Способ получения гаплоидных растений-регенерантов из репродуктивных органов brassica oleracea l. in vitro

Авторы патента:

Соловьев Александр Александрович (RU)

A01H4/00 - Разведение растений из тканевых культур

Владельцы патента RU 2607007:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева" (ФГБОУ ВО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева) (RU)

Способ получения растений-регенерантов из репродуктивных органов Brassica oleracea L. in vitro относится к области биотехнологии предназначен для культивирования in vitro пыльников и завязей Brassica oleracea L. и может быть использован для получения нового исходного материала для создания сортов. Задача изобретения ускорить процесс селекции. Это достигается за счет того, что к питательной среде Мурасиге и Скуга в качестве индукторов эмбриогенеза добавляют растительные экстракты, полученные из репродуктивных органов капусты белокочанной, с применением в качестве растворителя DMSO в концентрации 1-1,5 мл/100 мл питательной среды.

Изобретение относится к области биотехнологии, предназначено для культивирования in vitro пыльников и завязей Brassica oleracea L. и может быть использовано для получения нового исходного материала для создания сортов.

Известен ряд способов получения гаплоидов у растений: отдаленная гибридизация, внутривидовая гибридизация, выявление среди близнецов, при воздействии на пыльцу рядом физических и химических факторов, при межвидовых скрещиваниях с использованием генетических маркеров (Патент РФ №2175189, патент РФ №2035134, патент РФ №2084135, патент РФ №2142013).

Однако все данные методы позволяют получать гаплоидные растения в небольшом количестве (единицы и десятки). Получение гаплоидных растений возможно посредством андрогенеза и гиногенеза in vitro, гаплоиндуктора, партеногенеза (апомиксис), полиэмбрионии. Наиболее перспективным подходом к разработке технологии получения гаплоидных растений - это культивирование изолированных пыльников или завязей in vitro.

Работы по получению гаплоидных растений у представителей рода Brassica ведутся во многих странах. Однако факторы, от которых зависит эффективность пыльцевого эмбриогенеза, еще недостаточно изучены. В связи с этим работы по выявлению сортов, гибридов, линий, обладающих высокой гаплоидной способностью и установление факторов, оказывающих влияние на этот процесс, являются актуальными.

Известен способ получения гаплоидных растений капусты белокочанной, заключающийся в культивировании изолированных микроспор на безгормональной питательной среде Гамборга В5, содержащей 13% сахарозы. Для изолирования микроспор применяют метод центрифугирования фильтрата (Шмыкова Н.А. Разработка системы биотехнологических методов, направленных на ускорение селекционного процесса овощных культур / Диссертация, Москва, 2006). Недостатком данного метода является трудоемкость технологии выделения микроспор из пыльников.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения гаплоидных растений Brassica oleracea L, заключающийся в культивировании изолированных пыльников на питательной среде Мурасиге и Скуга (МС), содержащей БАЛ в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л, аскорбиновую кислоту - 1 мг/л, сахарозу - 120 г/л (Зонтиков, Д.Н. Эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре микроспор / А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова // Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.). - М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. - С. 306-307). Недостатком известного аналога является применение дорогостоящих гормонов (6-бензиламинопурин (БАП), α-нафтилуксусной кислоты (НУК)), а также получение растений-регенерантов из гетерогенной каллусной ткани, которая является источником сомаклональной вариабельности растений, а следовательно частота образования гаплоидных растений резко уменьшается.

Задача предполагаемого изобретения - ускорение процесса селекции за счет повышения ча стоты возникновения гаплоидных растений Brassica oleracea L in vitro, используемых в качестве нового исходного материала для создания сортов.

Поставленная задача достигается за счет того, что пыльники и завязи культивируют на безгормональной питательной среде по прописи МС, при этом в качестве индукторов эмбриогенеза добавляют растительные экстракты, полученные из репродуктивных органов Brassica oleracea L, с применением в качестве растворителя DMSO в концентрации 1-1,5 мл/100 мл питательной среды.

Конкретный пример осуществления предлагаемого способа.

