Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота


 


Владельцы патента RU 2564007:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана" (RU)

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения антигена вируса лейкоза (ВЛКРС) для серологической и иммунохимической диагностики болезни. Способ состоит в осаждении циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) сыворотки крови больных лейкозом животных с последующей их диссоциацией и экстрагированием белковых компонентов ВЛКРС. При этом сыворотку крови от больных лейкозом коров смешивают раствором ПЭГ-6000 в 0,1 М боратном буфере до 3% конечной концентрации; перемешивают, центрифугируют, отделяют осадок и растворяют в 5-кратном объеме 3% раствора ПЭГ-6000 в боратном буфере, центрифугируют; полученный осадок, содержащий ЦИК с компонентами вируса, растворяют в 3-кратном объеме дистиллированной воды и выдерживают, перемешивая, после чего пробу смешивают равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивают и центрифугируют; надосадочную жидкость отделяют и диализируют, фильтруют и концентрируют. Способ позволяет получать более специфичный и стабильный антиген ВЛКРС для серологической диагностики инфекции, который позволяет определять более полный спектр антител при инфекционном процессе. 1 табл., 1 пр.

 

Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения антигена вируса лейкоза (ВЛКРС) для серологической и иммунохимической диагностики болезни. Способ состоит в осаждении циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) сыворотки крови больных лейкозом животных с последующей их диссоциацией и экстрагированием белковых компонентов ВЛКРС. Способ позволяет получать более специфичный и стабильный антиген ВЛКРС для серологической и иммунохимической диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Преимуществом предлагаемого антигена является то, что он позволяет определять более полный спектр антител при инфекционном процессе и открывает новые перспективы для разработки новых более эффективных и информативных иммунохимических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

ВЛКРС обладает выраженной антигенной активностью. В организме крупного рогатого скота антитела вырабатываются преимущественно на структурные белки вириона. У зараженных животных в крови циркулируют антитела к р24, р15, р12, p10, gp30 и gp51. Хотя и считается, что диагностическое значение имеют антитела против gp51 и р24 ВЛКРС, в количественном соотношении они могут коррелировать со стадией инфекционного процесса [1]. Кроме того, доказано, что на разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота меняется и спектр свободно циркулирующих в сыворотке крови антител, обнаруживаются антитела не только основным белкам вириона, но и продуктам их расщепления. Все эти данные свидетельствуют о необходимости комплексного подхода при определении как антигенов вируса, так и антител к ним в серологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Необходимо также отметить, что существующие методы диагностики не учитывают генетического многообразия возбудителя болезни [2].

В настоящее время для изучения эпизоотической ситуации по инфекционным болезням в регионах и для их диагностики в мировой практике широко используются и разрабатываются различные экспресс тест-системы.

Наиболее значимыми в разработке экспресс-тестов для диагностики инфекционных болезней являются методы иммунохимического анализа. При этом применяются различные технологии, среди которых немало важную роль играют модифицированные методы ИФА, а также иммуноблот анализ. Определяющим фактором эффективности иммунохимических методов является качество используемого антигена. В настоящее время большинство серологических реакций, применяемых в диагностике лейкоза крупного рогатого скота, направлено только на выявление анти-gp51 антител.

Известные способы получения антигена ВЛКРС предусматривают культивирование вируссодержащих клеток с последующей их обработкой специальными методами. Патент на изобретение №2020960 от 15 октября 1994, патент на изобретение №2185854 от 27 июля 2002, патент на изобретение US 8529909 В2 от 27 сентября 2009. Известны способы получения антигена вируса лейкоза с использованием фазовых систем декстран - полиэтиленгликоль (ПЭГ), сульфат декстрана - ПЭГ, сульфат декстрана - поливиниловый спирт, сульфат декстрана - метилцеллюлоза [3].

Основным недостатком всех известных способов является то, что они трудоемки и позволяют получать антигены или р24, или gp51.

