 8 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл., 17 пр.
Изобретение относится к медицине, в частности к гигиене труда, профпатологии и аллергологии. Определяют анамнестические данные, клинические признаки, стаж работы в условиях аллергоопасных производственных факторов, «симптом элиминации», наличие симптомов заболевания непосредственно в период работы и ухудшения состояния после возвращения во вредные условия, концентрацию общего IgE в сыворотке крови. Оценивают каждый признак в баллах. Полученные баллы суммируют и в зависимости от полученной суммы баллов прогнозируют низкую степень риска развития профессиональных аллергодерматозов, среднюю степень риска или высокую степень риска. Способ повышает точность прогноза за счет оценки значимых показателей. 3 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования риска невынашивания беременности. Способ состоит в выделении ДНК из лейкоцитов периферической крови пациентки и проведении генотипирования. При выявлении генотипов C/G и G/G полиморфизма rs1052133 гена 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (OGG1) прогнозируют высокий риск невынашивания беременности. Изобретение обеспечивает выявление специфических генетических маркеров репродуктивных потерь с последующим использованием в комплексе предгравидарного обследования. 1 ил., 4 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно онкологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития и раннего выявления злокачественных новообразований. Для этого в периферической крови человека определяют абсолютное содержание естественных киллеров (CD16+ лимфоцитов) и концентрацию растворимого рецептора апоптоза (sAPO-1). При содержании CD16+ более 0,5×109 кл/л и концентрации sAPO-1 более 4000 пг/мл прогнозируют риск развития злокачественных новообразований. Использование данного способа позволяет выявлять злокачественные новообразования на ранних стадиях развития с использованием иммунологических методов. 4 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и отоларингологии, и касается способа прогнозирования затяжного течения острого ринофарингита при реактивации хронической цитомегаловирусной инфекции у женщин во втором триместре беременности. Сущность способа: определяют титр антител IgM к цитомегаловирусу (ЦМВ) и титры антител IgG к ЦМВ в парных сыворотках крови в баллах (1 балл - титр антител IgM к ЦМВ 1:200 и титры антител IgG к ЦМВ 1:200-1:400 при индексе авидности IgG к ЦМВ более 65% в парных сыворотках крови; 2 балла - титр антител IgM к ЦМВ 1:400 и титры антител IgG к ЦМВ 1:400-1:800 при индексе авидности IgG к ЦМВ более 65% в парных сыворотках крови; 3 балла - титр антител IgM к ЦМВ 1:400 и титры антител IgG к ЦМВ 1:200-1:800 при индексе авидности IgG к ЦМВ более 65% в парных сыворотках крови) (А), концентрацию интерферона-γ (пг/мл) в сыворотке крови в период разгара заболевания (В). Затем с помощью дискриминантного уравнения, включающего определяемые показатели, прогнозируют затяжное течение острого ринофарингита D. При D меньше граничного значения дискриминантной функции прогнозируют отсутствие затяжного течения острого ринофарингита у женщин при реактивации хронической цитомегаловирусной инфекции во втором триместре беременности. При D равной или больше граничного значения прогнозируют развитие затяжного течения острого ринофарингита у женщин при реактивации хронической цитомегаловирусной инфекции во втором триместре беременности. Изобретение обеспечивает прогнозирование затяжного течения острого ринофарингита при реактивации хронической цитомегаловирусной инфекции у женщин во втором триместре беременности. Вероятность правильного прогноза составляет 81,1%. 2 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и может быть использовано при оценке риска возникновения побочных эффектов на фоне применения гормональной контрацепции - этинилэстрадиол+дроспиренон. Способ заключается в том, что перед назначением контрацепции определяют полиморфный локус rs936306 гена CYP19A1. При наличии генотипа G/A диагностируют транзиторные нарушения в первые 6-6,5 месяцев приема контрацепции, а при наличии генотипа А/А диагностируют побочные эффекты, начиная с 7 месяца применения контрацептивов. Способ изобретения позволяет снизить развитие побочных эффектов от гормональной контрацепции, прогнозирования переносимости и безопасности гормональных контрацептивов и возможного влияния на функцию печени, систему гемостаза и липидный спектр крови. 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к репродуктивной иммунологии и гинекологии, и может быть использовано для диагностики иммунологической формы бесплодия у пар с бесплодием неуточненного генеза. Для этого у женщин с первичным и вторичным бесплодием неуточненного генеза оценивают относительное количество CD4+CD25+CD127- Т-клеток, которые определяют однократно в периимплантационном периоде в эндометриальной ткани. При содержании этих клеток менее 7,5% диагностируют иммунологическое бесплодие. Использование данного способа позволяет рассматривать дефицит CD4+CD25+CD127- Т-клеток как маркер иммунологической формы бесплодия как у женщин с привычным невынашиванием, так и с первичным бесплодием. 2 з.п. ф-лы, 3 пр.
