Кристаллические формы натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, содержащие их фармацевтические препараты и способы получения указанных форм



Кристаллические формы натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, содержащие их фармацевтические препараты и способы получения указанных форм
Кристаллические формы натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, содержащие их фармацевтические препараты и способы получения указанных форм
Кристаллические формы натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, содержащие их фармацевтические препараты и способы получения указанных форм
Кристаллические формы натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, содержащие их фармацевтические препараты и способы получения указанных форм
Кристаллические формы натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, содержащие их фармацевтические препараты и способы получения указанных форм
Кристаллические формы натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, содержащие их фармацевтические препараты и способы получения указанных форм
Кристаллические формы натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, содержащие их фармацевтические препараты и способы получения указанных форм
Кристаллические формы натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, содержащие их фармацевтические препараты и способы получения указанных форм
Кристаллические формы натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, содержащие их фармацевтические препараты и способы получения указанных форм
Кристаллические формы натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, содержащие их фармацевтические препараты и способы получения указанных форм

 


Владельцы патента RU 2585677:

МЕТРИОФАРМ АГ (CH)

В заявке описаны две новые кристаллические формы I и II натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-дионата, которые имеют значения кристаллографических характеристик, определенных с помощью рентгенограмм, приведенные в формуле изобретения. Описаны также способы получения этих кристаллических форм. Полученные формы I и II обладают разными иммунологическими воздействиями. Эта полезная характеристика применима для иммуноспецифических целей. Кроме того, обе формы обладают полезными физико-химическими характеристиками, которые применимы для получения, последующей обработки и/или применения для фармацевтического получения формы I или формы II, или их смеси. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 13 табл., 3 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к получению по меньшей мере двух новых кристаллических форм натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, обладающих полезными характеристиками, к содержащим их фармацевтическим композициям и к способам их получения.

В частности, настоящее изобретение относится к получению 2 новых кристаллических форм натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, обладающих иммуностимулирующей и иммунодепрессивной способностью, предназначенных для медицинских целей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В данной области техники в течение довольно длительного времени известны химические соединения, обладающие иммуномодулирующей способностью. К этим соединениям также относится натриевая соль 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, которое известно, например из EP 1203587 A и обладает приведенной ниже основной структурой (Na+ не показан):

Указанная выше основная структура также называется люминолом. Из предшествующего уровня техники известно, что соли щелочных металлов 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона кристаллизуются в виде твердого вещества в разных гидратных формах. В предшествующем уровне техники, в частности, описаны дигидрат натриевой соли RU 2113222 C1) и тригидрат калиевой соли и их смешанные формы (RU 2211036 C2).

В данной области техники известно, что кристаллические формы вещества могут различаться по своим физическим характеристикам, таким как растворимость, скорость растворения, стабильность и т.п. (Haleblian and McCrone (1969): Journal of Pharmaceutical Sciences, 58: 911-929).

Такие характеристики могут влиять на фармацевтическую обработку активного ингредиента, а также его биологическую доступность и тем самым на биологическую эффективность (см. Griesser (2006) in: Polymorphisms in the Pharmaceutical Industry. Hilfiker (Ed.) 211-234).

Для получения лекарственных средств важно, чтобы исходное вещество было стабильным, негигроскопичным и его характеристики, как твердого вещества, можно было регулировать во всей методике получения. Кроме того, чрезвычайно важна химическая стабильность и твердофазная стабильность активного ингредиента при длительном хранении (см. Miller et al. (2006) in: Polymorphisms in the Pharmaceutical Industry. Hilfiker (Ed.) 385-403). Желательно, чтобы физические характеристики активного ингредиента сохранялись в течение еще более длительного периода хранения. Это относится, например, к гигроскопичности, растворимости или начальной скорости растворения активного ингредиента.

US 6489326 B1 описан способ получения натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона предназначенной для применения в медицине, который дает форму дигидрата. Недостатком этого способа является использование катализатора на основе тяжелого металла, остатки которого могут сохраниться в продукте. Продукты, содержащие остатки, могут быть аллергенами и обычно в соответствии с требованиями EMEA (см. Guideline EMEA/CHMP/SWP/4446/2000) считаются неприемлемыми для фармацевтики.

Для фармацевтической обработки и применение в медицине очень важны способы получения, который надежно и воспроизводимо позволяют получать необходимые кристаллические формы. Следует отметить, что при получении кристаллических форм небольшие колебания параметров способа всегда приводят к изменениям кристаллической структуры продуктом и тем самым в конечном счете могут привести к другим кристаллическим формам или смешанным формам. Изменяющиеся при этом характеристики, например изменение биологической эффективности вследствие изменения растворимости, могут привести к отбраковыванию целых партий, часто вообще невозможно получить необходимую форму (см. Ulrich and Jones (2005): Nachrichten aus der Chemie 53: 19-23). Кроме степени чистоты активного ингредиента и обусловленных ею изменений эффективности, может быть оказано неблагоприятное влияние на другие характеристики, важные для фармацевтической обработки, например, на способность таблеток к прессованию вследствие ухудшения сыпучести или скорости потока кристаллической формы. Соли щелочных металлов 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона относятся к группе гидразидов аминофталевой кислоты и описаны в предшествующем уровне техники, как иммуномодуляторы, обладающие особыми противовоспалительными, антиокислительными и антитоксичными характеристиками (см. US 6489326 B1; EP 0617024, US 5512573, US 5543410 A, US 7326690 B2).

Иммуномодулирующие вещества в соответствии с их воздействиями обычно подразделяют на иммунодепрессанты и иммуностимуляторы (см. Rote Liste Service GmbH (2011): www.rote-liste.de).

Соответствующие препараты, обладающие только иммуностимулирующей и иммунодепрессивной способностью, такие как, например иммунодепрессивные ФНО альфа-блокаторы или иммуностимулирующие препараты интерферона бета, часто приводят к тяжелым нежелательным побочным эффектам в организме, а именно, вследствие очень специфичного механизма их действия. Некоторые известные иммунодепрессивные вещества, такие как, например ФНО альфа-блокатор адалимумаб, специфически ингибирует некоторые воспалительные медиаторы. Известно, что такие лекарственные средства характеризуются тяжелыми побочными эффектами (см. Descotes (2008): Expert Opin. Drug Metab. Toxicol., 4: 12: 1537-1549), поскольку блокирование отдельных воспалительных медиаторов является сильным вмешательством в сложную иммунную систему. Вследствие этого организм больше не может выполнять свои функции, т.е. автоматически и физиологически подходящим образом реагировать на эндогенные воспалительные стимулы, такие как, например, бактериальные инфекции. Так, например, использование ФНО альфа-блокаторов противопоказано при тяжелых инфекциях, это, в частности, относится к сепсису и туберкулезу. Перед введением соответствующего лекарственного средства, такого как, например, предназначенного для лечения ревматоидного артрита, настоятельно рекомендуется проводить скрининг ТВС (см. Diel et al. (2009): Z Rheumatol 5: 411-416). Кроме того, в публикации Hoffmann (2005: Intensivmed 42: 371-377) убедительно показано, что ФНО альфа-блокаторы непригодные для клинического применения в случае септических патологических состояний и даже могут привести к увеличению смертности.

Однако специфическая иммуномодулирующая способность солей щелочных металлов 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона непосредственно полезна для предупреждения так называемых цитокиновых приступов (см. Suntharalingam et al. (2006): N Engl J Med 355; 1018-28), вызванных чрезмерными иммунными ответами. Отличающиеся от так называемых цитокиновых блокаторов, эти соли в основном не приводят к побочным эффектам, поскольку не происходит ингибирование отдельных цитокинов, а они регулируются на физиологическом уровне и дополнительно обеспечивается адекватная реакция организма на возбудители инфекции. Однако в предшествующем уровне техники сколько-нибудь разные иммуноспецифические эффекты не приписаны отдельным кристаллическим формам солей щелочных металлов 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона. В частности, в предшествующем уровне техники не обнаружены утверждения о том, что отдельные кристаллические формы можно использовать специфически и в соответствии с показаниями, т.е. в соответствии с их основным, специфическим главным иммуномодулирующим воздействием, предпочтительно в качестве иммунодепрессантов или предпочтительно в качестве иммуностимуляторов.

Специальное применение в медицине натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона описано в US 2003/0195183 A1 с "коррекцией иммунной системы" путем использования разных доз (от 0,2 мкг до 1000 мг) солей щелочных металлов 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона в разных пробных экспериментах. В этом диапазоне эффективные дозы меняются в зависимости от исследуемого заболевания и индивидуальных параметров, таких как, например, вид, возраст, пол и масса. Например, использование разных доз в диапазоне от 2 до 200 мкг натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона приводит к различным последствиям для клеточного иммунного ответа у мышей, вызванного подкожной инъекцией эритроцитов (замедленная реакция гиперчувствительности - ЗРГ). Чем меньше использованная доза, тем больше показатель ЗРГ. Для более чувствительной из двух исследованных линий мышей наибольшая доза привела к подавлению ЗРГ. Этот пример и дополнительные in vivo, in vitro и также клинические примеры, приведенные в US 2003/0195183 A1, показывают, что небольшие дозы солей щелочных металлов 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона в основном действуют иммуностимулирующим образом, а более высокие дозы солей щелочных металлов 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона в основном действуют иммунодепрессивным образом. Поскольку отличие иммуностимулирующей дозы от иммунодепрессивной дозы для разных линий мышей по-разному велико, лечение разных видов животных и отдельных людей в медицине и ветеринарии также приведет к влиянию на генетику популяции и опасность такого зависимого от дозы использования особенно велика.

Поэтому для клинической практики, в особенности для предупреждения тяжелых заболеваний с врожденным или приобретенным иммунодефицитом или с чрезмерными иммунными ответами будет полезен способ специфического регулирования иммуномодуляции путем использования разных полиморфных форм вещества.

Способность являться предпочтительно стимулирующимым иммуномодулятором желательна, например, для лекарственного лечения пациентов, обладающих слабой иммунной защитой, таких как инфицированные ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) или после проведения химиотерапии.

Способность являться предпочтительно депрессивным иммуномодулятором желательна, например сведения к минимуму воспалительных процессов, таких как протекающие в случае хирургической операции, аутоиммунных заболеваний и аллергий.

В клинической практике при некоторых показаниях, в частности, при рецидивирующих воспалительных заболеваниях, иммуностимуляторы, а также иммунодепрессанты часто используют в терапии одновременно или поочередно (см. DMSG 2006: Aktuelle Therapieempfehlungen September 2006; Rote Liste Service GmbH (2011): www.rote-liste.de). Это приводит к увелличению опасности взаимодействий. Поэтому химически сходные вещества класса веществ, которые могут оказать противоположные эффекты, обеспечивают преимущества в клинической практике, поскольку можно ожидать, что при одновременном или проводимом с интервалом введением они приведут к меньшим фармакологическим взаимодействиям в организме, чем активные ингредиенты других классов, использующиеся в этих же целях.

