Применение 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами pseudomonas aeruginosa, и способ подавления этой инфекции

Группа изобретений относится к микробиологии и медицине, может быть использована для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa. Предложено применение 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa в живом организме, а также способ подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa, при воздействии на штаммы Pseudomonas aeruginosa эффективным количеством этого соединения. Технический результат: реализация заявленного назначения при заражении мышей клиническими штаммами с exoS+ и exoS- генотипами вне зависимости от приобретённой резистентности, соединение не обладает бактерицидным действием на кишечную микрофлору животных и является малотоксичным. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 25 табл.

 

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa.

Предшествующий уровень

Pseudomonas aeruginosa или синегнойная палочка вызывает до 30%, а в некоторых отделениях до 50% всех внутрибольничных инфекций. Она является причиной внутрибольничных пневмоний, первичных бактериемий, инфекций мочеполовой системы и гнойных хирургических инфекций в высоком проценте случаев, особенно в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) у пациентов с искусственной вентиляцией легких и другими инвазивными процедурами такими, как катетеризация мочевого пузыря или проведение длительной инфузионной терапии. Часто инфекции развиваются молниеносно и сопровождаются высокой летальностью, показатели которой остаются стабильно высокими (34-48%). Такая угрожающая ситуация вызвана чрезвычайно высоким уровнем множественной устойчивости к большинству, а иногда и ко всем антибиотикам у клинических штаммов синегнойной палочки. P. aeruginosa лидирует среди антибиотикорезистентных грамотрицательных бактерий, вызывающих инфекции у госпитализированных больных. Внутрибольничные инфекции, вызванные синегнойной палочкой, практически не поддаются стандартному антибактериальному лечению вследствие множественной устойчивости к антибиотикам клинических штаммов. Кроме того, уже во время лечения развивается резистентность к новым препаратам. Поэтому приходится использовать комбинацию из нескольких антибиотиков, в том числе высокотоксичных. А смертность связана с тем, что бактериемии, вызванные псевдоманадами, развиваются так обвально, что даже не хватает времени поставить антибиотикограмму и подобрать нужный антибиотик. Например, по данным зарубежных исследований при бактериальном сепсисе выживаемость при адекватно назначенной стартовой антибактериальной терапии составляет 52,0%, при неадекватном стартовом назначении антибиотиков - 10,3%, то есть приводит к 5-кратному снижению выживаемости.

Борьба с внутрибольничными инфекциями требует значительных затрат, связанных с контролем и своевременной диагностикой инфекции, подбором эффективной терапии, необходимостью использования отделений интенсивной терапии, длительностью нахождения в стационаре, тяжелыми вплоть до летальных последствий данных заболеваний. Очевидно, что разработка новых подходов в создании антибактериальных препаратов с иными, чем у антибиотиков, механизмами действия, является чрезвычайно актуальной задачей.

Известно лечение бактериальных инфекций, вызванных Р. aeruginosa, с помощью синтетических антибактериальных препаратов.

Однако антибиотикорезистентность патогенных микроорганизмов, в том числе множественная, широко распространена и является важнейшим фактором снижения эффективности лечения инфекционных болезней практически во всех регионах мира.

По данным исследований, проведенных НИИ антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии и исследовательской группой РОСНЕТ в ОРИТ российских стационаров до 2003 г., частота устойчивости P.aeruginosa к меропенему составила в среднем 3%, к имипенему - 22,9%. Из других бета-лактамных антибиотиков устойчивость к цефтазидиму была 12,2%, к пиперациллину-тазобактаму - 37,7%, к пиперациллину - 56,5%. По данным исследования той же группы в 2008 г. устойчивыми к меропенему были уже 41,4% выделенных штаммов синегнойной палочки, к имипенему - 39,0%, к цефтазидиму - 47,9%, к цефоперазону - 72,6%, к цефоперазону-сульбактаму - 60,7%, к цефепиму - 58,6%, к пиперациллину - 52,9%, к пиперациллину-тазобактаму - 42,4%. Аналогичные результаты были получены в исследованиях в рамках программы «РЕЗОРТ» в ОРИТ 31 ЛПУ РФ в 2002-2004 гг. - доля устойчивых штаммов составляла: к имипенему и меропенему - 39% и 41%; к амикацину - 42%; к цефтазидиму - 48%; к остальным цефалоспоринам - 58-72%. Была выявлена высокая частота встречаемости устойчивости к ципрофлоксацину - 65% и гентамицину - 75%. На основе данных микробиологического мониторинга в ГБУ "Санкт-Петербургский НИИ скорой помощи им И.И. Джанелидзе» с 2009 по 2012 гг. только к колистину не было выявлено устойчивых штаммов синегнойной палочки. Фактически для лечения синегнойных инфекций, вызванных множественноустойчивыми к антибиотикам штаммами, препаратом выбора остается только полимиксин Е (колистин), который редко применяется вследствие токсического воздействия на почки и слизистую кишечника больных.

В ряде зарубежных аналитических работ описывается современное положение дел в области эффективности лечения различными антибиотиками инфекций, вызванных P.aeruginosa. Например, в работе Somayeh Moazami Goudarzi et al представлены данные, полученные в результате обследования пациентов двух госпиталей в Тегеране (Иран) в 2011 г (1) (S. Moazami Goudarzi and F. Eftekhar, 2015). Было показано, что выявленные клинические штаммы обладали резистентностью к большинству тестируемых (как синтетическим, так и полусинтетическим и природным) антибиотикам таким как тетрациклин (80% устойчивых штаммов), карбенициллин (82%), пиперациллин (72%), азтреонам (76%), тобрамецин (78%), цефепим (77%), меропенем (71%), амикацин (78%), ципрофлоксацин (78%), котримоксазол (94%), имипенем (70%), цефтазидим (20%).

Отсутствуют опубликованные данные, оценивающие различие эффективности комбинированной и монотерапии инфекций, вызванных P. aeruginosa. Отсутствуют рандомизированные исследования, а не рандомизированные исследования по этой проблеме единичны и показывают противоречивые результаты. Большинство авторов, в том числе российских, считают комбинированную терапию инфекций, вызванных синегнойной палочкой, предпочтительнее монотерапии. Как правило, рекомендуют назначать различные комбинации цефалоспоринов, фторхинолонов, аминогликозидов и карбапенемов, чтобы повысить вероятность эффективного терапевтического воздействия и снизить риск возникновения антибиотикорезистентности (2-6) (Burgess D.S., Nathisuwan S. 2002; Bodey G.P., et al. 1985; Hilf M, et al. 1989; Leibovici L, et al. 1997; Siegman-lgra Y., et al. 1998).

Таким образом, антибиотикорезистентные клинические штаммы синегнойной палочки широко распространены и вызывают серьезные проблемы при выборе схемы лечения, вызванных ими инфекций. Возникает необходимость использования высокотоксичных антибиотиков, что приводит к возникновению опасных побочных эффектов у пациентов, нарушающих нормальное функционирование жизненно важных органов.

Вследствие этого многие фармацевтические компании замедлили или прекратили программы по разработке новых антибиотиков, поскольку новые антибиотики стало сложнее коммерциализовывать из-за их низкой эффективности в условиях высокого распространения антибиотико-резистентных штаммов бактерий.

Несмотря на то, что изучение патогенов на молекулярно-генетическом уровне позволяет идентифицировать новые мишени для разработки антибактериальных средств, не основанных на бактерицидном или бактериостатическом действии, в настоящее время на рынке фармпрепаратов такие препараты отсутствуют.

Очевидно, что необходимо разрабатывать принципиально новые подходы и препараты для лечения бактериальных инфекций, которые могут применяться как самостоятельно, так и при комбинированной терапии. Фундаментальные исследования последних 10 лет позволили изменить стратегию борьбы с инфекциями. В частности, в качестве мишеней для поиска антибактериальных препаратов выбирают факторы патогенности бактерий. Такие препараты должны не убивать микробы, а подавлять вирулентность, не создавая условий для селективного отбора, что принципиально снижает риск развития генетически детерминированной резистентности к применяемому препарату. Таким образом, увеличение доли антибиотикорезистентных бактериальных инфекций требует поиска не только новых антибиотиков, но и эффективных ингибиторов факторов вирулентности, подавляющих инфекцию по иному механизму.