Растительные экстракты получали из сырой биомассы образцов (от 200 до 350 мг), которые экстрагировали 100% растворителем DMSO, путем растирания ее в ступке. После этого полученную массу выдерживали в течении 1 часа при температуре 23°C, фильтровали через фильтровальную бумагу и затем стерилизовали путем пропускания их через бактериальный фильтр (Millipore, pore size 0,45 дМ). Полученный растительный экстракт добавляли в питательную среду в концентрации 1-1,5 мл/100 мл. Пыльники и завязи асептически извлекали из бутонов в условиях ламинар-бокса и культивировали на индуцирующих питательных средах МС в чашках Петри, которые помещали в климакамеру (Binder, Германия) и инкубировали в темноте при температуре 35°C в течение 5-ти суток, после чего температурный режим уменьшали до 25°C. В этих условиях экспланты выращивали в течение 25 суток и затем переносили в световую комнату, где был установлен 16-часовой фотопериод и освещение белыми люминесцентными лампами с интенсивностью света 5 тыс.лк. При добавлении растительного экстракта в концентрациях меньше 1 мл/100 мл формирование эмбриоидов не происходило, а в концентрациях больше 1,5 мл/100 мл этот процесс был менее интенсивным. В дальнейшем сформированные эмбриоиды отделяли от первичного экспланта и переносили на среду, содержащую минеральные соли по прописи МС, а также гормоны ИУК - 2 мг/л, БАП - 1 мг/л, сахарозу - 3%, агар - 7 г/л. В этих условиях формировались растения, которые проявили высокую способность к последующему размножению.

Предлагаемый способ получения растений-регенерантов сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать ее в практической селекционной работе:

1. Технология предполагает применение доступного растворителя.

2. Отсутствие в использовании дорогих фитогормонов и регуляторов роста (дешевая технология).

3. Предлагаемый способ легок в исполнении по сравнению с ранее предложенными известными авторами.

Заявляемое изобретение направлено на устранение недостатков, которые свойственны наиболее распространенным способам получения гаплоидных растений. Известных в научно-технической и патентной литературе способов с аналогичной технологией не обнаружено. Результат, полученный у данного решения и обусловленный применением растительных экстрактов, не достигался в известных решениях.

Использование изобретения позволит увеличить частоту возникновения гаплоидных растений в 2-3 раза, что дает возможность получать их в количестве, достаточном для ведения селекционных работ, что в значительной степени ускоряет процесс селекции. Так как в контрольном варианте данный показатель составляет в культуре пыльников и завязей 1,85% и 3,7% соответственно. В то время как, в предлагаемом способе учитываемый показатель составил 2.5% и 8,6% соответственно.

Способ получения растений-регенерантов из репродуктивных органов Brassica oleracea L. in vitro, включающий культивирование пыльников и завязей на питательной среде Мурасиге и Скуга, отличающийся тем, что в качестве индукторов эмбриогенеза используют растительные экстракты, полученные из репродуктивных органов Brassica oleracea L, с применением в качестве растворителя DMSO в концентрации 1-1,5 мл/100 мл питательной среды.

Изобретение относится к генетике и репродуктивной биологии растений. Изобретение представляет собой способ получения фертильных линий сорго, являющихся восстановителями фертильности для ЦМС типа 9Е, включающий выращивание гибридных растений, полученных от скрещивания ЦМС-линий и фертильных линий, оценку их восстановительной способности в тест-кроссах с ЦМС-линиями, где гибридные растения выращивают в условиях теплицы, способствующих реверсии к мужской фертильности, а их потомство выращивают в полевых условиях, где производят отбор фертильных растений, способных к восстановлению фертильности гибридов F1.

Способ искусственного опыления ветроопыляемых растений и устройство для его осуществления // 2588451

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Изобретение представляет собой устройство для осуществления способа искусственного опыления ветроопыляемых растений, представляющее собой управляемый малый беспилотный летательный аппарат, например типа коптер, с видеокамерой, где беспилотный летательный аппарат снабжен подвеской в виде двух штанг и коленчатого вала между ними, несущего группу пропеллеров и связанного тягой с эксцентриковым механизмом, установленным на валу электрического привода с контроллером дистанционного управления, и способ искусственного опыления ветроопыляемых растений, включающий стряхивание пыльцы с растений и ее перенос по полю, где с помощью управляемого малого беспилотного летательного аппарата, вращающиеся пропеллеры которого располагают под углом к направлению движения, создают над поверхностью растения турбулентный поток воздуха, которым осуществляют стряхивание, захват и перенос пыльцы по мере движения коптера над полем без непосредственного контакта устройства с растениями.

Способ получения культуры изолированных корней silene linicola к1601 - продуцента экдистероидов // 2605912

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности. Способ предусматривает бактериальную трансформацию экспланта корня ювенильного растения Silene linicola агробактериальным штаммом R-1601 A.