Другим недостатком предшествующего уровня техники является то, что зависимое от дозы введение иммуномодулятора требует большего внимания проводящего введение медицинского персонала или самого пациента и это увеличивает опасность ошибки при введении.

Поэтому для практического использования и обеспечивающего небольшой риск применения в терапии желательно не только зависимое от дозы иммуноспецифическое введение солей щелочных металлов 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, при этом дополнительно используются медицинские преимущества этого класса веществ.

Следует отметить, что вмешательство в сложные правила иммунной системы могут иметь тяжелые последствия для подвергающегося воздействию организма. Поэтому для применения в медицине еще более важны иммуномодуляторы, характеризующиеся как можно меньшим количеством побочных эффектов и определенным иммунологическим воздействием, что делает возможной специфическую профилактику или лечение иммунологически обусловленных заболеваний. Такие иммуномодуляторы должны обладать большим значением для медицины.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение было создано исходя из описанного выше уровня техники, при этом задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы получить новые формы натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона обладающие специфической независимой иммунологической способностью, так чтобы их можно было специфически применять для в основном иммунодепрессивных или в основном иммуностимулирующих целей. Следует понимать, что особенно желательно, чтобы эти новые формы обладали в основном иммуностимулирующей или в основном иммунодепрессивной способностью соответственно независимо от дозы. Кроме того, полученные формы должны обладать физико-химическими характеристиками, которые благоприятны для лекарственных средств, изготовляемых, хранимых и/или применяющихся по отдельности или в комбинации.

Эта задача решена с помощью двух новых безводных форм натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона (безводные формы I и II), которые неожиданно и экспериментально доказано отличаются от предшествующего уровня техники по физико-химическим характеристикам и независимо по иммуномодулирующей способности, т.е., в частности от известной натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона. В то время, как безводная форма I, предлагаемая в настоящем изобретении (→кристаллическая форма I), обладает иммуномодулирующей, а именно, в основном иммуностимулирующей способностью, новая безводная форма II (→кристаллическая форма II), предлагаемая в настоящем изобретении, обладает иммуномодулирующей, а именно, в основном иммунодепрессивной способностью.

Кристаллические формы I и II определяются с помощью 10 характеристических значений межплоскостных расстояний и углов и 2-тета, определенных с помощью порошковых рентгенограмм (фиг. 2 и 3).

Согласно изобретению было установлено, что формы I и II обладают физическими характеристиками, благоприятными для фармацевтической обработки и применения, включая стабильность, стабильность при хранении, негигроскопичность и растворимость. Они более благоприятны для фармацевтического производства и последующей обработки по сравнению, например, с дигидратами, в которых изменение содержания воды может привести к затруднениям при изготовлении композиций, например, изменения массы активного ингредиента при прессовании таблетки, капсулировании или стерилизации. Имеются различия физических характеристик форм, предлагаемых в настоящем изобретении, и форм предшествующего уровня техники, например, растворимости (см. таблицу 6).

Кроме того, была поставлена задача разработки способов получения новых безводных форм натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, предлагаемых в настоящем изобретении, по возможности подходящим и воспроизводимым образом. Описанные способы предназначены для реализации без использования катализаторов на основе тяжелого металла и обеспечения воспроизводимого получения новой кристаллической формы II даже при произвольных размерах партий. Кроме того, была поставлена задача разработки способов получения кристаллических форм I и II, обладающих характеристиками, подходящими для фармацевтической обработки и различных вариантов применения.

Эта задача решена по меньшей мере одним способом необязательного получения кристаллической формы I или II, в котором гидроксид натрия и люминол растворяют в воде. При добавлении обладающего низкой молекулярной массой спирта, предпочтительно этанола или 2-пропанола, осаждается кристаллическая натриевая соль люминола. Искомую кристаллическую форму I или II получают после выделения и повторяющихся стадий промывки и перемешивания в течение некоторого времени. Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно использовать для произвольных размеров партий.

Начальным продуктом для получения обеих кристаллических форм является обладающий наибольшей возможной чистотой люминол или используют способ его получения путем восстановления 3-нитрофталевой кислоты в щелочной среде подходящим восстановительным реагентом с получением ангидрида 3-нитрофталевой кислоты. Затем проводят необязательные стадии очистки путем перекристаллизации.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям форм I или II или их комбинациям соответственно по отдельности или вместе с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 приведены полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа изображения формы I (сверху) и II (снизу).

На фиг. 2 приведена порошковая рентгенограмма кристаллической формы I.

На фиг. 3 приведена порошковая рентгенограмма кристаллической формы II.

На фиг. 4 показана скорость растворения формы I и II в воде в зависимости от времени (20 мин).

Форма I охарактеризована нижней из двух кривых, а форма II - верхней.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если не указано иное, то все технические и научные термины, использующиеся в настоящем изобретении, обладают значениями, которыми им придает специалист в соответствующей области техники.

"Организм" является живым существом, в частности, человеком или животным, обладающим саморегулирующейся иммунологической системой.

Термин "активный ингредиент" включает кристаллическую форму I или кристаллическую форму II или их смесь.

Термин "фармацевтическая композиция" означает активный ингредиент в любой определенной фармакологически приемлемой дозе и форме введения, такой как, например, порошок, суспензия, эмульсия и/или их смеси. Он содержит фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества и все вещества, которые прямо или косвенно образуются вследствие объединения, агрегации, образования комплекса ингредиентов или вследствие других реакций или взаимодействий, и дополнительно другие активные ингредиенты по отдельности или в комбинации.

Фармацевтические композиции активного ингредиента, предлагаемого в настоящем изобретении, по отдельности или в комбинации с другими вспомогательными веществами и стандартными лекарственными средствами, в контексте настоящего изобретения можно приготовить в жидкой и твердой форме и вводить любым приемлемым с медицинской точки зрения образом, в основном, но не исключительно внутривенно, внутримышечно, местно (например, глазные капли), подкожно, чрескожно, вагинально, ректально или перорально, в том числе сублингвально и трансбуккально, а также в форме выделяющих вещество имплантатов. Жидкие формы могут представлять собой: например, растворы (например, для инъекций и вливания), суспензии, эмульсии, спреи, лосьоны и мази. Твердые формы могут представлять собой: таблетки, драже, капсулы, порошки или другие формы, известные и представляющиеся приемлемыми для специалиста в данной области техники, например, суппозитории.

Термин "вспомогательное вещество" используют в настоящем изобретении для описания любого компонента фармацевтической композиции кроме самого активного ингредиента. Выбор приемлемых вспомогательных веществ зависит от таких факторов, как тип введения и доза, а также от влияния самих вспомогательных веществ на растворимость и стабильность композиции.

Фармацевтические "вспомогательные вещества" представляют собой вещества, которые известны специалисту в данной области техники или описаны в стандартных фармацевтических справочниках или официальных фармакопеях (например, в Европейской Фармакопее). Такие вещества могут, например, влиять на распределение активного ингредиента в различных тканях и органах или менять длительность или скорость воздействия лекарственной формы, например, путем ускорения всасывания (например диметилсульфоксид, никотиновая кислота, гиалуронидаза) или путем замедления начала воздействия с помощью приемлемых замедляющих препаратов.

Фармацевтические вспомогательные вещества, предназначенные для использования в необходимой форме для введения, например, могут представлять собой: цитрат натрия, фосфат кальция, карбонат кальция вместе с приемлемыми разрыхлителями для таблеток, например, для перорального введения. Ими могут являться, например, вещества, которые набухают вследствие поглощения воды (крахмал, производные целлюлозы, альгинаты, полисахариды, декстраны, сшитый поливинилпирролидон), вещества, которые выделяют газ по химической реакции с водой (гидрокарбонат натрия, лимонная и винная кислота), или вещества, которые, как гидрофилизирующие агенты, улучшают смачивание кристаллитов и тем самым способствуют их растворению в воде (например, полиэтиленгликольсорбитановый эфир жирной кислоты).

Вспомогательные вещества также представляют собой вещества, которые можно использовать в качестве связующих, такие как, например, крахмал, желатин, сахара, производные целлюлозы, или разбавителей, например, сахара. Кроме того, используются поверхностно-активные вещества, например, лаурилсульфат натрия или полисорбат 80, или смазывающие вещества, такие как, например, стеарат магния, стеарат натрия, и другие вкусовые добавки, антиоксиданты, красители и консерванты, которые может счесть приемлемыми специалист в данной области техники.

Термин "в основном чистое" означает степень чистоты активного ингредиента, содержащего не менее 95%, предпочтительно 98%, наиболее предпочтительно 99% натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона.

Термин "иммуноспецифическое" означает специальное использование формы I и/или формы II для лечения заболеваний, сопровождающихся иммунодефицитом или избыточной иммунной системой.

Термин "эффект" означает специфический, в настоящем изобретении иммуноспецифический механизм воздействия активного ингредиента для задач настоящего изобретения, обладающего в основном иммуностимулирующей или в основном иммунодепрессивной способностью.

Новые кристаллические формы I и II натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона.

Настоящее изобретение относится к новой кристаллической безводной форме I натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, характеризующейся порошковой рентгенограммой, полученной с помощью дифрактометра Брэгга-Брентано (Panalytical X'Pert Pro) при длине волны лямбда = 1,54187 Å и с использованием детектора X'Celerator Scientific RTMS и излучения меди Cu K(α1) с никелевым фильтром, представленной с помощью значений D или значений 2-тета, "D" означает межплоскостные расстояния (таблица 1) и "2-тета" означает углы 2-тета в градусах. I(rel) означают относительные интенсивности отражений (таблица 2):

Таблица 1
Значения d для безводной формы I:
13,51 6,94 5,24 4,59 3,89 3,45 3,35 3,28 3,11 2,95
Округленные значения 13,5 6,9 5,2 4,6 3,9 3,5 3,4 3,3 3,1 3,0
Таблица 2
Значения 2-тета для безводной формы I и относительные интенсивности I(rel):
6,5 12,7 16,9 19,3 22,8 25,8 26,6 27,2 28,7 30,3
I/Io(rel) vst st m w w m st st m m
где: w = малоинтенсивная, m = средней интенсивности, st = сильно интенсивная и vst = очень сильно интенсивная.