Важнейшим фактором реализации бактериями патогенных свойств является транспорт белковых факторов вирулентности в клетку макроорганизма. Процесс осуществляется путем секреции и экспорта эффекторных молекул через мембраны, либо непосредственно в цитоплазму клетки-хозяина, что приводит к изменению ее нормального физиологического состояния и способствует инвазии и внутриклеточному размножению патогена. В настоящее время известно семь систем секреции, различающихся по структуре секреторного аппарата и специфической направленностью действия эффекторных молекул.

Перспективной мишенью для разработки новых антибактериальных препаратов является система секреции III типа (ССТТ) грамотрицательных бактерий, осуществляющая перенос белков - факторов патогенности из бактериальной клетки непосредственно в цитоплазму эукариотической клетки. ССТТ присутствует только у патогенных бактерий; именно благодаря ее функционированию широкий спектр бактерий с различным типом паразитирования (экзо- и эндопаразиты) реализуют свои патогенные свойства. Мутации, приводящие к нарушению функций ССТТ, вызывают снижение или потерю вирулентности (7) (А.С. McShan, R.N. De Guzman, 2015).

У P.aeruginosa белки, секретируемые посредством третьей транспортной системы, являются токсинами, вызывающими гибель клеток путем апоптоза или некроза. Основное их действие направлено на подавление иммунного ответа: они ингибируют миграцию и фагоцитоз макрофагов и нейтрофилов, рекрутируемых к очагу инфекции, вызывают гибель иммунных клеток. Так, при пневмонии, белки ССТТ создают иммуносупрессию в тканях легкого, что позволяет не только синегнойной палочке персистировать в легких, но и способствует развитию суперинфекции при заражении другими патогенами.

В целом, секретируемые белки псевдомонад участвуют в установлении инфекции и диссеминации патогена при острой инфекции, и ответственны за персистенцию при хронической инфекции. Элиминация P.aeruginosa у больного косвенно способствует его сопротивляемости к другим инфекциям, за счет повышения защитных свойств организма хозяина, подавленных в результате действия ССТТ P.aeruginosa.

К настоящему времени идентифицировано 4 эффекторных белка ССТТ P.aeruginosa, ExoU, ExoS, ЕхоТ, ExoY. Фактически все штаммы псевдомонад имеют гены, кодирующие секреторный аппарат, однако большинство штаммов не содержат полный набор генов, детерминирующих эффекторные белки. Клинические штаммы P.aeruginosa характеризуются различными генотипами и фенотипами, что влияет на тяжесть заболевания и клинический прогноз. Изучение частоты смертельных исходов, бактериальной персистенции в легких, диссеминации бактерий показало, что секреция токсина ExoU вносит наибольший вклад в вирулентность, в то время как секреция белка ExoS белка связана с меньшей вирулентностью, а белок ЕхоТ имеет минимальный эффект на проявление вирулентных свойств патогена. Патогенез поражения легких связан с активностью ExoU, который индуцирует прокоагулянтные процессы в эпителиальных клетках, гиперпроницаемость сосудов, активацию тромбоцитов и образование тромбов при псевдомонадной пневмонии и сепсисе. Токсическое действие ExoU направлено против фагоцитов, а также на преодоление эпителиального барьера, что способствует бактериальной диссеминации и персистенции (8) (B.J. Berube et al. 2016).

Поиски ингибиторов ССТТ активно продолжаются в настоящее время, т.к. терапия такими препаратами имеет ряд преимуществ по сравнению с антибиотиками:

- ингибиторы ССТТ не способствуют отбору устойчивых форм микроорганизмов, поскольку не вызывают гибель и не подавляет размножение патогенов, а только ингибируют их вирулентность. Эрадикация возбудителя, утратившего вирулентные свойства, происходит в результате действия иммунных защитных сил организма-хозяина.

- ингибиторы ССТТ перспективны для лечения инфекций, вызванных патогенами, устойчивыми к антибиотикам, т.к. эти ингибиторы действуют на возбудителя вне зависимости от приобретенной резистентности к антибиотикам.

- поскольку ингибиторы ССТТ оказывают воздействие только на патогенные микроорганизмы, терапия этими препаратами не будет вызывать гибель нормальной микрофлоры человека и развития дисбактериозов.

- потеря вирулентности возбудителем под воздействием ингибитора значительно снизит вред, наносимый патогеном организму хозяину.

В настоящее время в научных публикациях и в патентах описан целый ряд ингибиторов ССТТ P.aeruginosa, имеющих различную химическую структуру, принадлежащих к различным классам низкомолекулярных соединений, а также специфические антитела к белку кончика иглы инжектосомы (9) (A. Ahalieyah et al. 2016). Наиболее изучены два основных класса низкомолекулярных соединений, гидразоны салицилового альдегида (salicylidene acylhydrazides) (10, 11) Slepenkin A., et al. 2011; A. Anantharajah, et al. 2012) и тиазолидиноны (thiazolidinones) (12, 13) (Felise H.B., et al. 2008;. Kline Т., et al. 2009). Для нескольких ингибиторов были выявлены конкретные мишени в ССТТ, но большинство мишеней для ингибиторов ССТТ еще предстоит идентифицировать или охарактеризовать. Большинство ингибиторов ССТТ являются соединениями, отобранными в результате скрининга синтетических химических библиотек, но также есть ингибиторы природного происхождения - ауродокс, каминозид, гуадиномин, (-)-хопеафенол, цитрусовые флавоноиды, пиерисидин, псевдокерамин, салицилиденеанилид, лактоферрин, альгинат, муцин и др. Помимо низкомолекулярных соединений ингибирующие действие на ССТТ показано для некоторых высокомолекулярных веществ, которые представлены полимерами, белками, полипептидами-миметиками, полисахаридами (9) (A. Ahalieyah et al. 2016).

По направлению воздействия на ССТТ ингибиторы могут быть разделены на следующие группы:

- действующие на генетическую регуляцию СССТ (растительные фенольные соединения, N-гидрокси-бензимидазолы, салицилиден ацилразиды);

- действующие на функционирование аппарата ССТТ (гидроксихинолины, тиазолидиноны, фенилацетамиды, PcrV-антитела (КВ001; V2L2MD), PcrV/Psl-антитела MEDI3902);

- действующие на эффекторные белки ССТТ (экзоцин, арильные сульфаниламиды, псевдолипаза А);

- ингибиторы неопределенного действия (С20, С22, С24, С34 и С38, (-)-hopeaphenol, галлий (III) - салицилиден ацилгидразиды) (9) (A. Ahalieyah et al. 2016).

Таким образом, к настоящему времени известен целый ряд технических решений, связанных с получением ингибиторов ССТТ псевдомонад. Среди них низкомолекулярные соединения различных классов, а также специфические антитела к структурному белку ССТТ.

Для всех полученных ингибиторов показана активность в отношении подавления секреторной функции патогена в условиях in vitro. При этом для большинства ингибиторов не идентифицирована конкретная мишень действия и не изучен молекулярный механизм ингибирования. Следовательно, полученные к настоящему времени ингибиторы ССТТ могут обладать различной активностью, подавляя секрецию, как специфически, так и опосредовано через иные молекулярные мишени патогена.

При разработке эффективных лекарственных препаратов на основе ингибиторов ССТТ для лечения инфекционных заболеваний ключевой задачей является доказательство антибактериального действия полученных ингибиторов на моделях инфекционного процесса у животных. Это обусловлено тем, что подавление секреторной функции патогена снижает его вирулентность, но не влияет на жизнеспособность, т.е. напрямую не связано с подавлением инфекции. Тем самым, для ингибиторов ССТТ требуется экспериментально подтвердить концепцию о том, что снижение вирулентности приведет к блокированию инфекции в организме хозяина. Кроме того, потенциальные лекарственные препараты должны характеризоваться отсутствием токсического эффекта на организм хозяина и на нормальную микрофлору.

