Способ размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro



Способ размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro
Способ размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro

 


Владельцы патента RU 2617944:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт кормов имени В.Р. Вильямса" (RU)

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro, включающий выделение почек из поверхностно стерилизованных в течение 5 мин в 0,1%-ном водном растворе диоцида и 4-5 раз промытых в стерильной воде отрезков стеблей длиной 1,5-2.0 см с пазушными почками вегетирующих трансгенных растений клевера лугового и помещение их на агаризованную питательную среду Гамборга В5, где вначале отрезки стеблей с пазушными почками длиной 1,5-2,0 см промывают в проточной водопроводной воде (10 мин) и после поверхностной стерилизации при встряхивании отделенные пазушные почки культивируют на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП до размера не менее 4,0 мм, а затем 4 пассажа на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина до образования морфогенной ткани только с зелеными побегами, при этом размноженными трансгенными (канамицин устойчивыми) растениями являются растения-регенеранты клевера лугового, образовавшие корни не менее 50 мм на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина. Изобретение позволяет повторно вводить в культуру in vitro трансгенные растения клевера лугового, получать длительно культивируемую морогенную ткань, изучать экспрессию введенных генов в вегетативно размноженных трансгенных растениях клевера лугового. 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано для получения и поддержания коллекции трансгенных растений клевера лугового с ценными признаками, в исследованиях по физиологии и генетике растений.

Известен способ регенерации растений клевера лугового при генетической трансформации [1].

Регенерацию растений осуществляют из культивируемой трансформированной морфогенной культуры клевера на питательной среде Гамборга В5 с добавлением канамицина и цефотаксима, причем морфогенную культуру получают без образования дедифференцированной ткани путем культивирования гипокотиля на питательной среде Гамборга В5 с добавлением с 4,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), 1,0 мг/л кинетина и 0,05 мг/л α-нафтилуксусной кислоты (НУК) с дальнейшей пересадкой эксплантов на свежую среду того же состава с 2,0 мг/л БАП, а эпикотильную часть проростков сохраняют путем культивирования на среде Гамборга В5 без гормонов или путем микроразмножения на среде того же состава с добавлением 2,0 мг/л БАП.

К недостаткам данного способа можно отнести следующее. Использование как эпикотильной, так и гипокотильной частей проростков для размножения созданных трансгенных растений невозможно, так как полученные растения были бы следующего семенного поколения. Получение же растений-регенерантов из морфогенных культур 24-х и более пассажей иногда невозможно в связи с их гибелью в результате инфицированности. В связи с этим возникает необходимость повторного введения в культуру вегетирующих трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro.

Имеются методические указания по регенерации и размножению клевера лугового в культуре in vitro [2]. Регенерация растений клевера лугового осуществляется путем выделения почек из поверхностно стерилизованных в течение 5 мин в 0,1-ном водном растворе диоцида и 4-5 раз промытых в стерильной воде отрезков стеблей длиной 1,5-2,0 см с пазушными почками вегетирующих растений клевера лугового и помещения их на агаризованную питательную среду Гамборга В5.

К недостаткам этого способа можно отнести следующее. Питательная среда содержит уменьшенную вдвое концентрацию всех входящих в ее состав компонентов. Это способствует быстрой регенерации интактных растений клевера лугового с корнями, но не обеспечивает образования морфогенной ткани, необходимой для длительного поддержания в культуре in vitro коллекции трансгенных растений клевера лугового. Кроме того, размножение данным способом осуществляется на питательных средах, не содержащих селективный фактор - канамицин. Это значительно увеличивает риск получения в процессе размножения нетрансгенных растений.

Цель изобретения - разработка способа размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro, позволяющего повторно вводить в культуру in vitro трансгенные растения клевера лугового, получать длительно культивируемую морфогенную ткань, изучать экспрессию введенных генов в вегетативно размноженных трансгенных растениях клевера лугового.