Применение трансгенных растений лесных древесных пород в качестве биологических моделей при прогнозировании круговоротов азота и углерода в лесных экосистемах // 2605906

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению трансгенных растений лесных древесных пород в качестве биологических моделей при прогнозировании круговоротов азота и углерода в лесных экосистемах.

Способ стимуляции роста меристемных растений картофеля in vitro // 2599556

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Меристемные растения опрыскивают 0,1% раствором ПАБК, куда вводят 0,1% биопрепарата Фитолавина при температуре 20-25°С, а при повторном опрыскивании в фазе 3-4 листьев в раствор дополнительно добавляют 0,2-0,3% гумата калия.

Способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая) // 2590703

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ сохранения качественных характеристик культуры in vitro некоторых древесных видов растений (лимонник китайский, рододендрон, сирень, береза повислая), включающий размножение микропобегов на искусственных питательных средах, где через 7-10 дней после культивирования в стандартных условиях побеги помещают в условия с температурой 4-8°С и уровнем освещенности 500-1000 люкс на срок до 8 (лимонник китайский, береза повислая) или до 12 месяцев (рододендрон, сирень).

Способ размножения растений фритиллярий методом культуры in vitro // 2584581

Изобретение относится к области декоративного садоводства. Изобретение представляет собой способ размножения растений фритиллярий методом in vitro, включающий стерилизацию эксплантов, разделение их на части, посадку на питательную среду Данстена и Шорта, отделение микролуковиц от эксплантов, их укоренение и адаптацию, отличающийся тем, что после разделения эксплантов их помещают на питательную среду Данстена и Шорта, содержащую 6 г/л агара с добавлением - 5 мкМ 6-бензиламинопурина и 2 мкМ α-нафтилуксусной кислоты, после культивирования на данной среде микролуковицы размножают на безгормональной среде Данстена и Шорта в течение 4 недель при освещении 3 клк 16 ч свет/ 8 ч темнота при температуре 24°C, укореняют и адаптируют в контейнерах со сфагновым мхом, в темноте, при температуре 7°C, в течение 2 месяцев.

Способ культивирования лимона in vitro // 2580033

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ культивирования лимона in vitro, заключающийся в том, что стерильные пазушные почки предварительно культивируют до появления микропобегов на питательной среде МС с добавлением БАП 0,1 мг/л, НУК 0,5 мг/л, агар 0,7%, затем вычленяют из них меристемы размером 0,4-0,6 мм с 2-3 примордиями и прививают их на подвой, выращенный in vitro на среде WPM, дополненной БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 0,7%, микропривитые растения культивируют на среде WPM с добавлением БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 7 г/л, сахарозы 20 г/л.

Способ получения моноклональной линии растительных клеток // 2573927

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен способ получения моноклональной линии растительных клеток от гетерологичной популяции растительных клеток, включающий следующие стадии.

Система контроля фотосинтетического и дыхательного со2-газообмена растений, изолированных органов и тканей in vitro // 2572349

Изобретение относится к области биохимии. Предложена система контроля фотосинтетического и дыхательного СО2-газообмена в культуре in vitro.

Способ получения лекарственного растительного сырья лапчатки белой (potentilla alba l.) в условиях гидропоники // 2570623

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений-регенерантов лапчатки белой (Potentilla alba L.) в условиях гидропоники, включающий использование черенков материнских растений, размножение и выращивание, где в качестве эксплантов используются черенки материнских растений, которые высаживают на питательную среду по прописи Мурасиге-Скуга (MS), содержащую 0,5 мкМ БАП для введения в культуру ткани, через 20-30 суток развившиеся побеги пересаживают для микроразмножения на питательную среду Мурасиге-Скуга (MS), содержащую 0,5 мкМ БАП+0,25 мкМ ИМК+0,05 мкМ ГК, укореняют побеги на агаризированной среде Мурасиге-Скуга, дополненной 1 мкМ НУК, затем растения-регенеранты вынимают из культуральных сосудов, отмывают корни в дистиллированной воде от агара, закрепляют в кассетах и помещают в гидропонную установку на 90 суток для адаптации и выращивания растительного лекарственного сырья на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1/4 состава макросолей, 1/4 состава микросолей, полный набор витаминов, хелата железа и кальция хлористого, при температуре 24-26°C, режим освещения: 16 часов день, 8 часов ночь.

Способ выращивания мини-клубней оздоровленного картофеля в защищенном грунте // 2569239

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности картофелеводства. В способе выращивают мини-клубни оздоровленного картофеля в защищенном грунте, полученные от пробирочных растений.