Настоящее изобретение также относится к новой кристаллической безводной форме II натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, характеризующейся порошковой рентгенограммой, полученной с помощью дифрактометра Брэгга-Брентано (Panalytical X'Pert Pro) при длине волны лямбда = 1,54187 Å и с использованием детектора X'Celerator Scientific RTMS и излучения меди Cu K(α1) с никелевым фильтром, представленной с помощью значений D или значений 2-тета, "D" означает межплоскостные расстояния (таблица 3) и "2-тета" означает углы 2-тета в градусах. I(rel) означают относительные интенсивности отражений (таблица 4):

Таблица 3
Значения d для безводной формы II:
12,92 7,88 7,08 6,47 5,32 3,96 3,66 3,57 3,27 3,21
Округленные значения 12,9 7,9 7,1 6,5 5,3 4,0 3,7 3,6 3,3 3,2
Таблица 4
значения 2-тета для безводной формы II и относительные интенсивности I(rel):
6,8 11,2 12,5 13,7 16,7 22,4 24,3 24,9 27,2 27,8
I/Io(rel) vst w m st m w w w m st
где: w = малоинтенсивная, m = средней интенсивности, st = сильно интенсивная и vst = очень сильно интенсивная.

Благоприятные физические характеристики:

Обе формы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно различить с помощью сканирующего электронного микроскопа: форма II в основном обладает игольчатой кристаллической октаэдрической структурой длиной несколько микрометров, состоящей из слоев, тогда как по данным СЭМ форма I образует в основном морфологические неоднородные кристаллиты со скругленными ребрами и представляет собой агломераты порошкообразного типа (фиг.1). Их кристаллическая форма обеспечивает превосходные характеристики для фармацевтической обработки форм, предлагаемых в настоящем изобретении: форма II вследствие кристаллической формы частицы по сравнению с формой I обладает лучшей сыпучестью и вследствие этого лучшей фильтруемостью, тогда как форма I, в частности, вследствие своей большей объемной плотности является более подходящей для прессования в таблетки, чему дополнительно способствует ее склонность к агломерации, возможно, вследствие связывания ее слоистых субструктур.

Обе кристаллические формы стабильны в течение по меньшей мере двух месяцев при комнатной температуре (25°C) и 40°C и разлагаются только при температуре выше 335°C±10°C (форма I) или 385°C±10°C (форма II) соответственно, тогда как для дигидрата, описанного в US 6489326 B1, уже при 85°C можно наблюдать эндотермический твердофазный переход (таблица 5). Твердофазный переход для дигидрата, описанного в US 6489326 B1, исследован с помощью одновременного термогравиметрического - дифференциального термического анализа с помощью прибора Linseis L81-077, вместе с масс-спектрометрическим исследованием с использованием термовесов Netzsch STA 449 C, вместе с масс-спектрометром и Фурье-ИК-спектрометром в диапазоне температур 30-300°C в атмосфере гелия. Температуры разложения форм I-II определены с помощью того же устройства в диапазоне температур 30-500°C в искусственном воздухе (4N2:1O2). Данные проанализированы с помощью заводского программного обеспечения Proteus.

Таблица 5
Температуры разложения форм I-II и исследование твердофазного перехода для дигидрата, описанного в US 6489326 B1.
Форма I Форма II Дигидрат, US 6489326 B1
335°C±10°C 385°C±10°C 85°C±10°C

Данные термического анализа подтвердили предположение авторов настоящего изобретения о том, что обе кристаллические формы обладают превосходной стабильностью и стабильностью при хранении. Эти характеристики дополнительно способствуют лучшей фармацевтической обработке кристаллических форм I и II, предлагаемых в настоящем изобретении, чем для дигидрата, описанного в US 6489326 B1, делая их нечувствительными к воздействиям на стадиях с подводом большого количества энергии, например, при стерилизации или размоле.

Кроме того, обе кристаллические формы I и II в основном стабильны при изменении содержания воды, вследствие чего уменьшаются затруднения при изготовлении композиций, поскольку уменьшаются изменения массы активного ингредиента во время дополнительной фармацевтической обработки (например, таблетирования, капсулирования и т.п.).

Кроме того, определена растворимость кристаллических форм в насыщенном растворе. По этим данным форма II растворима лучше, чем форма I; в свою очередь, обе формы явно лучше растворимы, чем дигидрат, описанный в US 6489326 B1. Новые кристаллические формы обеспечивают преимущество по сравнению с предшествующим уровнем техники, поскольку увеличенная и очень высокая растворимость в растворах для инъекции позволяет вводить меньшие объемы и обеспечивает улучшенную обработку препаратов для местного применения, таких как кремы, обладающие низким содержанием воды.

Таблица 6
Данные по растворимости формы I и формы II в воде при комнатной температуре по сравнению с дигидратом, описанным в US 6489326 B1, полученным в соответствии с US 6489326 B1.
Форма I Форма II Дигидрат, US 6489326 B1
227 мг/мл 252 мг/мл 168 мг/мл

Об относительно лучшей растворимости формы II также свидетельствуют данные по начальной скорости растворения. Эти данные получены с помощью проводимого in situ исследования посредством ИК-спектроскопии с нарушенным полным отражением, проводимого с интервалами по 15 с, формы I и II добавляют через 5 мин после начала измерений. Полное растворение 0,25 г формы I или формы II соответственно в 10 мл деминерализованной H2O VE обеспечивалось при перемешивании (500 об/мин) при 25°C. Установлено, что скорость растворения формы II в первую минуту после добавления в водный раствор больше, чем для формы I, для которое замедлено установление полной равновесной концентрации. Различные растворимости и начальные скорости растворения форм I и II (фиг. 4) могут быть обусловлены различием структур поверхности (фиг. 1). Морфологически неоднородные скругленные кристаллиты формы I обладают явно более компактной структурой поверхности, чем октаэдрические кристаллы формы II, у которых вследствие формы для растворителя доступна более значительная площадь поверхности. Различия начальных скоростей растворения форм I и II особенно важны для приготовления композиций для перорального введения, поскольку меньшая скорость растворения формы I обеспечивает преимущества, когда необходимо замедленное высвобождение активного ингредиента (композиции замедленного высвобождения). Более значительная скорость растворения формы II обеспечивает преимущества для приготовления композиций быстрого воздействия для перорального введения, когда необходимо наиболее быстрое воздействие и наибольшая возможная биологическая доступность.

Различия термической стабильности форм I и II обусловлены разной стехиометрической координацией катиона натрия и молекул люминолата. В то время как в форме I катион натрия координируется с помощью внутримолекулярных водородных связей всего с 6 молекулами люминолата в тригональной призме, в форме II содержится только 4 молекул люминолата, которые с помощью внутримолекулярных водородных связей расположены в тетраэдрической конфигурации. Это приводит к термически более прочной и более стабильной координации формы II, чем для формы I. Применение в медицине:

Согласно изобретению с помощью экспериментальных исследований in vitro и in vivo неожиданно было установлено, что кристаллические формы I и II обладают заметно разным иммунологическим воздействием.

Кроме того, согласно изобретению было установлено, что вследствие их разного иммуномодулирующего воздействия формы I и II можно использовать более специфическим образом, чем в предшествующем уровне техники: В то время как форма II обладает иммуномодулирующим, в основном депрессивным воздействием на некоторые цитокины, форма I обладает в основном иммуностимулирующим воздействием на некоторые цитокины. Поэтому форма II является особенно подходящей для применения в терапии в случае патологических состояниях с чрезмерными иммунными ответами, форма I является особенно подходящей для применения в терапии в случае показаний, сопровождающихся иммунодефицитом.

В особенности в случае хронических заболеваний (например, рассеянного склероза, гепатита C, хронических энтеритов и колитов) иммунный статус пациента всегда может меняться, так что становится целесообразным переход от иммуностимулирующей к иммунодепрессивной терапии или от иммунодепрессивной к иммуностимулирующей терапии, или одновременное или проводимое с интервалом применение обоих подходов (см. DMSG 2006: Aktuelle Therapieempfehlungen September 2006). Поэтому приведенный ниже перечень может быть только примерным, отнесение заболевания к патологическим состояниям с чрезмерными иммунными ответами не исключает его лечения формой II или комбинациями формы I и формы II, и отнесение заболевания к патологическим состояниям, сопровождающихся иммунодефицитом, не исключает его лечения формой I или комбинациями формы I и формы II.

Патологическими состояниями с чрезмерными иммунными ответами являются, например, реакции отторжения после трансплантации, активные аутоиммунные заболевания (в частности, активный ревматоидный артрит, рецидивирующий рассеянный склероз, волчаночный гепатит, нодозный полиартериит, болезнь Крона, язвенный колит, дерматомиозит, болезнь Бехчета, увеит, тромбоцитопеническая пурпура, злокачественная миастения, полимиозит, псориаз, псориатический артрит, болезнь Бехтерева, пароксизмальная ночная гемоглобинурия, анкилозирующий спондилит, аутоиммунный тиреоидит и т.п.), апластическая анемия, пемфигус, пемфигоид, экзогенный увеит, нефротический синдром и атопический дерматит и особенно предпочтительно септические патологические состояния, вызванные бактериальными инфекциями с грамотрицательными или грамположительными патогенами, такими как, например, MRSA (резистентный к метициллину Staphylococcus aureus) и синдром системного воспалительного ответа (SIRS), вызванный другими факторами (например, иммунологическими или хмическими) грипп.

Патологическими состояниями, сопровождающимися иммунодефицитом являются, например, частый грипп, рецидивирующие инфекции дыхательных путей, рецидивирующие инфекции выводящих мочевых путей, усталость, слабость, рассеянность неизвестного генеза, реконвалесценция, хронические вирусные инфекции (в частности, ВИЧ, гепатит B, гепатит C, энцефалит, опоясывающий герпес, простой герпес, инфекции внутреннего уха, ветряная оспа, корь, цитомегалия, болезни Эпштейна-Барра), различные онкологические заболевания (в частности, волосатоклеточный лейкоз, миелолейкоз, множественная миелома, фолликулярные лимфомы, саркома Капоши, кожная T-клеточная лимфома, носоглоточная карцинома, карциноид, почечноклеточная карцинома, карцинома мочевого пузыря, базально-клеточные карциномы, метастатические карциномы и в особенности злокачественная меланома), септический гранулематоз, нейтропения, остроконечные кондиломы, кератозы, аутоиммунные заболевания (в частности, неактивные стадии, такие как, например, рецидивирующий рассеянный склероз между обострениями), радиогенный колит, дивертикулит, аллергии (в частности, сенная лихорадка, полиморфная сыпь при воздействии света, экзема, нейродермит), энтерит, колит, а также в особенности наблюдающиеся до, во время и после химиотерапии и лучевой терапии.

Согласно изобретению неожиданно было установлено, что путем простого использования конкретных кристаллических форм натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, предпочтительно полиморфных форм безводной формы, особенно предпочтительно формы I и формы II, обеспечиваются разные воздействия. Эти разные воздействия позволяют специфически применять иммуномодулирующие средства для в основном иммуностимулирующих (форма I) или в основном иммунодепрессивных (форма II) целей, обе формы в основном воздействуют на иммунную систему регулирующим образом, Таким образом, согласно изобретению с помощью исследований in vitro и in vivo неожиданно было установлено, что форма I обладает иммуностимулирующим воздействием.