Среди известных ингибиторов терапевтический эффект в виде подавления синегнойной инфекции в моделях in vivo был показан для специфических антител к компонентам иглы ССТТ-PcrV-антитела (КВ001; V2L2MD) (16, 17) (Francois, В. et al. 2012; Warrener, P. et al. 2014) и PcrV/Psl-антитела (MEDI3902) (18) (DiGiandomenico, A. et al. 2014). Однако эту группу препаратов на основе антител следует рассматривать отдельно в связи с тем, что они относятся к группе иммунобиологических лекарственных препаратов. Также терапевтический эффект в виде подавления синегнойной инфекции в моделях in vivo был показан для низкомолекулярного соединения INP1855, принадлежащего к классу гидроксихинолинов (14, 15) (А. Anantharajah, Е. Faure, J.М. Buyck, et al. 2016; Enquist, P.A., et al. 2012). Данное решение, как наиболее близкое к заявляемому по назначению - как ингибитор, терапевтический эффект которого выражается в виде подавления синегнойной инфекции, было принято авторами за прототип.

Химическая структура ингибитора ССТТ P. aeruginosa, выбранного в качестве прототипа

По прототипу данного изобретения, сущность которого отражена в работе по изучению подавляющего инфекцию действия ингибитора ССТТ, относящегося к классу гидроксихинолинов, в отношении острой легочной инфекции у мышей, вызванной синегнойной палочкой, показано, что однократное интраназальное введение препарата INP1855 в дозе 4,5 мкг сразу после заражения летальной дозой P.aeruginosa повышало процент выживших животных с 38% (в контроле) до 88% через 48 час после заражения, т.е. наблюдали подавление гибели животных в 5 раз. У мышей, получавших INP1855, наблюдали снижение на 2-3% патологических изменений в легких и примерно в 30 раз снижение количества бактерий в легких. Был также показан дозозависимый эффект INP1855 при внутрибрюшинном введении через 4 ч. после заражения псевдомонадами (14) (A. Anantharajah, Е. Faure, J.М. Buyck, et al. 2016).

Эта работа является единственной опубликованной, показывающей эффективность низкомолекулярного ингибитора ССТТ на модели in vivo, но имеет ряд недостатков в отношении активности и изученности полученного ингибитора.

1. Эксперименты на животных были проведены с одним штаммом Pseudomonas aeruginosa, который характеризуется exoU+ генотипом, при этом оппозитный генотип exoS+, являясь инвазивным, вызывает генерализованные инфекции и сепсис, а также является преобладающим среди всех клинических штаммов, от 85 до 75%.

2. Не была разработана полная схема лечения.

3. Не было показано полное подавление накопления возбудителя в тканях легкого. Количество высеваемых из легкого псевдомонад после лечения ингибитором сохранялось в значительном числе, более чем, 105 КОЕ/легкое. При этом известно, что не долеченная инфекция может приводить к развитию хронических состояний и рецидивов на фоне ослабления иммунного статуса.

4. Не проведена характеристика токсичности полученного ингибитора для экспериментальных животных.

5. Не изучено влияние полученного ингибитора на нормальную микрофлору.

Таким образом, существует необходимость проведения дальнейших исследований с целью расширения арсенала ингибиторов системы секреции III типа P.aeruginosa, изучения их эффективности на моделях инфекционного процесса у животных, испытаний их возможной токсичности для организма хозяина и микрофлоры. Такие исследования направлены на разработку нового поколения антибактериальных препаратов с отличным от антибиотиков механизмом действия и эффективными в отношении антибиотикорезистентных штаммов синегнойной палочки.

Раскрытие изобретения

Технической задачей, решаемой данным изобретением, является:

- подавление инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa с различным генотипом по генам эффекторных белков ССТТ и различным профилем антибиотикорезистентности.

- подавление инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa у зараженного организма на модели in vivo, вне зависимости от приобретенной антибиотикорезистентности.

- отсутствие ингибирующего действия на нормальную микрофлору макроорганизма при применении 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa.

Указанная задача решается путем

применения 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa в живом организме, а также способом подавления инфекции вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa заключающимся в воздействии на штаммы Pseudomonas aeruginosa эффективным количеством этого соединения.

Термины и определения

«Инфекция» - совокупность биологических процессов, возникающих и развивающихся в организме хозяина при внедрении и размножении в нем патогенных микробов.

«Подавление инфекции» - процесс ограничения проявления факторов, развивающихся в организме хозяина после внедрения и размножения патогенов

«Накопление патогена в тканях» - процесс, характеризующийся размножением бактерий

«Подавление бактерий» - блокирование жизнеспособности бактерий в результате негативного действия на метаболизм и/или на размножение

«Факторы патогенности» - механизмы, обеспечивающие колонизацию микробов, их устойчивость к микробицидным факторам организма, инвазивность и токсигенность, а также способность к длительному персистированию

«Подавление факторов патогенности» - ингибирование процессов колонизации, устойчивости к микробицидным факторам организма, инвазивности, токсигенности и персистирования

«Генотип» - совокупность генов данного организма.

«Система секреции III типа бактерий» - аппарат бактериальной клетки, обеспечивающий одноэтапный транспорт эффекторных молекул патогенности из цитоплазмы бактерии в цитозоль эукариотической клетки макроорганизма. Рассматривается как один из основных факторов патогенности грамотрицательных бактерий, реализующих инвазию, токсигенность и диссеминацию патогена в инфицированном организме (далее ССТТ).

«Профиль антибиотикорезистентности» - отсутствие чувствительности бактерий к конкретным антимикробным препаратам

«Формирование антибиотикорезистентности» - свойство отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при тех концентрациях антибиотиков, которые подавляют основную часть микробной популяции. Формирование резистентности обусловлено генетически: приобретением новой генетической информации или изменением уровня экспрессии собственных генов. Резистентные штаммы выживают и распространяются в условиях селективного действия антибиотиков.

«In vitro» - технология выполнения экспериментов, когда опыты проводятся «в пробирке» - вне живого организма на культуре живых клеток или в бесклеточной модели.

«In vivo» - технология выполнения экспериментов на живом организме, на человеке или на животной модели.

«Облигатные внутриклеточные бактерии» - бактерии, размножающиеся только внутри эукариотических клеток, ввиду энергетической зависимости от макроэргических молекул клетки хозяина. Культивируются in vitro только в клеточных культурах. Инфекцию в макроорганизме вызывают в результате внутриклеточной колонизации и воздействия на метаболизм клетки хозяина.

«Внеклеточные патогенные бактерии» - бактерии, размножающиеся в организме хозяина вне клеток и вызывающие инфекцию в результате действия факторов патогенности.

Авторами были синтезированы и запатентованы биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии, представляющие собой замещенные производные 1,3,4-тиадиазолинов (I), тиадиазинонов (II) и тиадиазепинонов (III), полученные на основе тиогидразидов оксаминовых кислот (патент РФ №2447066). Полученные активные низкомолекулярные соединения являются ингибиторами системы секреции III типа у патогенных бактерий. Для полученных соединений было показано подавление размножения патогенных бактерий в культуре клеток в условиях in vitro на примере хламидий. Хламидии являются представителями облигатных внутриклеточных паразитов, у которых система секреции III типа обеспечивает контакт с клеткой хозяина, а ее ингибирование блокирует размножение бактерий. Специфичность ингибиторов в отношении системы секреции III типа была продемонстрирована при детекции эффекторного белка хламидий, секретируемого с помощью ССТТ, в мембрану хламидийной фагосомы. В этом патенте не было исследовано и экспериментально показано, что полученные низкомолекулярные ингибиторы подавляют секрецию эффекторных белков ССТТ у внеклеточных патогенов. При этом механизм взаимодействия внутриклеточных и внеклеточных патогенов с организмом хозяина принципиально различен, а система секреции III типа у этих двух групп бактерий выполняет различные функции. У внутриклеточных патогенов ССТТ обеспечивает возможность внутриклеточного выживания, а у внеклеточных - развитие инфекции в результате токсического действия молекул эффекторов в отношении иммунных и барьерных клеток. В патенте не была экспериментально продемонстрирована возможность подавления инфекции в организме животного при действии полученных ингибиторов ССТТ. Кроме того, не было изучено влияние выбранных ингибиторов ССТТ на секреторный аппарат P.aeruginosa и на развитие инфекционного процесса у лабораторных животных.