Ближайшим аналогом предлагаемого способа является патент на изобретение №2282854 МПК: G01N «Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота» от 27 августа 2006 г., основной этап которого заключается в том, что из крови получают концентрированный образец белков ВЛКРС путем центрифугирования при 20000-100000 g, суспендируют его в буфере средней ионной силы с pH 7,0-7,8.

В предлагаемом изобретении при выделении антигена ВЛКРС из сывороток крови больных лейкозом коров исходили из того, что вирусные частицы, главным образом, содержатся в составе ЦИК. Технологию разрабатывали с учетом необходимости диссоциации ЦИК и избавления от сывороточных антител и всех остальных белков.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

1. Осаждение ЦИК в сыворотке крови методом преципитации полиэтиленгликолем (ПЭГ-6000). Для этого сыворотку крови от больных лейкозом коров в объеме не менее 500 мл смешивают раствором ПЭГ-6000 в 0,1 М боратном буфере (pH-8,8) до 3% конечной концентрации. Перемешивают и оставляют на 24 часа при +4°С.

2. Выделение ЦИК методом центрифугирования. По истечении указанного времени пробу сыворотки крови центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, надосадок сливают, а осадок растворяют в 5-кратном объеме 3% раствора ПЭГ-6000 в боратном буфере и вновь центрифугируют в тех же условиях (промывка).

3. Диссоциация ЦИК и удаление глобулинов. Полученный осадок, содержащий ЦИК с компонентами вируса, растворяют в 3-кратном объеме дистиллированной воды и выдерживают, периодически перемешивая, 1 час при 60°C. По истечении этого времени пробу смешивают равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония, осторожно перемешивают в течение 2-3 минуты и центрифугируют.

4. Выделение и очищение антигенного препарата. Надосадочную жидкость осторожно отделяют и диализируют при комнатной температуре в течение 48 часов против дистиллированной воды. Фильтруют через бумажный фильтр и концентрируют (не менее в 10 раз) против силикагеля L 100/250 для хроматографии.

Пример 1.

Антигенные свойства выделенных белковых фракций вирусных частиц изучали в ИФА с использованием сывороток крови инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров. Контрольным тестом служилИФА с использованием набора выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота, производства НПО «Нарвак». Всего исследовали более 152 проб сывороток крови. Результаты исследований по одному хозяйству представлены в таблице 1.

По результатам исследований установлено, что вирусные частицы, выделенные из сывороток крови больных лейкозом коров, обладают антигенными свойствами и не уступают по специфичности антигену gp51, применяемых в коммерческих наборах для ИФА.

Из приведенных в таблице данных особый интерес представляют результаты исследований проб №№3, 7 и 8. Показатели оптической плотности (ОП) в ИФА у этих проб с исследуемым антигеном гораздо выше. Причем результаты ОП положительной контрольной сыворотки у данного антигена ниже, чем у коммерческого набора.

Как известно, в тест-системах для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в основном используются белки оболочки вируса - gp51. Положительные контрольные сыворотки, соответственно получены против этого антигена.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемый антиген является комплексным, содержащим различные белковые фракции вируса лейкоза, и позволяет определять более полный спектр антител при инфекционном процессе, открывает новые перспективы для разработки новых более эффективных и информативных иммунохимических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Источники информации

1. Сюрин В.Н. Вирус лейкоза крупного рогатого скота / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. - М.: МВА, 1998. - С. 76-85.

2. Хазипов Н.З. Генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота по env-гену / Н.З. Хазипов, Р.Н. Вафин, А.М. Алимов и др. // Вестник Российской академии с/х наук. - 2011. С.62-63.

3. Hammar L., Merza М., Malm К., Eriksson S., Morein В. The use of aqueous two-phase systems to concentrate and purify bovine leukemia virus outer envelope protein gp51. / Biotechnology and biochemistry. - 1989. - 11. - 296-306.

Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), включающий выделение белковых компонентов ВЛКРС из сыворотки крови, отличающийся тем, что предварительно осаждают циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) методом преципитации с ПЭГ-6000 с последующей диссоциацией путем инкубирования при 60°C 1 час, иммуноглобулины осаждают полунасыщенным раствором сульфата аммония, супернатант диализируют против дистиллированной воды, концентрируют против силикагеля L100/250 и используют в качестве антигена в иммунохимических реакциях в диагностике лейкоза крупного рогатого скота.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к ветеринарии и заключается в способе активации клеточного иммунитета гомеопатическими препаратами in vitro. К лейкоцитарной взвеси в объеме 0,5 мл добавляют 0,5 мл гомеопатического препарата, разведенного в физиологическом растворе, затем полученный раствор помещают в термостат на 1 час при Т=37±0,5°С, после этого в раствор вносят взвесь микроорганизмов референтного штамма Staphylococcus albus №182 по 0,5 мл, содержащую 109 КОЕ в 1 мл физиологического раствора, последний раствор помещают в термостат на 30 минут при Т=37±0,5°С и после инкубации мазки крови фиксируют в спирт-формалине в течение 10 минут и окрашивают по Романовскому - Гимза в течение 30 минут.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения радиационно-термического поражения организма. Для этого применяют однократное подкожное введение облученного гамма-лучами в дозе 14,0 Гр бифидумбактерина.
Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лечения мастита у овец. Способ включает внутримышечное введение тилозинсодержащего препарата в дозе 0,05 мл/кг массы тела один раз в сутки в течение 3-4 дней при всех формах мастита.
Изобретение относится к медицине и заключается в способе инкапсуляции интестевита. При осуществлении способа 100 мг интестевита растворяют в 1 мл диоксана, или диметилсульфоксида, или диметилформамида, диспергируют полученную смесь в раствор натрий карбоксиметилцеллюлозы в ацетоне, содержащий 300 мл указанного полимера, в присутствии 0,01 г препарата Е472 с при перемешивании, приливают 1 мл дистиллированной воды, полученную суспензию отфильтровывают и сушат.

Изобретение относится к микробиологии. Предложен штамм Trametes versicolor, используемый для получения противоплесневых препаратов в отношении грибов рода Penicillium.
Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Препарат для лечения некробактериоза крупного рогатого скота содержит поливалентный анатоксин против клостридиозов овец, культуральную жидкость штамма Escherichia coli А-5 с содержанием микробных клеток 7,0·108-1·109 КОЕ/мл и культуральную жидкость штамма Escherichia coli Б-5 с содержанием микробных клеток 7,0·108-1·109 КОЕ/мл в соотношении 1:1:1.
Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть применено при лечении анальной трещины. Для этого используют ботулотоксин А в дозе 20-35 Ед, который вводят в 4 точки во внутренний анальный сфинктер на 1, 5, 7 и 11 часов с одновременным подкожным введением 5-7 Ед ботулотоксина под трещину с ее дистального края.

Заявленное изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для коррекции иммунной недостаточности и профилактики желудочно-кишечных болезней новорожденных телят.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Штамм Bifidobacterium lactis CNCM I-3446 применяют в производстве пробиотической композиции для стимуляции развития начальной бифидогенной кишечной микробиоты у детей, рожденных путем кесарева сечения.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при производстве медико-биологических препаратов. Фармацевтическая композиция содержит бактериофаги, полученные путем культивирования на питательной среде, содержащей глюкозу, натрий хлористый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, дрожжевой автолизат жидкий и очищенную воду в заданном соотношении, и высушенные с наполнителем без лиофилизации, в виде таблеток с желудочно-резистентным покрытием.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу профилактики инфекционно-воспалительных осложнений у женщин с субмукозной миомой матки после гистерорезектоскопии. Сущность способа состоит в том, что после гистерорезектоскопии не менее 3 дней применяют антибиотики, пробиотики и пребиотики, где в качестве пробиотика применяют энтерол-250, а в качестве пребиотика хилак форте. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность профилактики инфекционно-воспалительных осложнений у женщин с субмукозной миомой матки после гистерорезектоскопии с сокращением сроков лечения. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.

