Способ количественной цитохимической оценки хромаффинной реакции эритроцитов крыс при общем охлаждении организма

Авторы патента:

Горбунов Михаил Анатольевич (RU)

Зиновьев Сергей Викторович (RU)

Селиверстов Сергей Сергеевич (RU)

Целуйко Сергей Семенович (RU)

G09B23/28 - в медицине

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

A61B5/153 - Измерение для диагностических целей (радиодиагностика A61B 6/00; диагностика с помощью ультразвуковых, инфразвуковых и звуковых волн A61B 8/00); опознание личности

Владельцы патента RU 2617201:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Амурская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к количественной гистохимической оценке адаптации организма к воздействию низкой температуры окружающей среды. Для этого устанавливают холодовую анестезию у экспериментального животного путем количественной цитохимической оценки хромаффинной реакции эритроцитов крыс при общем охлаждении организма. Способ включает охлаждение крыс, забор у них крови из легочной вены после ее флеботомии в воротах левого легкого. Изготавливают мазок крови на предметном стекле, окрашивают сначала 5% спиртовым раствором ализарина красного С, затем 5% раствором бихроматом калия. Под микроскопом подсчитывают количество различно окрашенных эритроцитов в группе от 300 клеток. После этого рассчитывают средний цитохимический коэффициент СЦК по формуле:

в которой 1 балл - эритроциты не окрашены; 2 балла - гранулярная окраска периферии эритроцита, центральная часть клетки не окрашена; 3 балла - эритроциты целиком гранулярно окрашены. И при СЦК менее 2,4 устанавливают эффективную холодовую анестезию. Способ обеспечивает объективизацию оценки холодовой анестезии у животного, что позволяет проводить вивисекцию без использования наркосодержащих фармакологических средств. 1 пр., 1 табл.

Изобретение относиться к медицине, а именно к количественной гистохимической оценке адаптации организма к воздействию низкой температуры окружающей среды.

Известно, что ионы кальция участвуют в медиации процессов нейрогуморальной регуляции при экспериментальной гипотермии и анестезии холодом. Поэтому оценка снижения содержания в клетках организма концентрации катионов кальция и кальций-связывающих белков является одним из специфических и уже классических критериев развития экспериментальной гипотермии у ряда животных (крысы) /1. К.П. Иванов, Н.К. Арокина, И.Л. Потехина. Стимуляция физиологических функций у крыс при глубокой гипотермии без отогревания с помощью введения в желудочки мозга ЭДТА // Российский физиологический журнал. - 2005. - Т. 91, №3. - С. 286-292; 2. Г.С. Федоров, Н.К. Арокина. Развитие гипотермии у крыс при повышении [Ca2+] в крови // Российский физиологический журнал. - 2007. - Т. 93, №10. - С. 1171-1180/.

Гистохимическое окрашивание органов с помощью ализарина красного C (ETON-alizarin) является методом выявления кальция в клетках и тканях /3. Victor G. Springer and G. David Johnson Use and Advantages of Ethanol Solution of Alizarin Red S Dye for Staining Bone in Fishes // Copeia, Vol. 2000, № 1, pp. 300-301)/.

Гистохимическая окраска легочных клеток ализарином красным C подтверждает специфичность выявления катионов кальция и натрия в легких с помощью гистохимической реакции с антимонатом /3. Патент RU (11) 2013145543, Целуйко С.С., Зиновьев С.В., Решодько Д.П., Попов С.В. Способ дополнительного электронноплотного контрастирования нуклеиновых кислот в ядре и цитоплазме при гистохимическом выявлении катионов натрия в ультраструктурах клеток и тканей/.

Известно, что хромаффинная реакция - это гистохимический способ выявления биогенных аминов в клетках, который осуществляется при окрашивании бихроматом калия /4. Г. Гайер Электронная гистохимия. - М. Мир. 1974. - 488 с./.

Известен также способ цитологического окрашивания ализарином красным С мазков периферической крови у крыс. В известном способе продукт цитохимической реакции обнаруживается в лейкоцитах и эритроцитах. В случае дополнительного окрашивания мазков периферической крови в растворе бихромата калия (K₂Cr₂O₇), этот метод является одним из подходов к оценке хромаффинной реакции в эритроцитах. /5. Зиновьев С.В. Гистохимическая характеристика клеток периферической крови при коррекции дигидрокверцетином общего переохлаждения организма в течение 10 дней // Материалы V Съезда врачей-пульмонологов Сибири и Дальнего Востока / под общ. ред. чл.-корр. РАМН В.П. Колосова. Благовещенск, 2013. - 180-163. 192 с./.