Способ получения посадочного материала бобовника анагировидного // 2608638

Изобретение относится к области биотехнологии и репродуктивной биологии растений. Изобретение представляет собой способ регенерации растений Бобовника анагировидного in vitro, включающий предварительную обработку сухих семян, поверхностную стерилизацию и культивирование на питательной среде для проращивания, отличающийся тем, что в качестве предварительной обработки семена Бобовника анагировидного заливают горячей водой при температуре от 90-100°С и оставляют на 20-30 минут до остывания воды, поверхностную стерилизацию осуществляют, помещая семена в 1%-ный водный раствор синтетического моющего средства на 15 минут при постоянном помешивании, а затем промывая проточной водой в течение 15-20 минут, культивирование осуществляют в течение 3-4 недель, после чего развившиеся проростки высаживают в стаканчики с почвенным субстратом и помещают в микропарник на 4-6 недель для адаптации к нестерильным условиям, где питательная среда содержит минеральные соли и витамины по MS, 20 г/л сахарозы, 7 г/л агара, дополнительно содержит 2.2 μМ БАП, в качестве питательной среды выбрана среда WPM с добавлением 2.2 μМ БАП. Изобретение позволяет сократить трудоемкость и длительность процесса получения посадочного материала, а также упростить процесс получения посадочного материала. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил., 1 пр.

Способ адаптации растений-регенерантов земляники // 2614261

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ адаптации растений-регенерантов земляники, включающий этап адаптации, где растения-регенеранты земляники крупноплодной в период адаптации увлажняют трижды за период через равные промежутки времени свежеприготовленной водной суспензией кремнийсодержащего механокомпозита на основе рисовой шелухи и зеленого чая, приготовленной путем перемешивания кремнийсодержащего механокомпозита и воды комнатной температуры в концентрации 3 г/л и последующего настаивания в течение 1 часа при комнатной температуре, а в промежутках увлажняют дистиллированной водой. Изобретение позволяет успешно акклиматизировать землянику крупноплодную благодаря подкормке микрорастений на стадии адаптации кремнийсодержащим механокомпозитом на основе рисовой шелухи и зеленого чая. 1 табл.

Способ размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro // 2617944

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro, включающий выделение почек из поверхностно стерилизованных в течение 5 мин в 0,1%-ном водном растворе диоцида и 4-5 раз промытых в стерильной воде отрезков стеблей длиной 1,5-2.0 см с пазушными почками вегетирующих трансгенных растений клевера лугового и помещение их на агаризованную питательную среду Гамборга В5, где вначале отрезки стеблей с пазушными почками длиной 1,5-2,0 см промывают в проточной водопроводной воде (10 мин) и после поверхностной стерилизации при встряхивании отделенные пазушные почки культивируют на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП до размера не менее 4,0 мм, а затем 4 пассажа на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина до образования морфогенной ткани только с зелеными побегами, при этом размноженными трансгенными (канамицин устойчивыми) растениями являются растения-регенеранты клевера лугового, образовавшие корни не менее 50 мм на агаризованной среде Гамборга В5 с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина. Изобретение позволяет повторно вводить в культуру in vitro трансгенные растения клевера лугового, получать длительно культивируемую морогенную ткань, изучать экспрессию введенных генов в вегетативно размноженных трансгенных растениях клевера лугового. 2 табл., 2 пр.

Способ клонального размножения растений в автотрофных условиях на гидропонике // 2617948

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Изобретение представляет собой способ клонального размножения растений в автотрофных условиях на гидропонике, в котором клональное размножение растений осуществляют путем черенкования регенерантов и укоренения черенков на питательной среде, где укоренение черенков проводят в автотрофных условиях на гидропонике с использованием жидких питательных сред, содержащих только минеральные элементы, культивирование растений осуществляют при нормальных, либо повышенных концентрация СО2 в посеве, при интенсивности облучения посева не менее 60 Вт ФАР/м2, орошение и аэрация оснований черенков и корневой системы растений производят путем периодического подтопления их питательным раствором. Изобретение позволяет достигнуть стабильности воспроизводства исходного генотипа, высокой скорости размножения растений-регенерантов, а также их быстрой адаптации при высадке в грунт или гидропонику. 3 з.п. ф-лы.