Предложен штамм микромицета Clonostachys candelabrum, обладающий антибактериальной активностью в отношении возбудителя туляремии Francisella tularensis 15/10. Штамм микромицета выделен из почвы и депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером F-1466. Фугат культуральной жидкости штамма микромицета Clonostachys candelabrum проявляет высокую активность в отношении Francisella tularensis 15/10 начиная с третьих суток культивирования. При этом наибольшая активность достигается на четвертые сутки культивирования. Диаметр зоны подавления роста Francisella tularensis 15/10 на четвертые сутки составляет 45±5 мм. 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лечения эозинофильной пневмонии при дирофиляриозе. Применяют препарат Преднизолон в дозе 0,18 мг/кг внутримышечно 2 раза в день в течение 5 дней. Натрий тиосульфат 30%-ный в дозе 0,3 мг/кг внутривенно 1 раз в день в течение 10 дней. Цефотаксим в дозе 15 мг/кг внутримышечно 2 раза в день в течение 10 дней. Ивермек в дозе 0,5 мг/кг внутримышечно однократно. Через 7 дней после ивермека назначают левамизол 75 по схеме в нарастающих дозах внутримышечно в течение 7 дней соответственно 1,5 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5,0 мг/кг, 7,5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 7,5 мг/кг. Заявленное изобретение позволяет повысить эффективность лечения собак с эозинофильной пневмонией при дирофиляриозе. 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лечения тромбоэмболии легочной артерии у собак, больных дирофиляриозом. Применяют препарат альтеплаза в дозе 1 мг/кг в течение 3 часов при внутривенном введении. Через 7 дней применяют препарат ивермек в дозе 0,5 мг/кг внутримышечно однократно. Через 7 дней применяют левамизол 75 по схеме в нарастающих дозах внутримышечно в течение 7 дней соответственно 1,5 мг/кг; 2,5 мг/кг; 5,0 мг/кг; 7,5 мг/кг; 7,5 мг/кг; 7,5 мг/кг; 7,5 мг/кг. Заявленное изобретение позволяет повысить эффективность лечения. 1 табл., 1 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для лечения пародонтита. Для этого проводят снятие над- и поддесневых зубных отложений, удаление грануляций, санацию полости рта, профессиональную чистку зубов, промывание пародонтальных карманов 1,5% раствором перекиси водорода. После этого в пародонтальные карманы вокруг зубов по показаниям в зависимости от глубины и вида патологического процесса вводят препарат, стимулирующий регенерацию, и/или ферментный препарат, и/или витамины, и/или сорбент, и/или антиоксидант, после чего слизистую десен закрывают временной повязкой, оставляют до замены препарата на следующем посещении, проводят 3-10 процедур с экспозицией 1-3 суток. Затем в пародонтальные карманы после их очищения кюретами, промывания 1,5% раствором перекиси водорода вводят Бифидумбактерин форте порошок, который засыпают хирургической кюретой, отодвигая десну гладилкой, после чего слизистую десен закрывают временной повязкой, оставляют до замены препарата на следующем посещении, проводят 5-10 ежедневных процедур. Способ позволяет повысить лечебный эффект за счет воздействия препарата в труднодоступных анатомических образованиях пародонта, изолированного временной повязкой от внешних раздражителей. 3 пр.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для профилактики лейкоза молодняка крупного рогатого скота. Телятам 6-месячного возраста вводят риботан внутримышечно в дозе 3 мл/гол. однократно с интервалом в 2 недели в течение 6 месяцев. Заявленное изобретение позволяет сохранить активность иммунной системы и естественной резистентности в пределах показателей физиологической нормы в течение последующих 6 месяцев, при этом обеспечивается высокий уровень иммунобиологической защиты организма и профилактика появления РИД-положительных реакций. 4 табл., 2 пр.
Наверх