В отличие от этого, форма II обладает иммуномодулирующей способностью, которая благоприятна для активированных макрофагов. Согласно изобретению на основании исследованных in vitro стимулированных посредством ЛПС макрофагов можно было, в частности, установить, что форма II обладает в основном иммунодепрессивной способностью. Таки образом обеспечено явное уменьшение содержания IL-6. С помощью исследований мышей in vivo (модель сепсиса с использованием S.pyogenes) также можно было подтвердить значительную терапевтическую эффективность формы II.

Кроме того, согласно изобретению по изменению массы и содержанию ферментов печени у здоровых мышей можно было показать, что новые формы I и II нетоксичны или обладают лишь небольшой токсичностью. Обе формы действуют иммуномодулирующим образом, не являясь только иммуностимулирующими или только иммунодепрессивными. Форма I, а также форма II приводят к более высокой выживаемости в модели сепсиса.

Авторы настоящего изобретения полагают, что одновременное, предпочтительно проводимое с интервалом введение формы I и формы II также может быть успешным и что при некоторых показаниях, в частности, но не исключительно при аутоиммунных заболеваниях, одновременное введение предпочтительнее раздельного введения.

Пример 1 - Влияние формы I на стимулированные посредством ЛПС макрофаги мышей in vitro.

При исследовании изолированных макрофагов мышей иммуномодулирующее воздействие формы I изучали in vitro на основе измерения концентрации ФНО-альфа или IL-6 в надосадочных жидкостях. Для этого макрофаги сначала обрабатывали формой I (20 или 200 мкг/мл). Через 1 ч обработанные макрофаги стимулировали посредством ЛПС (10, 100 или 1000 нг/мл). Надосадочные жидкости собирали через 24 ч и измеряли концентрацию ФНО-альфа и IL-6. Нестимулированные макрофаги, нестимулированные макрофаги, обработанные с помощью 200 мкг/мл формы I, и стимулированные посредством ЛПС макрофаги (10, 100 или 1000 нг/мл ЛПС) использовали в качестве контролей. Измеренные значения приведены в таблице 7.

При введении только ЛПС (при концентрациях, равных 1 мкг/мл, 100 нг/мл и 10 нг/мл) данные измерений концентрации ФНО-альфа, приведенные в таблице 7, указывают на зависимое от дозы стимулирование посредством ЛПС.

Таблица 7
ФНО-альфа (нг/мл) IL-6 (нг/мл)
Доза ЛПС N СЗ СТО СЗ СТО
ФНО-альфа (нг/мл) IL-6 (нг/мл)
Доза ЛПС N СЗ СТО СЗ СТО
Форма I 20 мкг 1 мг/мл 6 47,91 3,89 22,67 2,21
200 мкг 1 мг/мл 6 32,53 4,44 15,95 3,84
20 мкг 100 нг/мл 6 27,17 4,77 19,67 3,76
200 мкг 100 нг/мл 6 16,47 4,07 10,88 2,09
20 мкг 10 нг/мл 6 13,27 5,99 6,05 4,30
200 мкг 10 нг/мл 6 20,74 7,57 7,19 5,56
Контроль I (без стимулирования) 3 0,00 0,00 0,00 0,00
Контроль II (200 мкг/мл формы I) 200 мкг/мл 6 7,98 6,53 0,24 0,41
Контроль III (1 мкг/мл ЛПС) 1 мкг/мл 3 50,97 6,59 28,62 2,07
Контроль III (100 нг/мл ЛПС) 100 нг/мл 3 32,32 2,10 26,97 4,42
Контроль III (10 нг/мл ЛПС) 10 нг/мл 3 25,36 5,61 27,70 4,02

В группах, в которых применяли комбинированные средства, в которых использовали ЛПС и обработанные формой I макрофаги, для всех групп, в которых использовали ЛПС, можно было наблюдать зависимое от дозы иммунодепрессивное воздействие формы I. Этот эффект был наиболее явным при комбинировании с 100 нг/5 мл макрофагов, стимулированных посредством ЛПС и обработанных с помощью 200 мкг/мл формы I, кроме того, происходило значительное уменьшение концентрации ФНО-альфа при комбинировании 1 мкг/мл ЛПС с 200 мкг/мл формы I.

Кроме того, для контрольной группы, содержащей нестимулированные макрофаги, обработанные с помощью 200 мкг/мл формы I, можно было наблюдать, что подтверждено измеренными значениями концентраций ФНО-альфа, явное иммуномодулирующее, в данном случае иммуностимулирующее воздействие.

Пример 2 - Влияние формы II на стимулированные посредством ЛПС макрофаги мышей in vitro.

В другой модели in vitro с использованием макрофагов костного мозга (мышей) можно было подтвердить иммуномодулирующее, в основном иммунодепрессивное воздействие формы II. Для этого изолированные макрофаги костного мозга мышей сначала обрабатывали формой II при концентрациях, равных 2, 20 или 200 мкг/мл, и через 1 ч после обработки стимулировали с помощью 100 нг/мл или 10 нг/мл ЛПС. Надосадочные жидкости собирали через 24 ч и измеряли концентрацию ФНО-альфа и IL-6. Нестимулированные макрофаги, нестимулированные макрофаги, обработанные с помощью 200 мкг/мл формы II, и стимулированные посредством ЛПС макрофаги (10 или 100 нг/мл ЛПС) использовали в качестве контролей. Измеренные значения приведены в таблице 8.

Таблица 8
ФНО-альфа (нг/мл) IL-6 (нг/мл)
Доза ЛПС N СЗ СТО СЗ СТО
Форма II 2 мкг 100 нг/мл 7 7,40 3,49 2,67 0,76
20 мкг 100 нг/мл 9 9,06 1,36 4,28 0,54
200 мкг 100 нг/мл 9 7,69 1,62 4,00 1,20
2 мкг 10 нг/мл 9 8,38 1,76 3,93 1,01
20 мкг 10 нг/мл 9 9,80 0,72 1,61 1,30
200 мкг 10 нг/мл 6 6,76 1,60 3,42 1,29
Контроль I (без стимулирования) 9 0,00 0,00 0,00 0,00
Контроль I (без стимулирования) 200 мкг/мл 9 0,00 0,00 0,00 0,00
Контроль 100 мкг/мл 9 12,46 1,70 4,47 1,67
Контроль 10 нг/мл 9 9,45 1,47 3,19 1,33

Значительное уменьшение концентрации ФНО-альфа можно было обнаружить в группе макрофагов, стимулированных посредством 100 нг/мл ЛПС, при всех концентрациях активного ингредиента. В группе макрофагов, стимулированных посредством 10 нг/мл ЛПС, можно было обнаружить значительное уменьшение концентрации ФНО-альфа при наибольшей концентрации активного ингредиента (200 мкг/мл).

Иммунодепрессивное воздействие формы II на стимулированные посредством ЛПС макрофаги также можно было обнаружить по значительному уменьшению концентраций IL-6. Их измеряли в комбинации 2 мкг/мл активного ингредиента и макрофагов, стимулированных посредством 100 нг/мл ЛПС, а также в группе макрофагов, стимулированных посредством 10 нг/мл ЛПС при концентрации активного ингредиента, равной 20 мкг/мл. Эти результаты согласуются с данными для IL-6 проведенного ранее in vitro пробного исследования с использованием макрофагов, для которых использовали другую комбинацию ЛПС и активного ингредиента (1 мкг/мл ЛПС и 100 мкг/мл) и которые также приводили к иммунодепрессивному воздействию формы II на стимулированные макрофаги мышей. Иммуностимулирующее воздействие на не индуцированные посредством ЛПС макрофаги невозможно было обнаружить.

Пример 3 - Изменение массы здоровых мышей.

В модели на мышах грамположительного сепсиса (инфицирование посредством S.pyogenes) исследовано применение в терапии кристаллических форм I и II натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона. Введение активного ингредиента проводили парентерально через 6 ч после инфицирования. Второе введение активного ингредиента проводили через 24 ч после первого введения. Исследование завершали через 48 ч после инфицирования. Для обеих форм (групп соединений) использовали три разные дозы. Мыши за одно введение получали 2, 20 или 200 мкг формы I или формы II в расчете на животное.

Кроме групп, получавших соединение (форму I и форму II) одна группа получала раствор поваренной соли (NaCl) вместо растворенных активных соединений и одна группа не получала никакого средства. Одновременно с инфицированными животными образовывали группы из неинфицированных животных.

Отдельные группы, подвергавшиеся лечению, включали по 5 животных и использовали 2 контрольные группы неинфицированных животных и 4 контрольные группы инфицированных животных и 4 группы, получавшие форму II, так что всего в исследовании были включены 180 животных.

Известно, что токсичность веществ, использующихся при исследовании на животных, в случае растущих мышей или крыс может повлиять на изменение массы. Данные по изменению массы (г) неинфицированных контрольных животных за два дня приведены в таблице 9.

Таблица 9
Доза N Изменение/увеличение массы (г)
СЗ СТО
Форма I (полная) 15 0,59 1,33
2 мкг 5 -0,49 0,81
20 мкг 5 1,48 1,58
200 мкг 5 0,79 0,73
Форма II (полная) 30 0,59 2,19
2 мкг 10 -0,14 1,79
20 мкг 10 1,43 2,14
Доза N Изменение/увеличение массы (г)
СЗ СТО
200 мкг 10 0,50 2,52
NaCl - 10 0,67 1,87
Контроль - 10 0,68 1,93
Всего - 65 0,62 1,89

Среди неинфицированных животных случаи гибели не наблюдались. Не обнаружены соответствующие различия изменений массы между группами. Поэтому можно допустить, что форма I, а также форма II нетоксичны или самое большее обладают очень низкой токсичностью.

Пример 4 - Изменение массы инфицированных мышей.

В модели сепсиса, описанной в примере 3, исследовали влияние кристаллических форм I и II натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона на изменение массы мышей, инфицированных посредством S.pyogenes. Изменение массы тела при острой инфекции может предоставить важную прогнозирующую информацию. Некоторые животные не выживают от конца второго дня до конца исследования. Примечательно, что изменение массы тела отдельных животных в течение первых 24 ч после инфицирования указывает на вероятность выживания до конца эксперимента после 48 ч, однако нет значимой корреляции. Поскольку отсутствуют данные по изменению массы за все время проведения эксперимента для животных, погибших в течение второго дня, в приведенной ниже таблице 10 в дополнение к изменению массы за все время проведения эксперимента приведены данные по изменению массы за первый день эксперимента.