Поэтому разработка применения 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида и способа подавления инфекции, вызванной антибиотикорезистентными штаммами Pseudomonas aeruginosa, на модели инфекции у животных с помощью низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа, представленного в настоящем изобретении, обладает «новизной» и изобретательским уровнем.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена схема синтеза 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида VIII (соединение CL-55).

На фиг. 2 показана реакция препаратов секретируемых белков P. aeruginosa с антителами к эффектору ЕхоТ. Красным цветом отмечена сильная реакция. Название штаммов P. aeruginosa отмечены сверху рисунка.

На фиг. 3 показано подавление активности ССТТ клинических штаммов 1625/36/2015 с exoU+ генотипом (А) и КБ6 с exoS+ генотипом (Б) P.aeruginosa (после индукции ССТТ 5 мМ EGTA и действии разных концентраций CL-55 при постановке метода иммуноблота с сывороткой к ЕхоТ белку (53 кДа), обозначен стрелками.

Примеры

1. Получение низкомолекулярного ингибитора ССТТ на основе синтеза 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида

2. Исследование механизма действия 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на клинических штаммах Pseudomonas aeruginosa с различным профилем резистентности к антибиотикам.

3. Изучение токсичности 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для животных.

4. Влияние 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на жизнеспособность бактерий in vitro и in vivo.

5. Определение эффективной ингибирующей дозы 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на лабораторных животных.

6. Изучение терапевтической эффективности ингибитора ССТТ на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотипов.

7. Изучение профилактической эффективности ингибитора ССТТ на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотипов.

Пример 1:

Получение низкомолекулярного ингибитора ССТТ на основе синтеза 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида

Действующим веществом антибактериального лекарственного средства на основе низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа в заявленном изобретении является 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид VIII (соединение CL-55), который получается циклизацией хлоруксусной кислотой тиогидразида оксаминовой кислоты VII и процесс его синтеза включает в себя получение и последующее взаимодействие хлорацетамида III с предварительно приготовленным раствором элементной серы с морфолином, последующее взаимодействие монотиооксамидов IV с гидразин-гидратом, реакцию полученного гидразида V с 3-этокси-4-гидрокси-бензальдегидом и восстановление полученного гидразона VI боргидридом натрия в метаноле.

Общий подход с синтезу 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид VIII (соединение CL-55) представлен на фигуре 1.

Синтез 2-хлор-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (III). К раствору 130 гр (1 моль) 2,4-дифторанилина (I) в 1000 мл ДМФА добавляют при охлаждении 87,5 мл (1,1 моль) хлорацетилхлорида (II), следя за тем, чтобы температура реакционной смеси не превышала 20°C. После окончания прибавления раствора хлорида (II) перемешивают при комнатной температуре раствор еще 2 часа. Затем выливают реакционную смесь в 2000 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Промывают его на фильтре многократно водой и сушат в вакуум-эксикаторе. Выход ацетамида (III) - 179 гр (87%). Т. пл. 101-102°C. ЯМР 1Н CDCl3 (δ, м.д., J, Гц): 4,20 (с, 2Н, ArCH2Cl); 7,10-7,25 (м, 2Н, Ar); 7,53 (м, 1Н, Ar); 10,25 (с, 1Н, Ar-NH-СО). Найдено (%): С 46.62, Н 2.99, N 6.84. Вычислено (%): С 46.74, Н 2.94, N 6.81. Масс-спектр, m/z: 205.

Синтез 2-морфолин-4-ил-2-тиоксо-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (IV). Предварительно приготавливают раствор 2,6 моль элементной серы в 800 мл ДМФА и добавляют одной порцией 2,6 моль морфолина. Полученную смесь перемешивают в течение 30 минут и добавляют к образовавшейся коричнево-красной суспензии раствор 179 гр (0,87 моль) хлорацетамида (III) в в 200 мл ДМФА, при охлаждении, следя за тем, чтобы температура не превышала 10°C. Полученную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 12 часов. После окончания реакции (контроль по ТСХ), реакционную смесь выливают в воду, подкисляют реакционную смесь до рН 4-5, затем отфильтровывают выпавшие бледно-желтые кристаллы и промывают их на фильтре многократно водой. Затем растворяют их в ацетоне, отфильтровывают непрореагировавшую серу. Затем упаривают ацетон, остаток перекристаллизовывают из этанола и получают 189 гр бледно-желтых кристаллов морфолида (IV). Выход - 76%.

Синтез 2-гидразино-2-тиоксо-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (V). Полученный морфолид (IV) растворяют в 500 мл изопропанола и добавляют 40 мл (0,79 моль) гидразин-гидрата и кипятят в течение 30 минут. Затем выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его в вакуум-эксикаторе. Выход: (V) - 101,2 гр, (73%). Т. пл. 154-156°C. ЯМР 1Н CDCl3 (δ, м.д., J, Гц): 7,10-7,26 (м, 2Н, Ar); 7,50 (м, 1Н, Ar); 10,30 (с, 1Н, Ar-NH-СО). Найдено (%): С 41.40, Н 3.18, N 18.25. Вычислено (%): С 41.56, Н 3.05, N 18.17. Масс-спектр, m/z: 231.

Синтез 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (VI). К 101 гр (0,44 моль) 2-гидразино-2-тиоксо-N-(2,4-дифтор-фенил)-ацетамида (V) в 500 мл этанола добавляют 0,44 моль 3-этокси-4-гидрокси-бензальдегида и кипятят при перемешивании в течение 5 минут. Охлаждают реакционную смесь и отфильтровывают 113,7 гр (68%) выпавших желтых кристаллов 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (VI), промывают их на фильтре холодным этанолом и используют далее без дополнительной очистки.

Синтез 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензил)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифтор-фенил)-ацетамида (VII). При охлаждении льдом (0-5°C) и перемешивании добавляют 17 гр (0,45 ммоль) боргидрида натрия к суспензии 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифтор-фенил)-ацетамида небольшими порциями. Реакционную смесь оставляют на 2 часа при охлаждении и перемешивании, затем добавляют 25 мл воды и нейтрализовывают разбавленной соляной кислотой до рН 7. Выпавший светло-желтый осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из изопропанола. Выход (VII) - 91,4 гр, (75%). Т. пл. 119-121°C. ЯМР 1Н CDCl3 (δ, м.д., J, Гц): 1.35 (т, 3H, -O-СН2СН3, J=7,22); 3,96 (кд, 2Н, -О-СН2СН3, J=7,00 (13,90)); 4,32 (с, 1Н, -NH-CH2-Ar); 6,98-7,62 (м, 6Н, Ar); 9,02 (с, 1Н, ArOH); 10,12 (с, 1Н, Ar-NH-СО). Найдено (%): С 53.45, Н 4.58, N 10.94. Вычислено (%): С 53.54, Н 4.49, N 11.02. Масс-спектр, m/z: 381.