Недостаток предложенного способа заключается в том, что в нем не описан количественный подход к оценке обнаруженной цитохимической реакции в эритроцитах крыс на мазках крови.

В отличие от известного способа /5/, заявленный способ осуществляется после флеботомии легочной вены левого легкого, после чего изготавливается мазок крови. Количественная цитохимическая оценка хромаффинной реакции в эритроцитах выявляется после окраски ализарином красным С.

Задача изобретения заключается в создании способа, позволяющего объективизировать особенности количественной цитохимической оценки хромаффинной реакции эритроцитов крови крыс во время холодовой пробы.

Существо способа заключается в том, что животное подвергается экспериментальному воздействию общего охлаждения организма, а после экспериментального воздействия изучается цитохимический профиль мазков крови, полученный во время флеботомии легочной вены левого легкого, окрашенных раствором ализарина красного С и затем раствором бихромата калия.

Способ осуществляется следующим образом.

Сразу (не более чем через 30 секунд) после вивисекции производиться вскрытие грудной клетки крыс. В операционной ране производится осмотр ворот левого легкого.

Из левой легочной вены крыс берут кровь, необходимую для цитохимического исследования. Это делается с помощью флеботомии-венесекции левой легочной вены. Для этого с помощью хирургического зажима пережимается просвет легочной вены. Левое легкое приподнимается и помещается на предметное стекло, которое вводят в грудную клетку. Затем скальпелем рассекается просвет левой легочной вены, который расположен ближе к воротам левого легкого. Капля крови, поступившая из вен легкого, наносится на предметное стекло, после чего изготавливается цитологический мазок.

Мазки крови на предметных и покровных стеклах высушиваются на воздухе.

Окрашивание мазков крови ализариновым красным С производится в 5% спиртовом растворе (96% р-р этанола) ализаринового красного С. Минуя этап фиксации, мазки крови помещают в стеклянный стаканчик, заполненный 5% спиртовым раствором ализаринового красного С. Окраска и фиксация мазков крови проводится при комнатной температуре на протяжении 5 минут (время определяется эмпирически).

После окрашивания мазки крови быстро (5-10 секунд) ополаскиваются в дистиллированной воде, затем быстро ополаскиваются в 5% р-ре бихромата калия (5-10 секунд), потом быстро, но тщательно промываются в дистиллированной воде (от 5 до 30 секунд), затем мазки крови сушатся на воздухе.

Контроль исследования.

1. После высушивания мазков, их необходимо на 5 минут поместить в пары аммиака, (после чего краситель становится ярко-красным). Затем производится микроскопирование мазков крови.

2. В качестве контроля используется фиксация мазков в парах формалина, которая производится перед окрашиванием. Нами установлено, что формалин блокирует хромаффинную реакцию в эритроцитах, которая отмечается при окрашивании ализарином красным С и бихроматом мазков периферической крови.

3. Установлено, что добавление 3% р-ра динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈) в кровь во время изготовления мазка на предметном стекле, так же блокирует окрашивание ализарином красным С и бихроматом мазков периферической крови.

После окрашивания, под иммерсионным объективом ×100, производится микроскопия окрашенного мазка крови крыс. Оценка цитохимической реакции происходит по балам:

1 балл - эритроциты не окрашены;

2 балла - выявляется гранулярная окраска периферии (тора) эритроцита, центральная часть клетки не окрашена;

3 балла - эритроциты целиком гранулярно окрашены.

Подсчет цитохимической реакции ведется на 300 клетках. Во время исследования подсчитывается количество эритроцитарных клеток с различной выраженностью реакции. После чего по формуле рассчитывают средний цитохимический коэффициент - СЦК:

Пример использования.

Объектом исследования являлись белые крысы (Вистар) - самцы, в возрасте 4 месяца, весом 300-350 грамм.

Были созданы 5 групп экспериментальных животных.

1 гр. - интактные животные находились в помещении при температуре +25°C и 30% влажности воздуха.

Остальные группы животных подвергали экспериментальному воздействию холодом при - 15°C, в течение 3 часов в климатокамере Fentron (Германия), а именно: 2 гр. подвергалась экспериментальному воздействию 1 день; 3 гр. подвергалась экспериментальному воздействию 5 дней; 5 гр. подвергалась экспериментальному воздействию 10 дней. В каждой группе было по 10 животных.