В предлагаемом способе поставленная цель достигается тем, что выделенные из поверхностно стерилизованных в течение 5 мин в 0,1%-ном водном растворе диоцида и 4-5 раз промытых в стерильной воде отрезков стеблей длиной 1,5-2,0 см с пазушными почками вегетирующих трансгенных растений клевера лугового почки помещают на агаризованную питательную среду Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и культивируют до размера не менее 4,0 мм, а затем 4 пассажа на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина до образования морфогенной ткани только с зелеными побегами, при этом размноженными трансгенными (канамицин устойчивыми) растениями считаются зеленые регенераты клевера лугового, образовавшие корни не менее 50 мм на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина.

Способ осуществляется следующим образом.

Отрезки стеблей с пазушными почками длиной 1,5-2,0 см промывали в проточной водопроводной воде (10 мин) и поверхностно стерилизовали в течение 5 минут в 0,1%-ном водном растворе диоцида (при встряхивании). После стерилизации отрезки стеблей 4-5 раз промывали автоклавированной (стерильной) водой. Затем от них отделяли пазушные почки, которые помещали на агаризованную питательную среду Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП. После 3-4-х недель культивирования почки размером не менее 4 мм и без видимых признаков инфицированности помещали на питательную среду того же состава, но с добавлением 50 мг/л канамицина (селективного фактора). Морфогенную ткань, образующуюся из почек на селективной среде, делили на части, отбраковывая альбиносные побеги. После 4-х пассажей на селективной среде отбирали морфогенную ткань только с зелеными побегами. Образовавшиеся из них на селективной среде растения с корнями не менее 50 мм высаживали в вегетационные сосуды с почвой.

Пример 1.

Влияние размера эксплантов на выживаемость почек клевера лугового в культуре in vitro.

Проводили микроразмножение вегетирующих трансгенных растений клонов LGVac2 и Tr Топ12 клевера лугового, созданных с помощью генетических конструкций, содержащих селективный ген канамицинустойчивости [3]. Отрезки стеблей с почками брали с вегетирующих растений в фазе цветения. Поверхностно простерилизованные пазушные почки помещали по 30 шт. в чашки Петри с питательной агаризованной средой Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП. После 3-х недель культивирования часть неинфицированных эксплантов пересаживали на агаризованную среду Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина и без него. Все почки клевера лугового размером менее 4,0 мм на селективной среде к 20-му дню культивирования погибли (табл. 1), тогда как почки не менее 4,0 мм на той же среде оставались зелеными.

1. Влияние размера эксплантов на выживаемость почек клевера лугового в культуре in vitro

Таким образом, чем больше размер эксплантов (почки), помещенных на селективную среду с канамицином, тем больше (в 4,4-9,5 раз) выживших эксплантов к 3-4 неделе культивирования. При этом несколько возрастает число инфицированных эксплантов у LGVac2 и Tr Топ12 1,4-1,8 раз на селективной среде и в 1,7-2,2 раза в контроле (без канамицина). Однако в вариантах с эксплантом размером меньше 4,0 мм у LGVac2 не было ни одного зеленого экспланта и только 0,1% - у Tr Топ12, в то время как в вариантах с эксплантами не менее 4,0 мм как у LGVac2, так и у Tr Топ12 к 3-4 неделе культивирования на селективной среде число зеленых эксплантов отличалось от контроля на 15,4 и 0,2% соответственно.

Пример 2

Получение морфогенной ткани с зелеными побегами у трансгенных растений клевера лугового на селективной питательной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина.

Для получения морфогенной ткани с зелеными побегами на агаризованную питательную среду Гамборга В5 с 2 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина помещали почки зеленого цвета не менее 4,0 мм и субкультивировали несколько пассажей на среде того же состава до получения морфогенной ткани с зелеными побегами.

Почки зеленого цвета после повторного культивирования на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина формировали в зависимости от пассажа морфогенную ткань со смешанными (зелеными и альбиносными) или только зелеными побегами (табл. 2).

2. Получение морфогенной ткани с зелеными побегами у трансгенных растений клевера лугового на селективной среде с 50 мг/л канамицина

При каждом последующем пассаже на селективную среду того же состава помещали части морфогенной ткани только с зелеными побегами, которые через 20-25 дней культивирования формировали различное число морфогенных культур клевера лугового.

Количество морфогенных культур со смешанными побегами (зелеными и альбиносными) возрастало к 3-му пассажу с 0% до 43,4% и 39,1% и уменьшалось к 4-му до 8,3% и 10,1% у LGVac2 и Tr Топ12, соответственно, т.е. химерность морфогенных культур проявлялась только ко 2 и 3-му пассажу.