Синтез 4-(3-этокси-4-гидрокси-бензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-карбокси-(2,4-дифторфенил)амида (соединение CL-55) (VIII). 91 гр (0,24 моль) 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензил)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифтор-фенил)-ацетамида (VII) добавляют к раствору 0,29 моль хлоруксусной кислоты в 5 мл изопропанола. Добавляют к реакционной смеси каталитическое количество ацетата аммония и кипятят 4 часа (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь охлаждают, отфильтровывают выпавшие кристаллы и промывают их на фильтре водой и холодным этанолом. Остаток четырехкратно перекристаллизовывают из этанола. Выход (VIII) - 75,7 гр, (75%). Т. пл. 129-130°C. ЯМР 1Н (400 MHz, DMSO-d6): 1.33 (т, 3H, -О-СН2СН3); 3,71 (с, 2Н, S-CH2-CO); 4,01 (кд, 2Н, -O-СН2СН3); 4,92 (с, 2Н, -NH-CH2-Ar); 6,75-6,81 (м, 2Н, Ar); 6,98 (с, 1Н, Ar); 7,12-7,17 (м, 1Н, Ar); 7,36-7,42 (м, 1Н, Ar); 7,59-7,65 (м, 1Н, Ar); 8,90 (с, 1Н, -NH-СН2-Ar); 10,06 (с, 1Н, ArOH). ЯМР 13С (100 MHz, DMSO-d6): 15.16, 25.48, 53.56, 64.29, 104.95, 111.98, 114.23, 115.88, 121.49, 128.02, 128.31, 141.16, 146.90, 154.93, 157.41, 158.00, 159.06, 159.75, 161.49; Найдено (%): С 56.50 Н 4.62, N 10.31. Вычислено (%): С 56.57 Н 4.50, N 10.42. Масс-спектр, m/z: 421.

Пример 2.

Исследование механизма действия 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) на штаммах клинического происхождения Pseudomonas aeruginosa с различным профилем резистентности к антибиотикам.

Механизм действия низкомолекулярного ингибитора ССТТ - CL-55: ингибирование транспорта в эукариотическую клетку факторов патогенности, эффекторных белков ССТТ, ExoS, ЕхоТ, ExoY и ExoU, в результате специфического подавления ССТТ патогена.

С целью изучения действия ингибитора ССТТ - CL-55 на клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa с разным профилем резистентности к антибиотикам были проведены следующие исследования:

1. Изучена роль ССТТ у клинических антибиотикорезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa на основе изучения наличие генов, кодирующих эффекторные белки ССТТ, и активности секреторного аппарата у этих штаммов в условиях in vitro.

2. Охарактеризовано ингибирующее действие 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) на функциональную активность ССТТ клинических антибиотикорезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa.

Изучение роли ССТТ у клинических антибиотикорезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa

Исследование проводили на 77 штаммах синегнойной палочки, выделенных из образцов клинического материала в стационарах Москвы. Штаммы были выделены из отделяемого дыхательных путей, из крови и отделяемого открытых инфицированных ран. 96% (74 штамма) были устойчивыми хотя бы к одному антибиотику, 62% характеризовались множественной резистентностью.

Изучение частоты встречаемости генов, кодирующих белки - эффекторы ССТТ псевдомонад, у полученных госпитальных штаммов проводили с помощью ПЦР с ДНК штаммов. При отработке условий проведения реакции были использованы референс-штаммы P.aeruginosa с известным ССТТ генотипом, РАО (exoS+exoT+exoY+exoU-) и РА103 (exoS-ехоТ+exoY+exoU+). В таблице 1 представлена последовательность праймеров, выбранных для определения наличия генов ССТТ P.aeruginosa.

Среди всех проанализированных штаммов exoU+ генотип встречался в 13,8%, полученных из отделений интенсивной терапии ("ОРИТ"), и в несколько большем проценте - 22,7% у штаммов из других отделений ("не-ОРИТ"). exoS+ генотип был выявлен у анализируемых госпитальных штаммов в значительно большем проценте, чем exoU+ генотип, что соответствует известным опубликованным данным. Так, в группе штаммов, полученных из "ОРИТ", exoS+ генотип был детектирован в 86,2%, а в группе "не-ОРИТ" - в 79,5%. В таблице 2 представлены результаты ССТТ генотипирования клинических штаммов P.aeruginosa при определении генов эффекторных белков методом ПЦР и результаты характеристики функциональной активности ССТТ при определении секреции ЕхоТ белка методом иммуноблота.

С целью изучения активности ССТТ у клинических штаммов псевдомонад в условиях in vitro использовали модель индукции функциональной активности транспортной системы при снижении концентрации кальция в среде культивирования бактерий. Для этого к активно делящейся культуре псевдомонад добавляли хелатор кальция, EGTA, и тестировали присутствие секреторного белка ЕхоТ в культуральной среде с помощью специфических антител методом иммуноблота. Ночную культуру исследуемых штаммов P. aeruginosa разводили 1/100 в свежей среде LB, добавляли 5 мМ EGTA и продолжали выращивание при перемешивании в течение 3 часов при 37°C. После культивирования бактериальные клетки осаждали центрифугированием. Внеклеточные белки концентрировали трихлоруксусной кислотой (10% насыщения), отмывали 100% ацетоном и суспензировали в 1-кратном буфере для образцов. Электрофорез в полиакриламидном геле проводили по методу Laemmli, после чего белки переносили методом полусухого блота из геля на нитроцеллюлозные мембраны с использованием системы ТЕ70 PWR (GE, Moscow, Russia).

Нитроцеллюлозные мембраны окрашивали красителем Ponceau S для проверки качества переноса, после чего отмывали раствором 20 mM Tris-HCl+150 тМ NaCl+0.05% Tween20 (TBS-T), блокировали 5% раствором обезжиренного молока в TBS-T и инкубировали с мышиными антителами к белку ЕхоТ в разведении 1/20 000 в течение ночи при 4°C. Реакцию учитывали после инкубации мембран с анти-мышиным конъюгатом, меченным пероксидазой хрена (разведение 1/5000) в течение 1 часа при комнатной температуре и обработкой мембран реагентом для хемилюминисценции. В качестве положительного контроля использовали очищенный препарат АДФ-рибозилирующего фрагмента ЕхоТ. Реакцию учитывали на хемилюминометре (Vilber Lourmat, Eberhardzell Germany).

Изучение функциональной активности ССТТ у полученных клинических штаммов P.aeruginosa в условиях индукции низкими концентрациями кальция показало, что 89% штаммов секретируют эффекторный белок ЕхоТ (табл. 2, фиг. 2).

Характеристику функциональной активности ССТТ госпитальных клинических штаммов P. aeruginosa проводили также методом определения цитотоксичности. Токсичность в отношении эукариотических клеток, связанная с секрецией ExoU или ExoS белков, в условиях in vitro проявляется очень быстро, в течение первых 3-4 часов, и выражается в нарушении целостности клеточной мембраны с последующей гибелью клеток путем некроза. Мы использовали в тестах на цитотоксичность клетки линии СНО (Chinese hamster ovary cells) и оценивали гибель клеток в тесте по количественному определению лактатдегидрогеназы в культуральной среде через 3 часа после внесения на клетки штаммов псевдомонад. Лактатдегидрогеназа - стабильный фермент, который присутствует в цитоплазме клетки, а при нарушении целостности цитоплазматической мембраны попадает во внешнюю среду.

К суточному монослою клеток СНО, выращенному в 96-луночном планшете, добавляли 18-часовую культуру псевдомонад с МОИ 10 и инкубировали 3 часа. Планшет центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин для осаждения бактерий, а надосадок отбирали. Определение лактатдегидрогеназы проводили с помощью набора CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, США) согласно инструкции. Цитотоксичность выражали в процентах по отношению к значениям в незараженных клетках.

В таблице 3 представлены результаты анализа цитотоксичности госпитальных штаммов псевдомонад. На основании полученных данных все штаммы можно было разделить на 4 группы по проценту гибели клеток: токсичные - Т (от 90 до 70%), среднетоксичные - С (от 70 до 50%), малотоксичные - М (от 50 до 20%) и нетоксичные - Н (менее 20%). Результаты показали, что среди протестированных штаммов с exoU+ генотипом токсичностью обладали 91,6%. Среди 31 штамма с exoS+ генотипом токсичными были 21 или 67,7%.