Таблица 10
Доза Изменение/увеличение массы (г)
День 1 Полное
N СЗ СТО N СЗ СТО
Форма I (полная) 15 -0,25 0,39 12 -1,85 0,54
2 мкг 5 -0,64 0,21 4 -2,41 0,37
20 мкг 5 -0,09 0,31 4 -1,46 0,28
200 мкг 5 -0,03 0,32 4 -1,69 0,47
Форма II (полная) 60 -0,62 1,56 48 -1,86 1,65
2 мкг 20 -0,57 1,86 18 -2,02 1,34
20 мкг 20 -0,55 1,56 16 -1,69 0,85
200 мкг 20 -0,72 1,28 14 -1,86 2,56
NaCl - 20 -0,68 1,43 14 -1,77 1,89
Контроль - 20 -0,50 2,16 11 -1,85 1,21
Доза Изменение/увеличение массы (г)
День 1 Полное
N СЗ СТО N СЗ СТО
Всего - 115 -0,56 1,55 85 -1,84 1,51

Примечательно, что у мышей, которые получали форму I натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, обнаруживалось меньшее уменьшение массы за первые 24 ч после инфицирования, чем у животных контрольной группы. Это преимущество особенно значительно для доз формы I, равных 20 и 200 мкг. Это косвенное указание на примечательно более значительный коэффициент выживаемости для крыс в группе, получавшей соединение, не обнаружено для животных, которые остались живыми после второго дня.

Пример 5 - Вероятность выживания после инфицирования с помощью S.pyogenes.

В модели сепсиса, описанной в примере 3, исследовали влияние кристаллических форм II и I натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона на вероятность выживания мышей, инфицированных посредством S.pyogenes. Для разных групп обнаружены разные вероятности выживания в течение не менее 48 ч после инфицирования. Доли выживших животных указаны в таблице 11.

Таблица 11
Доза N Доля выживших мышей (%)
Форма I (полная) 15 80
2 мкг 5 80
20 мкг 5 80
200 мкг 5 80
Форма I (полная) 60 80
2 мкг 20 90
20 мкг 20 80
200 мкг 20 70
NaCl - 20 70
Контроль - 20 55
Всего - 115 74

Форма I и форма II приводят к увеличению доли выживших животных по сравнению с контрольными. Таким образом, можно допустить наличие положительного влияния на протекание сепсиса формы I, а также формы II, также независимо от соответствующего их специфического воздействия.

Пример 6 - Содержание возбудителей инфекции в крови и печени.

В модели сепсиса, описанной в примере 3, исследовали влияние кристаллических форм II и I натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона на содержание возбудителей инфекции в крови и печени у мышей, инфицированных посредством S.pyogenes. Исследование завершалось через 48 ч после инфицирования и определяли содержание возбудителей инфекции (КОЕ) в крови и печени в этот момент времени (см. таблицу).

Таблица 12
Доза Содержание возбудителей инфекции (КОЕ)
Кровь (log/мл) Печень (log/г)
N СЗ СТО N СЗ СТО
Форма I (полная) 12 6,37 1,20 12 6,41 0,65
2 мкг 5 7,00 1,49 4 6,56 0,97
20 мкг 5 6,33 1,06 4 6,57 0,37
200 мкг 5 5,77 0,94 4 6,09 0,55
Форма II (полная) 46 5,80 1,37 47 6,36 1,52
2 мкг 16 5,96 1,21 17 6,13 1,69
20 мкг 16 5,88 1,65 16 6,79 0,76
200 мкг 14 5,54 1,26 14 6,14 1,91
NaCl - 14 6,39 1,42 14 6,20 1,83
Контроль - 2 10? 6,50 1,03 10 6,86 0,55
Всего - 82 6,07 1,33 83 6,40 1,40

Форма II, а также форма I при наибольшей дозе приводит к примечательному уменьшению количества возбудителей инфекции в крови по сравнению с контролями. Авторы настоящего изобретения считают это доказательством лучшей борьбы с инфекцией в случае введения натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, в особенности формы II. Однако следует отметить, что для животных, погибших до завершения эксперимента, не определены данные по количеству возбудителей инфекции. Авторы настоящего изобретения полагают, что в случае определения количества возбудителей инфекции в более ранний период содержание возбудителей инфекции у погибших позднее животных должно быть особенно высоким и поэтому воздействие, оказанное формами I и II, должно быть выражено в еще большей степени.

Пример 7 - Цитокины у здоровых подопытных животных.

После введения формы I и формы II здоровым мышам, с помощью модели на животных, описанной в примере 3, исследовано, оказывает ли введение влияние и какое влияние на некоторые цитокины, в частности, на IL-6 и ФНО-альфа у мышей. Пробы крови отбирали через 48 ч в конце второго дня введения. Для IL-6 увеличение содержания не обнаружено ни в группе, получавших соединение, ни в контрольных группах. Результаты для ФНО-альфа приведены в таблице 13.

Таблица 13
Доза N ФНО-альфа (пг/мл)
СЗ СТО
Форма I (полная) 15 208,2 219,4
2 мкг 5 128,8 137,2
20 мкг 5 341,8 209,6
200 мкг 5 154,1 268,2
Форма I (полная) 30 5,65 30,93
2 мкг 10 0,0 0,0
20 мкг 10 0,0 0,0
200 мкг 10 16,94 53,58
NaCl - 10 23,66 74,81
Контроль - 10 0,0 0,0
Всего - 65 54,3 137,93

В то время, как после введения формы II и в контрольных группах не обнаружено соответствующего увеличения концентрации ФНО-альфа, после введения формы I обнаружено явное уменьшение концентрации по сравнению с другими группами. Этот эффект в наибольшей степени проявлялся при дозе, равной 20 мкг, данные для этой группы значимо отличались (p<0,001) от данных для контрольных групп, а также для групп, которые получали форму II. В этом случае специфическое иммуностимулирующее воздействие, проявляющееся у формы I, нельзя было обнаружить для формы II.

Пример 8 - Цитокины в модели сепсиса.

В модели сепсиса, описанной в примере 3, также исследовано влияние введения формы I и формы II на некоторые цитокины, в частности, на IL-6 и ФНО-альфа, у мышей, инфицированных посредством S.pyogenes. Пробы крови отбирали в конце исследования через 48 ч после инфицирования.

Поскольку можно показать, что увеличения содержания цитокина, вызванные инфекцией, сильно различаются, в некоторых случаях даже для контрольных групп (отрицательный контроль и NaCl) нельзя было объединить данные для разных контрольных групп.

Также следует отметить, что эти значения получены только для тех животных, которые после второго дня исследования дожили до конца эксперимента. Кроме того, авторы настоящего изобретения полагают, что у животных, которые погибли ранее, было очень высокое предположительно неприемлемое содержание IL-6.

Тем не менее, наблюдались отчасти явные тенденции к уменьшению содержания IL-6, которые, к сожалению, нельзя было подтвердить для всех одинаковых групп. Авторы настоящего изобретения в настоящее время исследуют другие модели на животных, которые лучше подходят для убедительного доказательства депрессивного воздействия формы II на цитокины даже in vivo.

Пример 9 - Ферменты печени/трансаминазы у здоровых подопытных животных.

После введения формы I и формы II здоровым мышам исследовано, оказывает ли введение влияние и какое влияние на некоторые ферменты печени, в частности, трансаминазы ГОТ (ACT) и ГПТ (АЛТ). Пробы крови отбирали в конце второго дня введения. В этом случае не обнаружены четкие различия между группами. Это подтверждает хорошую совместимость, показанную в примере 3.

Пример 10 - Ферменты печени/трансаминазы в модели сепсиса.

В модели сепсиса, описанной в примере 3, также исследовано влияние введения формы I и формы II на некоторые ферменты печени, в частности, трансаминазы ГОТ (ACT) и ГПТ (АЛТ), на мышей, инфицированных посредством S.pyogenes.

Пробы крови отбирали через 48 ч после инфицирования. При наличии инфекции в некоторых случаях могло наблюдаться сильное увеличение содержания ферментов печени. Аналогично значениям содержания цитокинов у инфицированных мышей, и в этом случае наблюдались значительные различия для одинаковых групп, так что общий анализ результатов не был возможен. Форма II в некоторых одинаковых группах проявляла склонность уменьшать содержания ферментов печени. Однако это наблюдалось не для всех одинаковых групп.

Однако не обнаружены существенные различия значений для разных групп. Таким же образом, как для количества возбудителей инфекции в примере 6 и для содержаний цитокинов в примере 8, наблюдалось смещение вследствие отсутствия данных для ранее погибших животных. Авторы настоящего изобретения полагают, что определение содержания трансаминаз через 24 ч обладает явным преимуществом для мышей, которых лечили натриевой солью 5-амино-2,3-дигидрофталазин-5 1,4-диона, в особенности формой II.

Получение кристаллических безводных форм I и II, предлагаемых в настоящем изобретении.

Ниже описано типичное получение кристаллических форм I и II.

Исходным веществом для всех примеров получения является люминол, известный в предшествующем уровне техники, который можно получить, например, по следующей схеме реакций:

Показан синтез люминола (iii) по реакции 3-нитрофталевой кислоты (i), которую можно восстановить в щелочной среде гидразином или одной из его солей, или другими подходящими восстановительными реагентами, например сульфитом аммония или триэтиленгликолем, с получением люминола через ангидрид 3-нитрофталевой кислоты (ii). Подходящие методики получения люминола приведены в публикации: Williamson, K.L. In: Macroscale and Microscale Organic Experiments; 2nd ed.; D.C. Heath: Lexington, MA, 1994. Другая методика, подходящая для получения люминола, в которой в качестве катализатора используется никель Ренея, описана, например, в US 6489326 B1.

В более предпочтительной методике исходный продукт, люминол, также можно получить, как это описано ниже, где с использованием указанных количеств эквивалентов, можно получить произвольные количества люминола:

Пример получения люминола.

1-я Стадия: 3-нитрофталевая кислота - гидразид 3-нитрофталевой кислоты

Размеры партий:

Вещество Количество эквивалентов Размер партии Количество [молей]
3-Нитрофталевая кислота 1 200 г 0,95
Гидразингидрат (98%) 1,1 51 г (50 мл) 1,02
Этиленгликоль 1,5 (об./мас.) 300 мл N/A
Вода 6 (об./мас.) 1200 мл N/A
Вода для промывки 3×1,5 (об./мас.) 900 мл (3×300 мл) N/A

На первой стадии использовали 3-нитрофталевую кислоту (200 г, 0,95 моля) и гидразингидрат (51 г, 1,02 моля) и смешивали с этиленгликолем (300 мл) в колбе для проведения реакции объемом 2 л, снабженной комбинацией обратного холодильника (T=110°C) и холодильника Либига. Температуру повышали до 110°C и воду удаляли путем отгонки. Нагревание реакционной смеси продолжали до температуры кипения этиленгликоля, равной примерно 200°C. Через 1 ч вода больше не образовывалась. Смесь охлаждали примерно до 100°C и добавляли воду (1200 мл). Образовывался светло-коричневый осадок. Смесь охлаждали до комнатной температуры (25°C±5°C) путем добавления воды со льдом и перемешивали в течение ночи. Осадок отфильтровывали и промывали водой (3×300 мл). Влажный продукт сушили в роторном испарителе при 90°C/20±10 мбар до постоянной массы.