Вивисекция животных осуществлялась путем цервикальной дислокации. Сразу (не более чем через 30 секунд) после вивисекции, производилось вскрытие грудной клетки крыс. Во время эксперимента производился осмотр ворот левого легкого. При исследовании ворот левого легкого крыс отмечается, что при общем охлаждении крыс развивается гиперемия легочных вен. В результате чего в воротах левого легкого обнаруживается полнокровие каудальной и краниальной легочных вен, которые после слияния с общей левой легочной веной впадают в левое предсердие. Критерием гиперемии являлось то, что краниальная легочная вена набухала и становилась доступной наблюдению без вооруженного глаза в воротах левого легкого. После этого делалась флеботомия (венесекция) левой легочной вены. Для этого с помощью зажима нейрохирургического типа «Москит» пережимался просвет легочной вены. Легкое приподымалось и укладывалось на предметное стекло, которое вводят в грудную клетку. Затем скальпелем рассекался просвет левой легочной вены, который расположен ближе к воротам левого легкого. Капля крови, поступившая из вен легкого, наносилась на предметное стекло, после чего изготавливался цитологический мазок. Затем производилось цитохимическое окрашивание мазков крови изложенным в изобретении способом.

Результаты цитохимического исследования мазков периферической крови крыс, которые отражают механизм экспериментального воздействия на организм, отражены в таблице 1.

Полученные данные говорят о том, что в ходе эксперимента развивается компенсированная гипотермия организма, и анестезия холодом у крыс. Это позволяет проводить вивисекцию и цитохимическое исследование крыс без использования нарко-препаратов.

Способ позволяет провести математический расчет СЦК хромаффинной реакции эритроцитов. При значении СЦК менее 2,4 прогнозируется кальций зависимый адренергический механизм медиации процессов нейрогуморальной регуляции ответа организма, во время формирования анестезии холодом при экспериментальной гипотермии.

Это указывает на позитивное решение способов вивисекции экспериментальных животных анестезией холодом.

Поэтому техническим результатом изобретения является то, что он подтверждает эффективность анестезии животных холодом, что позволяет проводить вивисекцию экспериментальных животных путем цервикальной дислокации без использования дорогостоящих наркосодержащих фармакологических средств.

Способ установления холодовой анестезии у экспериментального животного путем количественной цитохимической оценки хромаффинной реакции эритроцитов крыс при общем охлаждении организма, включающий охлаждение крыс, забор у них крови из легочной вены после ее флеботомии в воротах левого легкого, изготовление мазка крови на предметном стекле, его окрашивание сначала 5% спиртовым раствором ализарина красного С, затем 5% раствором бихроматом калия, исследование окрашенного мазка под микроскопом с подсчетом количества различно окрашенных эритроцитов в группе от 300 клеток, после чего по формуле рассчитывают средний цитохимический коэффициент СЦК:

где

1 балл - эритроциты не окрашены;

2 балла - гранулярная окраска периферии эритроцита, центральная часть клетки не окрашена;

3 балла - эритроциты целиком гранулярно окрашены,

и при СЦК менее 2,4 устанавливают холодовую анестезию у животного, позволяющую проводить вивисекцию без использования наркосодержащих фармакологических средств.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для изучения особенностей формирования химического ожога пищевода в эксперименте. Способ включает введение в пищевод животного, подобранного по величине просвета пищевода зонда, имеющего боковые отверстия, и доставку по зонду химического агента.

Способ моделирования процесса образования зубного камня из аналога раствора зубного налета // 2616251

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам экспериментального моделирования процессов, протекающих в полости рта человека, в частности, образования зубного камня.

Способ коррекции дисфункции факторов врожденного и адаптивного иммунитета при хронической почечной недостаточности в эксперименте // 2616213

Изобретение относится к экспериментальной медицине, иммунологии, патофизиологии, в частности к оценке изучения иммунопатогенетических особенностей хронической почечной недостаточности (ХПН) и методам коррекции данной патологии на модели лабораторных животных.

Способ моделирования лимфогенного и гематогенного метастазирования мышиной меланомы в16 у белых нелинейных крыс // 2615908

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано для моделирования лимфогенного и гематогенного метастазирования меланомы B16.

Способ моделирования локального снижения минеральной плотности костной ткани у кроликов // 2615902

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, в частности к изучению состояний, связанных с локальным снижением минеральной плотности костей. Для моделирования этого состояния у кроликов вначале выбирают кость для моделирования.

Способ моделирования светлоклеточного рака почки // 2615860

Изобретение относится к медицине, к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для моделирования светлоклеточного рака почки. Способ заключается в том, что крысам самкам проводят внутрибрюшинное введение формальдегида в дозе 1-1,5 мг/кг и фуросемида в дозе 0,8-1,7 мг/кг один раз в неделю в течение 2-3 недель.

Способ моделирования гипоксического поражения тканей глаза с активацией апоптоза // 2614937

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине. Для моделирования гипоксического поражения поверхностных тканей глаза и сетчатки, приводящего к активации апоптоза, проводят воздействие физического фактора на экспериментальное животное.