Таким образом, в совокупности полученные данные свидетельствуют о наличии ССТТ и ее активности у клинических штаммов с различным профилем антибиотикорезистентности и говорят в пользу ключевой роли системы секреции III типа в развитии инфекционного процесса, что делает ССТТ перспективной мишенью для подавления инфекции, вызванной мультирезистентными штаммами синегнойной палочки.

Ингибирующее действие 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) на ССТТ клинических антибиотикорезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa.

Ингибирующее действие CL-55 изучали в 2-х тестах: 1) in vitro при индукции ССТТ снижением содержания кальция и определением эффекторного белка ЕхоТ методом иммуноблота; 2) методом определения цитотоксичности для клеток СНО.

Для оценки ингибирующей активности CL-55 методом иммуноблота штаммы P. aeruginosa выращивали в жидкой среде LB в присутствии индуктора EGTA (5 мМ) и при добавлении разных концентраций химического соединения CL-55. После выращивания культуры в течение 3 часов бактериальные клетки осаждали центрифугированием. Концентрирование белков, электрофорез и окрашивание нитроцеллюлозных фильтров антителами к белку ЕхоТ проводили в соответствии с методикой описанной выше.

Было показано, что CL-55 дозозависимо подавляет транслокацию эффекторного белка ССТТ P. aeruginosa ЕхоТ в условиях индукции in vitro. Ингибирование наблюдали при концентрациях 150 и 200 мкМ (фиг. 3) у клинических штаммов, характеризующихся как exoU+, так и exoS+ генотипом. Таким образом, в тесте in vitro в условиях индукции ССТТ псевдомонад было показано ингибирующее действие низкомолекулярного соединения CL-55.

Изучение влияния ингибитора ССТТ CL-55 на цитотоксичность клеток СНО проводили по описанной выше методике. Ингибитор добавляли в разных концентрациях к суспензии бактериальных клеток и инкубировали 30 мин до внесения на клетки СНО.

При изучении цитотоксичности свежевыделенных штаммов бактерий P. aeruginosa на клеточной линии СНО было показано, что добавление к клеткам псевдомонад изучаемых штаммов в дозе 10 МОИ, вызывало сильную цитотоксичность клеток. Предварительное инкубирование бактерий с ингибитором ССТТ в дозах 100 и 150 мкМ снижало цитотоксичность клеток до 0%. В таблице 4 показано действие ингибитора системы секреции III типа CL-55 на клетки СНО, зараженные штаммами P.aeruginosa с exoU+ генотипом. В таблице 5 показано действие ингибитора системы секреции III типа CL-55 на клетки СНО, зараженные штаммами P. aeruginosa с exoS+ генотипом.

Таким образом, было показано, что при действии ингибитора CL-55 на изученные штаммы псевдомонад подавлялась их цитотоксичность, связанная с ССТТ. В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что низкомолекулярное соединение 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) специфически ингибирует секрецию токсинов- эффекторов системы секреции III типа псевдомонад, вызывающих гибель эукариотических клеток. Блокирование in vitro системы секреции III типа Pseudomonas aeruginosa было показано для клинических штаммов с различными генотипами по генам эффекторных белков ССТТ и различным профилем антибиотикорезистентности.

Пример 3.

Изучение токсичности 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) для животных.

Исследование острой токсичности CL-55 низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа при однократном введении мышам

Острую токсичность изучали на мышах и крысах (самцах и самках) при внутрижелуд очном и внутрибрюшинном способах введения. Срок наблюдения составил 14 суток. Ингибитор животным вводили в возрастающих дозах. Из-за низкой токсичности препарата не была установлена ЛД50. Наибольшая доза, вводимая мышам и крысам, составила 5000 мг/кг, что превышает предполагаемую суточную терапевтическую дозу для человека в 100 раз. Однократное введение Ингибитора CL-55 в высоких дозах не вызывает гибели и токсических изменений в организме животных.

Результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней, а также данные некропсии свидетельствуют о его хорошей переносимости.

Исследование субхронической токсичности CL-55 низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа при многократном введении животным

Исследования субхронической токсичности проводили на половозрелых крысах линии Вистар (самцах и самках) и кроликах породы Советская шиншилла (самцах и самках). Лекарственное средство вводили внутрижелудочно в течение 14 суток 1 раз в день в 2 дозах: терапевтической (50 мг/кг) и десятикратной терапевтической (500 мг/кг). При исследовании токсичности использовали общепринятые методы: интегральные и физиологические показатели, исследования клинических и биохимических показателей крови, исследования мочи, морфометрическую и гистологическую оценку внутренних органов и тканей. Наблюдение за состоянием животных велось ежедневно. Физиологические и гематологические исследования проводили до введения, через сутки и через 28 суток после отмены препарата, морфометрические и гистологические - через сутки и через 28 суток.

Было показано, что многократное, в течение 14 суток, введение антибактериального лекарственного средства в предполагаемой терапевтической дозе, как крысам, так и кроликам, не оказывало выраженного токсического воздействия на функцию основных физиологических систем организма, обменные процессы, систему крови, структуру и функцию внутренних органов животных обоего пола.

При введении крысам дозы 500 мг/кг были выявлены негативные сдвиги: изменение структуры ткани тимуса, снижение в сыворотке крови аланинаминотрансферазы, количество натрия, креатинина и мочевины. Все патологические явления носили обратимый характер.

Исследования на двух видах животных обоего пола (крысах и кроликах) показало, что 14-дневное внутрижелудочное введение ингибитора CL-55 не оказывает местно-раздражающего действия на слизистую желудка.

Изучение аллергизующих и иммунотоксических свойств CL-55 - низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа

Исследования, проведенные в объеме комплексной оценки аллергогенности (активная кожная анафилаксия, гиперчувствительность замедленного типа, реакция дегрануляции тучных клеток при пероральном введении) на морских свинках, показали, что ингибитор CL-55 при введении в предполагаемой терапевтической дозе (50 мг/кг) не обладает аллергизирующими свойствами. В то же время, введение десятикратной терапевтической дозы (500 мг/кг) приводит к развитию гиперчувствительности немедленного и замедленного типа.

Состояние иммунной системы после введения десятикратной (500 мг/кг) и стократной (5000 мг/кг) терапевтической дозы ингибитора CL-55 оценивали по изменению массы и клеточности иммунокомпетентных органов и при оценке фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов.

По полученным данным можно сделать вывод, что изучаемый препарат в высоких дозах не оказывает влияния на иммунную систему.

Изучение мутагенных свойств и канцерогенности CL-55 - низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа

Изучение мутагенной активности и потенциальной канцерогенности соединения CL-55 пооводили в тесте Эймса, в тесте на оценку ДНК-повреждений методом ДНК-комет и в тесте на индукцию хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей.

Результаты проведенных экспериментов позволяют сделать следующие выводы:

1. Соединение CL-55 не проявляет мутагенной активности на штаммах Salmonella typhimurium ТА98, ТА100, ТА1535, ТА1537 и на комбинации штаммов E.coli рКМ101 и uvrA, в условиях с метаболической активацией и без таковой.

2. Соединение CL-55 при однократном внутримышечном введении в дозах 20 и 200 мг/кг на срок 3 и 18 часов не индуцирует ДНК-повреждения в клетках костного мозга, печени, почек и селезенки мышей.

3. При однократном внутримышечном введении в дозах 20 и 200 мг/кг и при многократном введении в дозе 20 мг/кг соединение CL-55 не индуцирует хромосомных аберраций в клетках костного мозга самцов и самок мышей.

Согласно общепринятой практике и нормативным документам совокупность этих наблюдений свидетельствует об отсутствии у соединения CL-55 мутагенной и потенциальной канцерогенной активности.