Преимуществом этой методики является то, что при использовании гидразингидрата вместо гидразинсульфата на следующих стадиях не образовывалось мешающее неорганическое вещество и что при использовании этиленгликоля, обладающего температурой кипения, равной примерно 196°C, регулирование при кипячении с обратным холодильником удобнее, чем при использовании других растворителей, обладающих более высокими температурами кипения, применение которых может привести к загрязнению продукта.

2-я Стадия: гидразид 3-нитрофталевой кислоты - 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-дион

Размеры партий:

Вещество Количество эквивалентов Размер партии Количество [молей]
Гидразид 3-нитрофталевой 1 100 г 0,48
Вещество Количество эквивалентов Размер партии Количество [молей]
кислоты
Дитионит натрия 3,6 300 г 1,73
NaOH (3M) 17 (об./мас.) 1700 мл N/A
Уксусная кислота 7,2 200 мл (210 г) 3.5
Вода для промывки 3×1,5 (об./мас.) 510 мл (3×170 мл) N/A

На второй стадии гидразид 3-нитрофталевой кислоты вводили в реакцию с 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-дионом, при этом гидразид 3-нитрофталевой кислоты (100 г, 0,48 моля) 48,3 ммоля) растворяли в 3 M растворе гидроксида натрия (1,700 мл) при нагревании примерно до 50-60°C. К этому раствору порциями добавляли дитионит натрия (300 г, 1,73 моля). После этого температура реакционной смеси повышалась примерно до 80°C. После завершения добавления дитионита натрия реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение примерно 4 ч. Добавляли уксусную кислоту (200 мл, 1,73 моля) и реакционную смесь охлаждали в течение ночи. Полученный осадок отделяли и промывали водой (3×170 мл). Продукт сушили в роторном испарителе примерно при 80°C/20±10 мбар.

Безводная форма I.

I. Пример получения I - кристаллическая форма I.

Объектом настоящего изобретения является способ получения безводной формы I путем смешивания 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона (люминола) с раствором гидроксида натрия и проводимого по каплям добавления этого раствора к обладающему низкой молекулярной массой жидкому спирту, предпочтительно этанолу, который уменьшает растворимость образовавшегося продукта, натриевой соли люминола, так что последняя начинает осаждаться. Спирты должны обладать чистотой, предпочтительно составляющей ≥95%, особенно предпочтительно ≥98%. В контексте настоящего изобретения образовавшийся осадок сушат при температурах от 50 и максимально до 90°C.

Пример получения I - кристаллическая форма I - вариант осуществления I.

В предпочтительном варианте осуществления примера получения I, кристаллическую форму I можно осадить путем смешивания 500-750 мл 0,8-1,2 М суспензии люминола с 500-750 мл 1,0-1,3 М раствора соды, смесь по каплям добавляют при 20-50°C при перемешивании к 10-15 л обладающего низкой молекулярной массой спирта, предпочтительно этанола, предпочтительно обладающего чистотой, составляющей ≥95%, особенно предпочтительно ≥98%, и затем суспензию перемешивают в течение 15-25 ч при 10-40°C. После отделения образовавшийся осадок предпочтительно сушат на воздухе. После дополнительной сушки при 50°C-80°C осадок растворяют в 10-20-кратном количестве обладающего низкой молекулярной массой спирта, предпочтительно этанола, обладающего чистотой, составляющей ≥95%, особенно предпочтительно ≥98%, и суспензию перемешивают в течение 15-25 ч при 10-40°C и фильтруют. Затем осадок на фильтре сушат на воздухе, повторно сушат при 50°C-90°C, предпочтительно при 50°C, измельчают в порошок и сушат до содержания кристаллизационной воды, составляющего ≤0,4%, предпочтительно ≤0,3%, наиболее предпочтительно ≤0,2%.

Пример получения I - кристаллическая форма I - вариант осуществления II.

a) В особенно предпочтительном варианте осуществления примера получения I кристаллическую форму I можно получить следующим образом:

b) 190-220 г Люминола помещают в стакан объемом 2 л и при перемешивании при температуре не ниже 20°C растворяют в 1,25 л 1,0-1,1 М раствора NaOH.

c) Порцию раствора фильтруют через фарфоровую воронку с фильтровальной бумагой 070 мм (например, Schleicher & Schuell Type 1575) без дополнительной промывки.

d) 12-14 л Этанола (предпочтительно обладающего чистотой, составляющей ≥98%) помещают в 3-гордую плоскодонную колбу. По каплям при перемешивании при 25°C±10°C в течение 25 мин ±10 мин добавляют порцию раствора. Суспензию перемешивают в течение 16±5 ч при 20°C±10°C.

e) Осадок фильтруют через фарфоровую воронку с фильтровальной бумагой и повторно промывают с помощью примерно 400-500 мл обладающего низкой молекулярной массой спирта, предпочтительно этанола, обладающего чистотой, составляющей ≥98%.

f) Тонкоизмельченный осадок на фильтре помещают в стеклянную чашку и сушат в вытяжном шкафу в течение ночи. Затем повторно сушат в сушильном шкафу при 50°C-90°C, предпочтительно при 50°C-70°C, особенно предпочтительно при 50°C до постоянной массы.

g) Измельчение в порошок и взвешивание осадка.

h) 12-15-Кратное количество (12-15 мл/г) осадка, полученного на стадии g), помещают в 3-горлую плоскодонную колбу в обладающий низкой молекулярной массой спирт (например, метанол, этанол, 2-пропанол, предпочтительно обладающий чистотой, составляющей ≥98%). Осадок суспендируют при перемешивании. Суспензию перемешивают в течение 16 ч±5 ч при 20°C±10°C. Суспензию фильтруют через фарфоровую воронку с фильтровальной бумагой и повторно промывают с помощью примерно 500 мл обладающего низкой молекулярной массой спирта.

i) Тонкоизмельченный осадок на фильтре помещают в стеклянную чашку и сушат в вытяжном шкафу в течение ночи. Затем сушат в сушильном шкафу в течение 2-6 ч при 50°C-70°C, предпочтительно при 50°C до постоянной массы. Вещество размалывают в ступке и взвешивают. Содержание кристаллизационной воды, определенное, например, по методике титрования Карла Фишера, должно составлять ≤0,4%,. Если содержание кристаллизационной воды составляет ≥0,4%, повторяют стадии h)-i).

j) Взвешивают вещество и определяют выход.

Пример получения I - кристаллическая форма I - вариант осуществления III.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления кристаллическую форму I можно получить следующим образом:

a) 200 г Люминола помещают в стакан объемом и при перемешивании при 30°C±10°C растворяют 1,25 л 1 М раствора NaOH.

b) Порцию раствора фильтруют через фарфоровую воронку с фильтровальной бумагой ⌀70 мм (например, Schleicher & Schuell Type 1575) без дополнительной промывки.

c) 12,5 л Этанола, предпочтительно обладающего чистотой, составляющей ≥99%, помещают в 3-горлую плоскодонную колбу объемом 20 л. По каплям при перемешивании при 25°C±5°C в течение 30 мин±5 мин добавляют порцию раствора. Суспензию перемешивают в течение 20 ч±1 ч при 25°C±5°C.

d) Суспензию фильтруют через фарфоровую воронку с фильтровальной бумагой ⌀185 мм (например, Schleicher & Schuell Type 1575) и повторно промывают с помощью примерно 500 мл этанола, предпочтительно обладающего чистотой, составляющей ≥99%. Тонкоизмельченный осадок на фильтре помещают в стеклянную чашку и сушат в вытяжном шкафу. Затем d сушат в сушильном шкафу при 50°C-70°C, предпочтительно при 50°C до постоянной массы.

e) Измельчение в порошок и взвешивание осадка.

f) 12-Кратное количество (12 мл/г) полученного осадка помещают в 3-горлую плоскодонную колбу в этанол, предпочтительно обладающий чистотой, составляющей ≥99%. Вещество суспендируют при перемешивании. Суспензию перемешивают в течение 20 ч±1 ч при 25°C±5°C. Суспензию фильтруют через фарфоровую воронку с фильтровальной бумагой ⌀185 мм (например, Schleicher & Schuell Type 1575) и повторно промывают с помощью примерно 500 мл этанола обладающего чистотой, составляющей ≥95%, предпочтительно ≥98%. Тонкоизмельченный осадок на фильтре помещают в стеклянную чашку и сушат в вытяжном шкафу. Затем сушат в сушильном шкафу при 50°C-70°C, предпочтительно при 50°C до постоянной массы. Продукт размалывают в ступке и взвешивают.

g) Содержание кристаллизационной воды, определенное, например, по методике титрования Карла Фишера, должно составлять ≤0,4%. Если содержание кристаллизационной воды составляет >0,4%, повторяют стадии f)-g).

h) Взвешивают вещество и определяют выход.

Пример получения II - кристаллическая форма I.

В водной среде с использованием люминола в качестве исходного вещества кристаллическую форму I можно получить путем приготовления раствора гидроксида натрия, к которому добавляют люминол. Люминол растворяют путем перемешивания. Затем в течение 10-40 мин добавляют этанол, люминол осаждается в виде соли. После завершения добавления и перемешивания в течение нескольких часов суспензию фильтруют, осадок на фильтре промывают и сушат.

Пример получения II - форма I - вариант осуществления II.

В предпочтительном варианте осуществления кристаллическую форму I получают с использованием указанных ниже количеств эквивалентов реагентов: Готовят раствор 1,0-1,4 экв. гидроксида натрия в 4-7 об./мас. воды, к которому добавляют 1 экв. люминола. Реакционную смесь перемешивают до обеспечения полного растворения. Затем при комнатной температуре (25°C±5°C) в течение примерно 10-40 мин по каплям добавляют этанол (50-70 об./мас.). Осаждается натриевая соль люминола.

После завершения добавления реакционную смесь повторно перемешивают в течение нескольких часов ч при комнатной температуре (25°C±5°C) и суспензию фильтруют; осадок на фильтре промывают этанолом (примерно 10-15 об./мас.) и либо сушат в вакуумном сушильном шкафу, либо в роторном испарителе.

Пример получения II - форма I - вариант осуществления III.

В особенно предпочтительном варианте осуществления кристаллическую форму I получают с использованием указанных ниже количеств эквивалентов реагентов:

Готовят раствор 1,0-1,4 экв. гидроксида натрия, предпочтительно 1,2 экв. гидроксида натрия (22 г, 0,55 моля), в воде (6 об./мас.) (в реакторе объемом 10 л).

1 экв. Люминола добавляют к раствору гидроксида натрия. Реакционную смесь перемешивают до обеспечения полного растворения. Получают прозрачный коричневый раствор.

Затем по каплям при комнатной температуре (25°C±5°C) в течение примерно 20 мин добавляют этанол (60 об./мас). Осаждается натриевая соль люминола.