Изобретение относится медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования частоты развития инфекционных заболеваний у ребенка на первом году жизни. Для этого определяют иммунологические показатели в пуповинной крови и венозной крови на 4-5 сутки жизни. Рассчитывают коэффициент резистентности (Крез), рассчитываемый по формуле Крез=4,95258-0,0143955×(ФП)+0,0962295×(ФЧ)-0,00903362×(IgG)-0,257936×(IgA)-0,324514×(IgM)+0,430186×(CD45+CD3+)-1,66224×(CD45+CD4+CD3+)+l,49266×(CD45+CD8+CD3+)+0,815254×(CD4+CD8+)+0,522212×(HLA-DR+)-23,1991×(CD3+HLA-DR+)+0,974106×(CD3+CD25+)+0,832493×(CD3+CD4+CD25+)-3,52478×(CD16+CD56+CD3-)+7,67325×(CD16+CD56-CD3-)+11,082×(CD16+CD56+CD3+)+0,305366×(CD19+)+0,0691703×(CD5+)+0,0610707×(CD3+), где ФП - фагоцитарный показатель, ФЧ - фагоцитарное число, IgG, М, А - иммуноглобулины соответствующих классов, CD - маркеры дифференцировки лимфоцитов. При значении Крез, составляющем 1,78 и выше при вычислении по величинам показателей, полученных из пуповинной крови, и ниже, чем 5,72 при вычислении по величинам показателей, полученных из венозной крови на 4-5 сутки жизни, ожидается высокая степень резистентности к инфекционным заболеваниям на первом году жизни. Использование данного способа позволяет прогнозировать частоту развития инфекционных заболеваний у ребенка на первом году жизни и предпринять превентивные меры для снижения риска высокой заболеваемости. 2 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики высокодифференцированного рака у больных с узловыми формами заболеваний щитовидной железы. Для этого проводят тонкоигольную аспирационную биопсию узловых образований щитовидной железы под контролем ультразвукового исследования. При этом пункционную иглу с содержащимся в ней аспиратам промывают двукратно 1 мл изотонического раствора натрия хлорида, затем центрифугируют, отбирают супернатант и методом иммуноферментного анализа определяют тиреоглобулин. Причем если содержание тиреоглобулина меньше 272,5 нг/мл - предполагают отсутствие высокодифференцированного рака щитовидной железы, в интервале 272,5-355,5 нг/мл - риск высокодифференцированного рака щитовидной железы, выше 355,5 нг/мл предполагают высокодифференцированный рак щитовидной железы. Изобретение обеспечивает дооперационную дифференциальную диагностику высокодифференцированного рака у больных с узловыми формами заболеваний щитовидной железы, а также обеспечивает возможность дальнейшего выбора адекватного метода лечения. 3 пр.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложены варианты гуманизированного анти-CD79b антитела, каждый из которых характеризуется наличием легкой и тяжелой цепи и набором 6 CDR с установленной аминокислотной последовательностью и по меньшей мере одним свободным цистеиновым аминокислотным остатком, выбранным из А118С (по Европейской нумерации) в тяжелой цепи и V205C (по нумерации Кэбат) в легкой цепи. Рассмотрены: варианты соединения-конъюгата антитела с лекарственным средством, где антитело связано с лекарственным средством через свободный цистеин; фармацевтический состав для лечения рака на основе антитела; способы детекции CD79b или раковых клеток, а также способ ингибирования клеточной пролиферации, использующие соединение-конъюгат. Описан способ получения соединения-конъюгата. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии раковых заболеваний, ассоциированных с CD79b, в том числе при лечении гемопоэтических опухолей у млекопитающих. 8 н. и 62 з.п. ф-лы, 20 табл., 9 пр., 51 ил.
Наверх