Изучение репродуктивной токсичности

Было проведено изучение репродуктивной токсичности ингибитора системы секреции III типа CL-55 на животных. Субстанцию вводили внутрижелудочно до спаривания крысам самцам в течение 56 дней, самкам в течение 15 дней в дозах 50 мг/кг и 500 мг/кг (эквивалентных терапевтической и десятикратной терапевтической дозе для человека). Затем опытных животных спаривали с контрольными самками и самцами.

Во время исследования изучали: половое поведение животных, влияние препарата на генеративную функцию самцов и самок, показатели физического развития потомства.

Было установлено, что ингибитор CL-55, вводимый самцам и самкам в терапевтической дозе, не оказывает токсического действия на генеративную функцию и показатели эмбриональной гибели. При наблюдении за развитием потомства не было выявлено различий в динамике массы тела, выживаемости и физическом развитии крысят контрольной и опытных групп.

Введение ингибитора CL-55 самкам в дозе, превышающей суточную терапевтическую в 10 раз, повышает предимплантационную гибель плодов. Длительное введение ингибитора CL-55 самцам в десятикратно увеличенной дозе, ведет к снижению у них индекса сперматогенеза, количества сперматогоний в канальцах, а также к снижению половой активности. Длительное применение ингибитора CL-55 в высоких дозах может приводить к некоторым нарушениям генеративной функции.

Таким образом, лекарственное средство ингибитор системы секреции III типа CL-55, применяемое в терапевтической дозе, не приводит к изменению генеративной функции.

В результате проведенных токсикологических исследований установлено, что 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) является малотоксичным препаратом, что позволяет рекомендовать низкомолекулярный ингибитор системы секреции III типа CL-55 для дальнейшего проведения клинических испытаний.

Пример 4.

Влияние 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на жизнеспособность бактерий in vitro и in vivo.

Механизм действия ингибитора системы секреции III типа, предполагает подавление эффекторной функции P.aeruginosa. При этом препарат не влияет на жизнеспособность бактерий, т.е. не оказывает прямого бактерицидного действия в условиях in vitro. Антибактериальный эффект препарата CL-55 основан на снижении вирулентности возбудителя, в результате подавления секреции эффекторных белков псевдомонад, являющихся ключевыми факторами патогенности с токсической активностью. Действие ингибитора системы секреции способствует ограничению развития инфекции и подавлению токсических эффектов в зараженном организме. Существенным преимуществом ингибитора ССТТ перед антибиотиками является отсутствие негативного влияния на нормальную микрофлору человека.

Характеристика влияния CL-55 - ингибитора системы секреции III типа, на жизнеспособность Pseudomonas aeruginosa

Для изучения влияния ингибитора системы секреции III типа на жизнеспособность P. aeruginosa использовали эталонные штаммы (из международных и региональных коллекций) РА-103; РАО; ARCC 27853 и свежевыделенные штаммы (штаммы) P.aeruginosa из образцов клинического материала: №/№-12130-15/2015; 1625-36/2015; 19390-15/2015; 32461-15/2015; 41431-15/2015. Исследования проводили методом серийных разведений в жидкой питательной среде с последующим высевом на твердые питательные среды для подсчета выросших колоний. Для посева использовали цитримидный агар следующего состава: пептона - 20 г; агара - 13 г; хлористого магния - 1,4 г; сернокислого калия - 10 г; цитримида - 0,3 г; глицерина - 10 мл; дистиллированной воды до 1000 мл; рН-7,0-7,2.

Подсчет колоний проводили по формуле: N=С×К/n×V,

где N - количество микроорганизмов в 1 мл; С - сумма колоний на всех чашках, n - число чашек, К - разведение, из которого сделан высев; V - объем суспензии, взятый для посева, мл.

На цитримидном агаре наблюдали сине-зеленый пигмент Р. aeruginosa. Далее проводили сравнение при подсчете КОЕ/мл в контрольных и опытных образцах.

Приготовление рабочих концентраций CL-55 проводили методом двукратных разведений. В качестве растворителя использовали жидкую питательную среду. Жидкий питательный бульон разливали по 0,5 мл в пробирки. В первую пробирку вносили 0,5 мл ингибитора рабочего раствора в концентрации 200 мг/мл. После тщательного перемешивания переносили мерной пипеткой 0,5 мл из этой пробирки во вторую, перемешивали и переносили тоже количество смеси из второй в третью и т.д. Пробирка, не содержащая препарат, служила контролем на рост культуры микроорганизмов. После этого во все пробирки с серийно разведенным препаратом и в контрольную пробирку вносили по 0,2 мл взвеси тест-микроорганизмов.

Результаты влияния ингибитора системы секреции III типа на жизнеспособность P. aeruginosa in vitro представлены в таблице 6.

При подсчете колоний, выросших на твердых питательных средах, после совместного культивирования штаммов бактерий Р. aeruginosa с ингибитором системы секреции III типа было показано, что ингибитор не оказывал подавляющего действия на рост музейных штаммов бактерий P. aeruginosa при использовании 3-х разных доз препарата - 100, 50 и 25 мг/л. Эти дозы были выбраны на основании результатов предварительных экспериментов по определению эффективной дозы ингибитора в отношении подавления эффекторной функции псевдомонад в условиях in vitro.

При изучении действия ингибитора на жизнеспособность свежевыделенных штаммов P. aeruginosa с различным профилем антибиотикорезистентности также не наблюдали подавления роста при использовании тех же концентраций ингибитора (Табл. 6). Полученные данные согласуются с механизмом действия разрабатываемого препарата, который подавляет вирулентность псевдомонад, но не влияет на их жизнеспособность.

Таким образом, в соответствии с механизмом действия ингибитор ССТТ CL-55 не подавляет жизнеспособность синегнойной палочки при культивировании in vitro.

Изучение влияния ингибитора ССТТ CL-55 на количественный состав кишечной микрофлоры мышей.

Для изучения влияния ингибитора на нормальную микрофлору проводили количественную характеристику состава кишечной микрофлоры мышей при действии CL-55 и препарата сравнения - антибиотика ципрофлоксацина.

Метод определения состава кишечной микрофлоры

Материалом для исследования служил кал после естественной дефекации, который собирали в стерильный герметичный контейнер с широким горлышком и плотно закрывающейся крышкой, без консерванта. После взвешивания 1 г нативного кала его гомогенизировали в 9 мл физиологического раствора, получая исходное разведение материала (10-1). Из исходного разведения делали дополнительные 10-кратные разведения в физиологическом растворе. Из разведений делали дозированные посевы на питательные среды для культивирования различных групп микроорганизмов. Посевы инкубировали при 37°C в течение 24-48 часов; чашки со средой Сабуро оставляли после этого еще на 2-е суток при комнатной температуре. Лактобактерии культивировали в термостате с 5% CO2 в течение 48 ч.

В работе использовали следующие питательные среды:

1) среда ЖСА - желточно-солевой агар для выявления стафилококков;

2) среда Эндо - для выделения энтеробактерий, в т.ч. лактозоположительной кишечной палочки;

3) среда Сабуро - агар для выделения дрожжеподобных грибов рода Candida;

4) среда MRS - агар для выделения микроаэрофильных лактобактерий;

5) бифидум среда - полужидкий агар для бифидобактерий;

6) кровяной агар - для выявления гемолитических бактерий, в т.ч. гемолизирующей E.coli;

7) энтерококковая среда - для выявления фекальных стрептококков;

8) Hektoen Enteric Agar - среда для обнаружения патогенных энтеробактерий.

Материал от животных инкубировали при 37°C в течение 24-48 часов.

Изучение количественного состава кишечной микрофлоры мышей при введении CL-55 и антибиотика сравнения ципрофлоксацина

Мыши стока Balb/c получали 2 препарата: CL-55 200 мг/кг 2 раза в день 5 дней подряд энтерально и антибиотик ципрофлоксацин 100 мг/кг 2 раза в день 5 дней подряд энтерально. Сбор экскрементов производился 3 раза: до начала введения препаратов, на 15-е и 28-е сутки после начала введения препаратов.