Модель ишемии спинного мозга у лабораторных животных // 2614885

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине. Для моделирования ишемии спинного мозга лабораторным животным, вводят наркозный препарат «Пропофол».

Способ моделирования сосудистой дистонии у крыс по гипотензивному типу // 2614521

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования сосудистой дистонии у крыс по гипотензивному типу. Для этого самцам крыс линии Wistar внутрибрюшинно однократно вводят множественно модифицированные липопротеины низкой плотности, приготовленные из сыворотки крови больных с атеросклерозом каротидных артерий, в дозе 200 мкг по белку.

Способ моделирования пузырчатки у мышей методом введения иммуноглобулинов класса g // 2613718

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной дерматовенерологии, и касается способа моделирования вульгарной пузырчатки. Для этого способ включает введение новорожденным мышам препарата иммуноглобулинов класса G (IgG), выделенных от больных вульгарной пузырчаткой.

Способ персонифицированного назначения стандартного или комбинированного режимов поддержки лютеиновой фазы в программе эко с использованием молекулярно-генетических маркеров // 2617047

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ персонифицированного назначения стандартного или комбинированного режимов поддержки лютеиновой фазы (ЛФ) в программе ЭКО.

Способ прогнозирования эффективности терапии эверолимусом у больных метастатическим раком почки // 2616533

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и касается прогнозирования эффективности терапии эверолимусом у больных с метастатическим раком почки. Для этого определяют phospho-m-TOR и дополнительно на дооперативном этапе лечения определяют содержание фактора, индуцированного гипоксией HIF-1α, сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF и его рецептора VEGFR2.

Способ оценки чувствительности опухоли к проводимой химиотерапии больных местно-распространенным раком молочной железы // 2616532

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для оценки эффективности химиотерапевтического лечения больных местно-распространенным раком молочной железы.

Способ диагностики аллергического ринита у детей, ассоциированного с токсическим действием формальдегида техногенного происхождения // 2616530

Изобретение относится к области медицины, к оториноларингологии, а именно к способам лабораторной диагностики токсического действия формальдегида, в виде проявления заболеваний аллергического ринита у детей, проживающих в условиях техногенной нагрузки среды обитания.

Способ прогнозирования риска кальцификации биологических протезов клапанов сердца, имплантированных в митральную позицию, на основании геномных предикторов // 2616507

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования риска кальцификации биологических протезов клапанов сердца, имплантированных в митральную позицию.

Способ прогнозирования риска развития миоматозных узлов больших размеров у пациенток с миомой матки // 2616246

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития миоматозных узлов больших размеров у пациенток с миомой матки.

Способ определения клеточного состава атеросклеротических бляшек // 2616243

Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной и молекулярной технологии, и может быть использовано в медицинских исследованиях в кардиологии для изучения клеточного состава в атеросклеротических бляшках с целью выявления иммунологических механизмов их созревания и разрыва.

Способ иммунологического анализа // 2616238

Изобретение относится к медицине и касается способа иммунологического анализа, включающего адсорбцию биоспецифических лигандов на поверхность частиц коллоидных растворов гексацианферрата железа (II) (III), последующее их соединение с подлежащим тестированию биоматериалом в разведенном водном солевом растворе, где в качестве водного солевого раствора используют или водный раствор хлорида рубидия, или водный раствор хлорида цезия.

3d in vitro двухфазный костно-хрящевой конструкт // 2615439

Изобретение относится к биотехнологии. Описан 3D in vitro двухфазный костно-хрящевой «органоид», содержащий слой искусственной хрящевой ткани/агрегатов хондрогенных клеток и слой искусственной костной ткани, где искусственная костная ткань содержит придающий структуру каркас и структуру костного мозга; где структура костного мозга в искусственной костной ткани получена путем посева мезенхимальных стволовых клеток на придающий структуру каркас и где слой искусственной хрящевой ткани/агрегатов хондрогенных клеток контактирует по меньшей мере с одной поверхностью слоя искусственной костной ткани, и способы его получения и применения.

Способ прогнозирования устойчивости к инотропной терапии у новорожденных с артериальной гипотензией путем выявления молекулярно-генетических предикторов // 2615407

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования устойчивости к инотропной терапии у новорожденных с артериальной гипотензией. Из образцов периферической крови выделяют ДНК.

Способ прогнозирования общей выживаемости у больных опухолью клатскина после хирургического лечения // 2617183

Изобретение относится к медицине, а именно к гепатобилиарной хирургии и онкологии, и может быть использовано для прогнозирования общей выживаемости у больных опухолью Клатскина после хирургического лечения.