В связи с этим в 1-м пассаже наблюдались культуры только с зелеными побегами. При этом их число уменьшалось к 3-му пассажу до 49,1% и 59,4% в связи с проявлением химерности, а так как для каждого последующего пассажа отбирали части морфогенной ткани только с зелеными побегами, отбраковывая альбиносные побеги, то их число возрастало до 91,9% и 89,3% LGVac2 и у Tr Топ12 соответственно. После 4-х пассажей на селективной среде отбирали морфогенную ткань только с зелеными побегами. Образующиеся из них на селективной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина растения-регенеранты с корнями не менее 50 мм высаживали в вегетационные сосуды с почвой для получения семян.

Таким образом, для получения канамицинустойчивых трансгенных растений клевера лугового почки поверхностно стерилизуют и сначала культивируют на агаризованной питательной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП в течение 3-4 недель без селективного фактора, а затем 4 пассажа на среде того же состава, но с добавлением 50 мг/л селективного фактора канамицина. Растения-регенеранты с корнями не менее 50 мм получают на селективной среде из зеленых побегов морфогенной ткани, не имеющей альбиносных побегов из 4-го пассажа.

Разработанный способ позволяет повторно вводить в культуру in vitro трансгенные растения клевера лугового, получать длительно культивируемую морфогенную ткань, изучать экспрессию введенных генов в вегетативно размноженных трансгенных растениях клевера лугового.

Источники информации

1. Пат. 2305931 РФ, МПК А01Н 4/00, А01Н 5/00, A01G 7/00. Способ регенерации растений клевера лугового при генетической трансформации / Солодкая Л.А., Агафодорова М.Н., Куренина Л.В., Лапотышкина Л.И. (РФ). - №2005117826/13: заявлено 09.06.2005; опубл. 20.09.2007. - Бюл. №26. - 6 с.

2. Мезенцев А.В., Любавина Л.А. Методические указания по регенерации и размножению клевера лугового в культуре in vitro. – М., 1983. - 17 с.

3. Пат. 2420060 РФ, МПК А01Н 4/00. Способ генетической трансформации растений селекционно-ценных образцов клевера лугового. / Солодкая Л.А.. Лапотышкина Л.И., Клименко И.А., Агафодорова М.Н. (РФ). - №200914286/10: заявлено 18.11.2009; опубликовано 10.06.2011. - Бюл. №16. - 8 с.

Способ размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro, включающий выделение почек из поверхностно стерилизованных в течение 5 мин в 0,1%-ном водном растворе диоцида и 4-5 раз промытых в стерильной воде отрезков стеблей длиной 1,5-2,0 см с пазушными почками вегетирующих трансгенных растений клевера лугового и помещение их на агаризованную питательную среду Гамборга В5, отличающийся тем, что вначале отрезки стеблей с пазушными почками длиной 1,5-2,0 см промывают в проточной водопроводной воде (10 мин) и после поверхностной стерилизации при встряхивании отделенные пазушные почки культивируют на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП до размера не менее 4,0 мм, а затем 4 пассажа на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина до образования морфогенной ткани только с зелеными побегами, при этом размноженными трансгенными (канамицин устойчивыми) растениями являются растения-регенеранты клевера лугового, образовавшие корни не менее 50 мм на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ адаптации растений-регенерантов земляники, включающий этап адаптации, где растения-регенеранты земляники крупноплодной в период адаптации увлажняют трижды за период через равные промежутки времени свежеприготовленной водной суспензией кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая, приготовленной путем перемешивания кремнийсодержащего механокомпозита и воды комнатной температуры в концентрации 3 г/л и последующего настаивания в течение 1 часа при комнатной температуре, а в промежутках увлажняют дистиллированной водой.