После завершения добавления реакционную смесь повторно перемешивают в течение не более 20 ч, предпочтительно 2-8 ч, особенно предпочтительно 8 ч при комнатной температуре (25°C±5°C) и суспензию фильтруют; осадок на фильтре промывают этанолом (примерно 13 об./мас.) и либо сушат в вакуумном сушильном шкафу при 50-90°C/1-3 мбар, предпочтительно при 50-70°C, особенно предпочтительно при 50°C, либо в роторном испарителе при 20±10 мбар и 50°C-90°C, предпочтительно при 50°-70°C, особенно предпочтительно при 50°C.

Пример получения III - форма I - изменение размеров партии.

Согласно изобретению было установлено, что эти использованные соотношения эквивалентов являются подходящими для произвольных размеров партий люминола и обеспечивают получение искомой формы I воспроизводимым образом.

Безводная форма II:

Пример получения I кристаллической формы II.

Авторы настоящего изобретения разработали способ получения кристаллической формы II, в котором в водной среде люминол смешивают с раствором гидроксида натрия и путем добавления 2-пропанола уменьшают растворимость продукта, натриевой соли люминола, так что последняя начинает осаждаться. Осадившуюся натриевую соль люминола промывают 2-пропанолом и сушат до постоянной массы.

Пример получения I - кристаллическая форма II - вариант осуществления II.

В предпочтительном варианте осуществления кристаллическую форму II получают с использованием указанных ниже количеств эквивалентов реагентов. Готовят раствор 1,0-2,0 экв. гидроксида натрия, предпочтительно 1,1-1,4 экв. гидроксида натрия, особенно предпочтительно 1,2 экв. гидроксида натрия, в 6-7,5 об./мас. воды, к которому добавляют 0,5-1 экв. люминола. Реакционную смесь перемешивают до обеспечения полного растворения. Затем при комнатной температуре (25°C±5°C) в течение примерно 10-40 мин по каплям добавляют 2-пропанол (60-120 об./мас). Осаждается натриевая соль люминола. После завершения добавления реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре (25°C±5°C). Продукт отфильтровывают, промывают обладающим низкой молекулярной массой спиртом, предпочтительно 2-пропанолом (примерно 13-16 об./мас.) и либо сушат в вакуумном сушильном шкафу при 85°C-120°C/1-3 мбар, предпочтительно при 90°C/1-3 мбар, либо в роторном испарителе при 85°C-120°C/20±10 мбар.

Пример получения I - кристаллическая форма II - вариант осуществления III.

Для особенно предпочтительного варианта осуществления установлены количества эквивалентов и размеры партий для получения кристаллической формы II и они применимы для произвольных размеров партий люминола и в качестве примера приведены ниже для размера партии люминола, равного 10 г:

1,2 экв. Гидроксида натрия и 1 экв. люминола растворяют в воде (6 об./мас). Образуется прозрачный раствор. Этот раствор необходимо сразу же обработать, поскольку он темнеет. Затем добавляют 2-пропанол (60 об./мас.) при комнатной температуре (25°C±5°C) в течение примерно 20 мин и образуется осадок натриевой соли люминола. Суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 1-5 ч, предпочтительно 2 ч, особенно предпочтительно 3 ч. Продукт отфильтровывают, промывают 2-пропанолом (примерно 15 об./мас.) и либо сушат в вакуумном сушильном шкафу при 85°C-120°C/1-3 мбар, предпочтительно при 90°C/1-3 мбар, либо в роторном испарителе при 85°C-120°C/20±10 мбар, предпочтительно при 90°C/20±10 мбар до постоянной массы.

Пример получения I кристаллической формы II - вариант осуществления IV.

Авторы настоящего изобретения также разработали способ, который является подходящим для размеров партий люминола, равных не менее 300 г, предпочтительно 400 г, особенно предпочтительно ≥500 г, и он описан в качестве примера для партии размером 785 г:

Готовят раствор 212 г (5,32 моля, 1,2 экв.) гидроксида натрия в 4700 мл воды (реактор объемом 80 л). Люминол (785 г, 4,43 моля) добавляют к раствору гидроксида натрия и перемешивают до обеспечения его растворения. Получают прозрачный коричневый раствор, в которому добавляют 2-пропанол (60 об./мас.) в течение 20 - 30 мин, предпочтительно 30 мин. Осаждается натриевая соль люминола. После завершения добавления смесь повторно перемешивают в течение не менее 10 ч, предпочтительно 12 ч, при комнатной температуре (25°C±5°C). Смесь фильтруют, осадок на фильтре промывают 2-пропанолом (13 об./мас.) и либо сушат в вакуумном сушильном шкафу при 85°C-120°C/1-3 мбар, предпочтительно при 90°C/1-3 мбар, либо в роторном испарителе при 85°C-120°C/20±10 мбар, предпочтительно при 90°C/20±10 мбар до постоянной массы.

Пример получения I - кристаллическая форма II - изменение размеров партии.

Согласно изобретению было установлено, что эти использованные соотношения эквивалентов являются подходящими для произвольных размеров партий люминола и обеспечивают получение искомой формы II воспроизводимым образом. При использовании более значительных количеств люминола (≥500 г) и объемов необходимо, чтобы длительность перемешивания была соответственно дольше, и таким образом обеспечивают наибольший возможный выход конечного продукта.

Пример получения II кристаллической формы II (перекристаллизация).

Согласно изобретению было установлено, что кристаллическую форму II можно получить путем перекристаллизации кристаллической формы I с использованием следующего количества эквивалентов: 2-пропанол (10 об./мас.) обладающий чистотой, составляющей 70-90%, предпочтительно 80-90%, особенно предпочтительно 90%, добавляют к раствору 1 экв. формы I и перемешивают в течение не менее 10-14 ч, предпочтительно 10-12 ч, при комнатной температуре (25°C±5°C). Смесь фильтруют, и осадок на фильтре промывают 2-пропанолом (примерно 20 об./мас.) и либо сушат в вакуумном сушильном шкафу при 85°C-120°C/1-3 мбар, предпочтительно при 90°C/1-3 мбар, либо в роторном испарителе при 85°C-120°C/20±10 мбар до постоянной массы.

Пример получения II кристаллической формы II - перекристаллизация формы I - изменение размеров партии.

Методику перекристаллизации, разработанную авторами настоящего изобретения, можно применять с использованием указанных ниже количеств эквивалентов для произвольных размеров партии, в качестве примера приведено описание для размера партии формы I, равного 1 г:

Кристаллическую форму I (1 г) суспендируют в водном растворе 2-пропанола (10-20% воды) и перемешивают в течение не менее 10 ч, предпочтительно 10-14 ч, особенно предпочтительно 10-12 ч при комнатной температуре (25°C±5°C). После отфильтровывания оставшихся растворителей осадок на фильтре промывают 2-пропанолом (2×10 мл) и сушат в роторном испарителе при 90°C/20 мбар до постоянной массы.

Перечень аббревиатур:

мкг микрограмм
АЛТ аланинаминотрансфераза
ACT аспартатаминотрансфераза
КОЕ колониеобразующие единицы
DMSG Ассоциация рассеянного склероза Германии
ЕМЕА Европейское медицинское агентство
г грамм
ГОТ глутамат оксалацетаттрансаминаза
ГПТ глутамат пируваттрансаминаза
IL интерлейкин
л литр
loc.cit. в процитированном месте
ЛПС липополисахарид
мл миллилитр
СЗ среднее значение
нг нанограмм
пг пикограмм
СЭМ сканирующий электронный микроскоп
СТО стандартное отклонение
ФНО фактор некроза опухоли
Ед международные единицы
об./мас. единица объема на единицу массы.

1. Кристаллические формы I или II натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, отличающиеся тем, что они обладают следующими значениями кристаллографических характеристик, определенными с помощью порошковых рентгенограмм:
значения d: 13,5; 6,9; 5,2; 4,6; 3,9; 3,5; 3,4; 3,3; 3,1; 3,0 и
значения 2-тета: 6,5; 12,7; 16,9; 19,3; 22,8; 25,8; 26,6; 27,2; 28,7; 30,3
для формы I
и
значения d: 12,9; 7,9; 7,1; 6,5; 5,3; 4,0; 3,7; 3,6; 3,3; 3,2 и
значения 2-тета: 6,8; 11,2; 12,5; 13,7; 16,7; 22,4; 24,3; 24,9; 27,2; 27,8
для формы II,
дополнительно отличающиеся тем, что они обладают температурой разложения большей или равной 335°C±10°C.

2. Кристаллическая форма I по п. 1, отличающаяся тем, что она обладает содержанием кристаллизационной воды, составляющим ≤0,4%.

3. Кристаллическая форма I или II по п. 1 для применения в способе модуляции иммунной системы.

4. Способ получения кристаллической формы I натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона по п. 1 или 2, отличающийся тем, что смешивают 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-дион с раствором гидроксида натрия, где приготовленный раствор добавляют к этанолу, тем самым уменьшают растворимость образовавшегося продукта, натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, так что последняя осаждается, где осадившийся кристаллический продукт отделяют и сушат, где кристаллическую форму I можно суспендировать несколько раз в этаноле, перемешать, повторно промыть этанолом и еще раз высушить.

5. Способ получения кристаллической формы I по п. 4, отличающийся тем, что используют этанол, обладающий чистотой, составляющей ≥98%, и добавляют при комнатной температуре в течение 10-40 мин.

6. Способ получения кристаллической формы I по п. 4 или 5, включающий стадии:
a) приготовление смеси 1,0-1,4 экв. гидроксида натрия с 4-7 экв. (об./мас.) воды;
b) добавление к этой смеси 1 экв. люминола и перемешивание до обеспечения полного растворения;
c) добавление 50-70 экв. (об./мас.) этанола, обладающего чистотой, составляющей ≥98%, при комнатной температуре (25°C±5°C) в течение 10-40 мин;
d) после завершения добавления этанола повторное перемешивание реакционной смеси при комнатной температуре в течение не более 20 ч и фильтрование этой смеси;
e) промывка осадка на фильтре с помощью 10-15 экв. (об./мас.) этанола, обладающего чистотой, составляющей ≥98%;
f) сушка продукта в вакуумном сушильном шкафу при 50-90°C/1-3 мбар или в роторном испарителе при 20±10 мбар и 50°C - 90°C до постоянной массы.

7. Способ получения кристаллической формы II натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона по п. 1, отличающийся тем, что смешивают 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-дион с раствором гидроксида натрия и добавляют 2-пропанол, тем самым уменьшают растворимость образовавшегося продукта, натриевой соли 5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона, так что последняя осаждается, где осадившийся кристаллический продукт отделяют и сушат до достижения постоянной массы.

8. Способ получения кристаллической формы II по п. 7, отличающийся тем, что добавляют 2-пропанол при комнатной температуре в течение 10-40 мин.