Способ получения растений хризантемы килеватой (chrysanthemum carinatum schousb.) в условиях in vitro // 2619052

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum Schousb.) в условиях in vitro путем введения в культуру клеток семян с целью каллусообразования и последующей регенерации растений, заключающийся в том, что стерилизованные семена помещают на питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 0,7% агар-агара, 1 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,1-1 мг/л индолил-3-уксусной кислоты, доведенную до 1 л стерильной дистиллированной водой, культивируют в течение одного пассажа до появления каллуса, не более 26 суток, затем каллусы пересаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга с половинной концентрацией всех компонентов и 0,7% агар-агара, добавляют 0,2-1 мг/л 6-бензиламинопурина и культивируют 2-4 пассажа до появления растений-регенерантов. Изобретение позволяет достигнуть высокого процента регенерации растений хризантемы килеватой. 2 табл., 6 пр.

Способ повышения эффективности культивирования in vitro березы повислой, лимонника китайского, рододендрона и сирени // 2619177

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности культивирования in vitro березы повислой, лимонника китайского, рододендрона и сирени, включающий размножение микропобегов на искусственных питательных средах в течение трех недель в сочетании с микрочеренкованием побегов, допуская на экспланте не более двух пазушных почек. Изобретение позволяет повысить частоту мультипликации, частоты укоренения в условиях in vitro и ex vitro и эффективность адаптации. 3 табл.

Способ клонального микроразмножения растений сем. betulaceae // 2627194

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения растений сем. Betulaceae, включающий размещение верхушечных и боковых почек на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга in vitro для индукции микропобегов и их элонгации, с переносом на жидкую среду для укоренения, где индукцию микропобегов осуществляют из апикальной ткани вегетативных почек экспланта, индукцию, элонгацию и мультипликацию полученных микропобегов проводят на агаризованной питательной среде, содержащей минеральную основу по Мурасиге-Скуга и дополнительно включающей 0,25-2,0 мг/л БАП, 20000-30000 мг/л сахарозы, 6000 мг/л агара, а укоренение осуществляют размещением одновременно необходимого количества микропобегов в сосуде на перфорированной площадке, закрепленной выше уровня жидкой питательной среды, содержащей уменьшенную вдвое концентрацию макросолей по Мурасиге-Скуга, включающей дополнительно 0,2-0,6 мг/л ИМК и 15000-20000 мг/л сахарозы, и осуществляют в автоматическом режиме циклическое чередование процессов экспозиции микропобегов в воздушной среде, влажностью 80-90%, и погружения их в жидкую питательную среду на 1-3 мин 2-3 раза в сутки путем подъема ее уровня, с дополнительной аэрацией воздуха внутри сосуда по 2-4 минуты через равные промежутки времени от 10 до 15 раз в сутки в течение 16-часового фотопериода. Изобретение позволяет повысить скорость роста и развития микропобегов, активировать корнеобразование in vitro, увеличить приживаемость. 2 табл.

Способ микроклонального размножения картофеля in vitro сорта картофеля "ермак" // 2632938

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Способ включает культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, аскорбиновую кислоту и сахарозу, получение растений-регенерантов и получение микроклубней картофеля. При этом этиолированные проростки (1-1,5 см) стерилизуют в 0,1%-ном растворе диацида в течение 3-5 мин с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной Н2О. Для культивирования микрорастений и образования микроклубней используют стеклянные банки (900 мл) с металлической крышкой и отверстием в крышке для внесения питательной среды и микрорастений. Закрывают отверстие ватно-марлевой пробкой и покрывают фольгой. В питательную среду для клубнеобразования вносят сахарозу 81000-85000 мг/л, феруловую кислоту 1-2 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, тиамин 1-1,2 мг/л при температуре 20°С. Условия светового дня – 8 ч (5000 лк), условия полной темноты – 16 ч, культивируют в течение 30 дней до образования микроклубней. Способ позволяет получать оздоровленный отечественный картофель, свободный от скрытой вирусной инфекции и обладающий отличными качественными характеристиками, прост в использовании, экологически безопасен и может быть использован на картофелевыращивающих предприятиях. 1 табл., 3 пр.

Способ длительного хранения in vitro микрорастений березы // 2634409

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ хранения микрорастений березы в условиях in vitro, включающий культивирование микропобегов на питательной среде MS без гормонов с повышенным содержанием аскорбиновой кислоты 2,0 мг/л, с добавлением агар-агара 6 г/л при хранении пробирочных растений при температуре +4…+7°С в темноте. Изобретение позволяет более года без пересадки хранить различные ценные генотипы березы: продуктивные, быстрорастущие, устойчивые к неблагоприятным факторам среды, с декоративной узорчатой древесиной и др., без потери их высокого регенерационного потенциала и жизнеспособности в условиях in vitro и ex vitro. 1 ил., 2 табл.