Изобретение относится к области биотехнологии и репродуктивной биологии растений. Изобретение представляет собой способ регенерации растений Бобовника анагировидного in vitro, включающий предварительную обработку сухих семян, поверхностную стерилизацию и культивирование на питательной среде для проращивания, отличающийся тем, что в качестве предварительной обработки семена Бобовника анагировидного заливают горячей водой при температуре от 90-100°С и оставляют на 20-30 минут до остывания воды, поверхностную стерилизацию осуществляют, помещая семена в 1%-ный водный раствор синтетического моющего средства на 15 минут при постоянном помешивании, а затем промывая проточной водой в течение 15-20 минут, культивирование осуществляют в течение 3-4 недель, после чего развившиеся проростки высаживают в стаканчики с почвенным субстратом и помещают в микропарник на 4-6 недель для адаптации к нестерильным условиям, где питательная среда содержит минеральные соли и витамины по MS, 20 г/л сахарозы, 7 г/л агара, дополнительно содержит 2.2 μМ БАП, в качестве питательной среды выбрана среда WPM с добавлением 2.2 μМ БАП.
Способ получения растений-регенерантов из репродуктивных органов Brassica oleracea L. in vitro относится к области биотехнологии предназначен для культивирования in vitro пыльников и завязей Brassica oleracea L.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности. Способ предусматривает бактериальную трансформацию экспланта корня ювенильного растения Silene linicola агробактериальным штаммом R-1601 A.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению трансгенных растений лесных древесных пород в качестве биологических моделей при прогнозировании круговоротов азота и углерода в лесных экосистемах.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Меристемные растения опрыскивают 0,1% раствором ПАБК, куда вводят 0,1% биопрепарата Фитолавина при температуре 20-25°С, а при повторном опрыскивании в фазе 3-4 листьев в раствор дополнительно добавляют 0,2-0,3% гумата калия.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая), включающий размножение микропобегов на искусственных питательных средах, где через 7-10 дней после культивирования в стандартных условиях побеги помещают в условия с температурой 4-8°С и уровнем освещенности 500-1000 люкс на срок до 8 (лимонник китайский, береза повислая) или до 12 месяцев (рододендрон, сирень).
Изобретение относится к области декоративного садоводства. Изобретение представляет собой способ размножения растений фритиллярий методом in vitro, включающий стерилизацию эксплантов, разделение их на части, посадку на питательную среду Данстена и Шорта, отделение микролуковиц от эксплантов, их укоренение и адаптацию, отличающийся тем, что после разделения эксплантов их помещают на питательную среду Данстена и Шорта, содержащую 6 г/л агара с добавлением - 5 мкМ 6-бензиламинопурина и 2 мкМ α-нафтилуксусной кислоты, после культивирования на данной среде микролуковицы размножают на безгормональной среде Данстена и Шорта в течение 4 недель при освещении 3 клк 16 ч свет/ 8 ч темнота при температуре 24°C, укореняют и адаптируют в контейнерах со сфагновым мхом, в темноте, при температуре 7°C, в течение 2 месяцев.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ культивирования лимона in vitro, заключающийся в том, что стерильные пазушные почки предварительно культивируют до появления микропобегов на питательной среде МС с добавлением БАП 0,1 мг/л, НУК 0,5 мг/л, агар 0,7%, затем вычленяют из них меристемы размером 0,4-0,6 мм с 2-3 примордиями и прививают их на подвой, выращенный in vitro на среде WPM, дополненной БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 0,7%, микропривитые растения культивируют на среде WPM с добавлением БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 7 г/л, сахарозы 20 г/л.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен способ получения моноклональной линии растительных клеток от гетерологичной популяции растительных клеток, включающий следующие стадии.

Группа изобретений относится к области сельского хозяйства, в частности к устройству и способам доставки пыльцы в процессе направленного опыления при выращивании растений маиса.

Изобретение относится к области селекции зерновых культур. Способ включает асептическое культивирование проростков на голодном агаре (2%) (контроль) и агаре с добавлением 15 мг/л ионов алюминия и водорода (pH 4) (стрессовые условия).

Изобретения относятся к области сельского хозяйства. Способ производства семян сои в условиях орошения предусматривает широкорядный посев семян сои, полив, уход за растениями и уборку.

Изобретение относится к области сельского хозяйства и селекции. Способ включает посев оцениваемых культур и отбор.