9. Способ получения кристаллической формы II по п. 7 или 8, включающий стадии:
a) приготовление смеси 1,0-2,0 экв. гидроксида натрия с 6-7,5 экв. (об./мас.) воды;
b) добавление 0,5-1 экв. люминола и перемешивание этой смеси до обеспечения полного растворения;
c) добавление 60 экв. (об./мас.) 2-пропанола в течение примерно 20 мин при комнатной температуре (25°C±5°C);
d) перемешивание суспензии при комнатной температуре (25°C±5°C) в течение не менее 1 ч;
e) фильтрование и промывка осадка на фильтре с помощью 13-15 экв. (об./мас.) 2-пропанола;
f) сушка продукта либо в вакуумном сушильном шкафу при 85°C - 120°C/1-3 мбар, либо в роторном испарителе при 20±10 мбар и 85°C - 120°C до постоянной массы.

10. Фармацевтическая композиция, обладающая иммуномодулирующим действием, содержащая кристаллическую форму I и/или кристаллическую форму II по п. 1, характеризующаяся тем, что может включать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества.

11. Способ модуляции иммунной системы у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение пациенту кристаллической формы I и/или формы II по п. 1, характеризующийся тем, что пациент, нуждающийся в этом, испытывает септическое патологическое состояние.

12. Способ по п. 11, в котором септическое патологическое состояние вызвано бактериальными инфекциями с грамотрицательными или грамположительными патогенами.

13. Способ по п. 12, в котором бактериальная инфекция вызвана MRSA (резистентный к метициллину Staphylococcus aureus).

14. Способ по п. 11, в котором септическим патологическим состоянием является синдром системного воспалительного ответа (SIRS), вызванный иммунологическими или химическими факторами.

15. Способ по п. 11, в котором септическим патологическим состоянием является септический гранулематоз.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к соединениям, имеющим приведенную ниже общую формулу III, где: Q представляет собой C(Y3) или N; R представляет собой Н, -R1, -R1-R2-R3, -R1-R3 или -R2-R3; R1 представляет собой гетероарил или гетероциклоалкил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими С1-6алкилами, гидроксиС1-6алкилами, оксогруппами или галогенС1-6алкилами; R2 представляет собой -С(=O), -О, -C(R2′)2, -C(R2′)2С(=O), -C(R2′)2C(=O)NR2′, C(R2′)2 N(R2′)C(=O), -C(=NH), -C(R2′)2NR2′ или -S(=O)2; каждый R2′ независимо представляет собой H или С1-6алкил; R3 представляет собой Н или R4; R4 представляет собой C1-6алкил, C1-6алкоксигруппу, аминогруппу, С1-6алкиламиногруппу, ди(С1-6алкил)аминогруппу, гетероциклоалкил, С1-10алкилгетероциклоалкил, гетероциклоалкилС1-10алкил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими С1-6алкилами, C1-6алкиламиногруппами, ди(С1-6алкил)аминогруппами, гидроксигруппами, гидроксиС1-6алкилами, С1-6алкоксигруппами, оксогруппами или галогенС1-6алкилами; X представляет собой СН; X′ представляет собой СН; и остальные символы имеют значения, указанные в формуле изобретения.

Изобретение относится к способу получения О-люминолятов щелочных металлов. Способ включает взаимодействие 3-нитрофталевой кислоты с гидразингидратом с образованием 5-нитро-2,3-дигидро-1,4-фталазиндиона, последующее восстановление нитрогруппы и получение солей щелочных металлов.

Изобретение относится к 4-[3-(4-циклопропанкарбонил-пиперазин-1-карбонил)-4-фтор-бензил]-2Н-фталазин-1-ону в виде кристаллической Формы L, имеющей характеристические пики на порошковой рентгеновской дифрактограмме, приведенные в формуле изобретения, способам получения Формы L, фармацевтическому составу, содержащему Форму L, и вариантам применения Формы L и составов, содержащих Форму L.

Изобретение относится к 4-[3-(4-циклопропанкарбонилпиперазин-1-карбонил)-4-фторбензил]-2Н-фталазин-1-ону в виде кристаллической формы А, а также к способам его получения и фармацевтической композиции для ингибирования PARP на его основе.

Изобретение относится к области органической химии, медицины и ветеринарии, конкретно к способу получения лекарственного средства натриевой соли 5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндиона восстановлением 3-нитрофталевой кислоты гидразингидратом в щелочной среде в присутствии никелевого катализатора, взаимодействием полученной 3-аминофталевой кислоты с гидразингидратом в среде уксусной кислоты с последующей обработкой металлическим цинком в щелочной среде при нагревании и гидроксидом натрия в среде этилового спирта при нагревании.

Изобретение относится к циклическим биоизостерам производных пуриновой системы, имеющих общую структурную формулу, приведенную ниже, где R1=-Н, -NH2, -Br, -Cl, -ОН, -СООН; А=-N- при В=-N=, Z=-СН-; А=-СН= при В=-N=Z=-СН-; А=-СН= при В=-N=, Z=-N=; А=-СН= при В=-СН=, Z=-СН=; А=-СН= при В=-СН=, Z=-N=, за исключением соединений, в которых А=-СН= при В=-СН=, Z=-СН=, R=Li, Na или К и R'=-NH2 в 5-ом положении бензо[d]-3Н-пиридазин-1,4-дионового ядра, и его фармакологически приемлемым солям, обладающим нормализующим действием на внутриклеточные процессы.

Изобретение относится к применению в медицине или ветеринарии соединений, имеющих общую структурную формулу R1=-H, -NH 2, -Br, -Cl, -ОН, -СООН,B=-N=, -CH=, Z=-CH=, -N=, A=-N= при B=-N=, Z=-CH-,A=-CH- при B=-N=, Z=-CH-, A=-CH- при B=-N=, Z=-N=,A=-CH- при В=-СН=, Z=-CH=, A=-CH= при В=-СН=, Z=-N=.

Изобретение относится к конденсированному производному пиридазина, представленному формулой (I), или его фармацевтически приемлемым солям: где R1 представляет собой (1) атом водорода, (2) С2-8алкил, (3) гидрокси, (5) атом галогена, (3) С2-8ацил, (4) C 1-8алкокси, замещенный фенилом, или (5) С 2-8ацил, замещенный NR2R 3; R2 и R3 каждый независимо представляет собой (1) атом водорода или (2) С1-8алкил, Х и Y каждый независимо представляет собой (1) С, (2) СН или (3) N, является (1) одинарной связью или (2) двойной связью, является либо 5-7-членной карбоциклической, либо 5-7-членной частично или полностью насыщенной гетероциклической группами, определенными в п.1 формулы изобретения.

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтическому производству солей щелочных металлов 5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндиона и их смесей путем взаимодействия 5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндиона с гидроксидами щелочных металлов (Li, Na, К) или смеси этих металлов и последующего выделения целевых продуктов кристаллизацией из насыщенных растворов реакционной смеси.

Изобретение относится к медицине и касается применения пептида Семакс в качестве средства, активирующего адаптивный иммунитет для коррекции иммунного статуса и устранения дисбаланса провоспалительных и противовоспалительных факторов при заболеваниях центральной нервной системы, сопровождающихся нарушением иммунного ответа, включая инсульт.

Изобретение относится к области ветеринарной паразитологии и предназначено для терапии фасциолеза бычков. Способ включает использование политрема ас и иммуномодулятора - риботана по схеме: политрем ас в дозе 0,2 г/кг массы тела животного перорально с концентрированным кормом однократно, риботан подкожно в область средней трети шеи в течение 5 дней подряд в дозе 5,0 мл на голову.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к применению антигенной композиции, включающей антигенный пептид, происходящий из амилоидного белка или амилоидоподобного белка для лечения заболевания, состояния или расстройства, которое вызвано или связано с указанным белком, в популяции пациентов, страдающих от недостаточности Т-клеток при индукции иммунного ответа.

Группа изобретений относится к медицине и касается применения производного Аллоферона-1 Phe(p-NH2)-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly в качестве средства, обладающего высокой иммуномодулирующей и противовирусной активностью.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой питательную композицию для стимулирования у человека по меньшей мере одного типа клетки врожденного иммунитета, содержащую источник жиров или липидов, источник белков и лактоферрин, присутствующий на уровне по меньшей мере 10 мг/100 ккал и произведенный отличным от человеческого организма источником, при этом лактоферрин характеризуется по меньшей мере 48% гомологией с аминокислотной последовательностью AVGEQELRKCNQWSGL в фрагменте (349-364) HLf, где введение питательной композиции стимулирует по меньшей мере один тип клетки врожденного иммунитета, выбранной из группы, состоящей из макрофагов, нейтрофилов, дендритных клеток и их комбинаций.

Группа изобретений относится к медицине и касается композиции для подкожного введения, содержащей ПЭГинтерферон альфа и вспомогательные вещества, в частности, динатрия эдетата дигидрат, натрия ацетата тригидрат, уксусную кислоту ледяную, осмотический агент.

Изобретение относится к новым соединениям формулы (I), которые обладают свойствами ингибитора HCV NS5B РНК-полимеразы. Соединения могут быть использованы для лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита С (HCV). В формуле (I) : X представляет собой СН или N, R1 выбран из группы, состоящей из R1a, R1c: где R1a возможно замещен C1-6алкилом, C1-6алкокси или гидрокси, и где R1c возможно замещен C1-6алкилом; R2 представляет собой (а) арил, выбранный из фенила, или (б) NRaRb, где указанный арил возможно замещен (CH2)nNRcRd; Ra и Rb вместе с атомом азота, к которому они присоединены, представляют собой 5-членный циклический амин, замещенный группой (CH2)nNRcRd, где n означает число от нуля до двух; Rc и Rd независимо представляют собой водород, O2SR4, где R4 представляет собой C16алкил; R3 представляет собой CR4aR4bR4c, где: 1) R4a, R4b и R4c независимо выбраны из С1-3алкила.

Группа изобретений относится к ветеринарии, а именно к способу иммунной активации для повышения вылупляемости оплодотворенного куриного яйца, зараженного Е. coli.

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии и неонатологии, и может быть использовано для лечения конъюгационных гипербилирубинемий у детей раннего возраста.

Группа изобретение относится к области ветеринарии и предназначена для повышения резистентности новорожденных телят и поросят. Заявленный способ получения препарата включает применение неспецифического иммуноглобулина, выделенного из сыворотки крови животных путем обработки полиэтиленгликолем с включением микроэлементов.

Изобретение относится к применению веществ, которые обладают ингибирующей способностью для лечения гиперпролиферативных заболеваний. Изобретение касается применения соединения, представляющего собой 1-[(4-метилхиназолин-2-ил)метил]-3-метил-7-(2-бутин-1-ил)-8-(3-(R)-аминопиперидин-1-ил)-ксантин или его соли для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения гиперпролиферативных заболеваний, которые реагируют на ингибирование БАФ (белок-активатор фибробластов), выбранных из группы, включающей цирроз или нарушения заживления ран, лечение акне и пролиферативных заболеваний кожи, таких как, например, псориаз.
Наверх