Изобретение относится к генетике и репродуктивной биологии растений. Изобретение представляет собой способ получения фертильных линий сорго, являющихся восстановителями фертильности для ЦМС типа 9Е, включающий выращивание гибридных растений, полученных от скрещивания ЦМС-линий и фертильных линий, оценку их восстановительной способности в тест-кроссах с ЦМС-линиями, где гибридные растения выращивают в условиях теплицы, способствующих реверсии к мужской фертильности, а их потомство выращивают в полевых условиях, где производят отбор фертильных растений, способных к восстановлению фертильности гибридов F1.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии. Изобретение представляет собой способ создания линий озимой мягкой пшеницы с комплексной устойчивостью к бурой и стеблевой ржавчине и мучнистой росе, включающий скрещивание коммерческих сортов мягкой пшеницы, самоопыление гибридов первого поколения F1 для получения гибридов второго поколения F2, среди которых отбирают растения с комплексной устойчивостью к грибным болезням, содержащие рецессивные аллели генов озимого образа жизни, повторное самоопыление отобранных растений для получения поколения F3 и тестирование последних на устойчивость к грибным болезням и выживаемость в условиях подзимнего посева, где сорт мягкой пшеницы «Тулайковская 10» (донор), содержащий комплекс генов Lr-Sr-Pm, скрещивают с коммерческим сортом озимой мягкой пшеницы «Бийская озимая», среди гибридов поколения F2 проводят отбор озимых растений, содержащих комплекс генов Lr-Sr-Pm, с помощью молекулярного маркера Xicg6Ai#2, состоящего из прямого F:5′-GATGTCGAGGAGCATTTTC-3′ и обратного R:5′-GTGGTAGATTACTAGAGTTCAAGTG-3 праймеров, и отобранные растения F2 анализируют с помощью маркеров к рецессивным аллелям генов озимого образа жизни VRN1AF/VRN1-INT1R, Intr1BF/Intr1BR4 и Intr1DF/Antr1DR4 для отбора растений с озимым образом жизни.
Изобретение относится к сельскому хозяйству. Изобретение представляет собой способ размножения растений ирги зелеными черенками в условиях искусственного тумана с применением подогрева субстрата, включающий нарезку черенков, предварительную обработку и укоренение, где предварительно, за 2 дня до черенкования, проводят обильный полив маточных растений, нарезают черенки с боковых побегов длиной 10-15 см, с последующей обработкой их водным раствором регулятора роста «Корнерост П» 2 г на литр воды, с экспозицией обработки 16 ч - в полной темноте, а укоренение проводят при относительной влажности воздуха 85%, температуре воздуха 21-24°C и температуре субстрата выше температуры воздуха на 5°C в кассетах с ячейками, наполненными субстратом, который состоит из нейтрального торфа и песка в соотношении 2:1, причем каждый обработанный черенок помещают в отдельную ячейку на глубину 3,5-4,5 см, после высадки проводят двукратную обработку черенков Фитоспорином-М, ПС.

Изобретение относится к области лесного хозяйства, в частности к лесной селекции. Способ заключается в том, что для выращивания ели финской Picea×fennica (Regel) Kom.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекулярному маркеру типа RBIP для идентификации растений гороха Pisum sativum L., несущих аллель гена гороха PsMLO1. Также изобретение относится к применению вышеуказанного маркера для использования в селекции растений гороха, устойчивых к мучнистой росе.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу отбора образцов подсолнечника с высокой продуктивностью, предусматривающему: отбор растительных и почвенных проб, определение с их помощью запасов почвенной влаги горизонта почвы 0-100 см, площади листовой поверхности, содержания сухого вещества в растениях подсолнечника, расхода влаги растениями за учетный период и чистой продуктивности фотосинтеза, определение коэффициента расхода почвенной влаги на единицу чистой продуктивности фотосинтеза, а также отбор высокопродуктивных образцов растения подсолнечника.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции. Изобретение представляет собой способ оценки генотипов гречихи по интенсивности транспирации, включающий измерение интенсивности транспирации с помощью измерительной камеры, где для измерения транспирации используют 3 лист сверху генеративной части главного стебля на 10 день после начала цветения на интактных растениях с 9:00 до 10:00 часов дня. Изобретение позволяет снизить трудоемкость, повысить объективность оценки и эффективности выделения из большого количества исходного материала ценных источников высокой и низкой интенсивности транспирации для селекции. 2 ил., 3 табл., 1 пр.
Наверх