Проведенные эксперименты позволили получить результаты по изменению состава нормальной микрофлоры толстого кишечника животных на 2 срока после начала введения исследуемых препаратов: 200 мг/кг CL-55 и 100 мг/кг ципрофлоксацина. Результаты количественного состава кишечной микрофлоры мышей до начала введения CL-55 и ципрофлоксацина представлены в таблице 7.

Проведенные эксперименты по сравнительной оценке количественного и качественного состава кишечной микрофлоры при действии изучаемого препарата CL-55 и антибиотика ципрофлоксацина свидетельствуют о том, что применение CL-55 в дозе 100 мг/кг два раза в день энтерально на протяжении 5-и дней не оказывало негативного бактерицидного действия на нормальную микрофлору кишечника животных. В таблице 8 представлены результаты изучения количественного состава кишечной микрофлоры мышей на 15-е сутки после начала введения CL-55 и ципрофлоксацина.

Результаты исследования показали, что количество изучаемых компонентов облигатной микрофлоры: эпидермального стафилококка, лактозоположительной кишечной палочки, лактобактерий, бифидобактерий, фекального стрептококка, при микробиологическом исследовании кала до начала применения CL-55, через неделю после окончания и через три недели после окончания применения препарата практически оставалось на одном уровне. В таблице 9 представлены результаты изучения количественного состава кишечной микрофлоры мышей на 28-е сутки после начала введения CL-55 и ципрофлоксацина.

Напротив, применение ципрофлоксацина в дозе 100 мг/кг 2 раза в день в течение 5 дней энтерально, привело к снижению количества лактобактерий с 108 КОЕ/г до 105 КОЕ/г, бифидобактерий с 109 КОЕ/г до 106 КОЕ/г, лактозоположительной кишечной палочки с 108 КОЕ/г до 106 КОЕ/г через 15 дней после начала лечения. На 28-е сутки эксперимента в этой группе мышей с введением ципрофлоксацина было отмечено увеличение количества лактобактерий и бифидобактерий на 3 порядка с 105 до 108 по сравнению с предыдущим сроком 15 суток. Уровень лактозоположительной кишечной палочки в этой группе восстановился полностью до исходного уровня 108 КОЕ/г.

Проведенный статистический анализ количественного состава кишечной микрофлоры мышей на одном сроке с применением непараметрического критерия Краскела-Уоллиса показал достоверное отличие для всех проанализированных групп. При анализе динамики показателя состава микрофлоры на разных сроках с применением непараметрического критерия Фридмана, установлено достоверное отличие между сроком до введения препаратов и 15-ми и 28-ми сутками для всех групп животных (p<0,05).

Таким образом, по результатам исследования можно сделать вывод о том, что изучаемый ингибитор ССТТ 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид (CL-55), в соответствии с механизмом его действия, не обладает бактерицидным действием на кишечную микрофлору животных. Отсутствие негативного влияния на состав кишечной микрофлоры ингибитора ССТТ перспективного для лечения антибиотикорезистентных госпитальных штаммов синегнойной палочки является его принципиальным преимуществом перед используемыми антибиотиками.

Пример 5.

Определение эффективной ингибирующей дозы 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на лабораторных животных

Определение эффективной терапевтической дозы ингибитора ССТТ проводили при пероральном способе введения препарата. Штаммы P. aeruginosa.

В таблице 10 приведена характеристика клинических штаммов Р. aeruginosa, использованных в примерах 5, 6 и 7.

Для моделирования сепсиса, индуцированного антибиотикорезистентными клиническими штаммами P. aeruginosa, были использованы мыши инбредной линии A/JsnYCit (A/Sn), поддерживаемые в питомнике ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ в соответствии с требованиями по содержанию животных МЗ РФ №775. В опытах использовали самцов, весом 18-20 г на начало эксперимента; каждая группа для исследования состояла из 6 животных. Все исследования были выполнены в двух повторах.

Содержание животных

Животные содержались в стандартных условиях в по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев).

Подготовка культуры для заражения. Подготовка бактериальной культуры для заражения была выполнена следующим образом: бактериальную культуру выращивали на жидкой среде Luria-Bertani (LB - бульон) фирмы «DIFCO», USA, при 37°C 20 часов. Через 20 часов рассчитывали титр культуры методом десятикратных разведений на твердой питательной среде. Для заражения культуру разводили физиологическим раствором до необходимой концентрации в соответствии с титром.

Заражение. Для создания экспериментальной септической синегнойной инфекции мышам вводили внутрибрюшинно подготовленные как описано выше культуры P. aeruginosa, в различных дозах. Объем вводимой культуры составил 0.5 мл на мышь. Количество мышей в каждой группе составляло 6 животных. После заражения проводили ежесуточно мониторинг продолжительности жизни мышей (критерий - смертность). Также определяли количество бактерий, высеваемых из органов зараженных животных. Материалом для посева для определения количества псевдомонад при септической инфекции служили смывы из брюшной полости (перитониальные лаважи), селезенка, а также кровь.

Метод определения динамики гибели животных. Ежедневно после заражения 2 раза в день, утром и вечером, проводили наблюдения за состоянием животных и фиксировали сроки падежа экспериментальных животных.

Метод определения количества бактерий в крови и органах зараженных животных

Мышей, переживших инфекцию, умерщвляли цервикальной дислокацией. Кровь отбирали путем кардиальной пункции и помещали в пробирки, содержащие 100 единиц гепарина натрия. Перитонеальные смывы получали введением в брюшную полость 5 мл стерильного физиологического раствора. Селезенки гомогенизировали с помощью гомогенизатора SilentcrusherM в 1 мл физиологического раствора, полученные гомогенаты центрифугировали 10 мин при 800 об/мин (центрифуга 5415 D Eppendorf) для удаления грубых остатков тканей. Затем готовили серии 10-кратных разведений исходной суспензии гомогенатов селезенок в физиологическом растворе, и 500 мкл каждого разведения помещали на чашку Петри, покрытую цитрамидным агаром. Аналогично готовили серии 10-кратных разведений в физиологическом растворе образцов крови и перитониальных лаважей. Чашки Петри инкубировали при 37°C и через 24 часа культивирования производили подсчет колоний. Концентрацию псевдомонад в органах выражали числом КОЕ в 1 мл.

Определение эффективной дозы для перорального введения CL-55 на модели септической инфекции

Эффективная доза CL-55 была определена на разработанной модели септической инфекции. Для заражения использовали клинические штаммы с различным генотипом по эффекторам ССТТ (exoU+ или exoS+). Заражение мышей выполняли внутрибрюшинно в соответствии с описанным выше методом. Дозы для заражения были выбраны на основании полученных результатов по определению ЛД50 и ЛД100 для каждого штамма.

Пероральное введение препарата CL-55. При пероральном введении препарата применяли атравматичный металлический зонд (так называемую гаважную иглу), который вводили в пищевод до желудка. Субстанцию препарата тщательно растирали в фарфоровой ступке с минимальным количеством Твин-80. Затем постепенно при интенсивном перемешивании добавляли небольшие порции 1% крахмального клейстера и растирали до однородной массы. Контрольные животные получали эквивалентные объемы крахмального клейстера с Твин-80.

Для проведения эксперимента были выбраны 4 госпитальных штамма exoS+ и exoU+ типа, имеющие различный профиль антибиотикорезистентности.

Дизайн экспериментов для 4-х штаммов

Были сформированы группы по 6 мышей в каждой. Исследования были выполнены в двух повторах.

1 группа - контроль заражения

2 группа - зараженные мыши +150 мг/кг CL-55

3 группа - зараженные мыши +100 мг/кг CL-55

4 группа - зараженные мыши +50 мг/кг CL-55

5 группа - незараженные мыши +150 мг/кг CL-55

6 группа - незараженные мыши +100 мг/кг CL-55

7 группа - незараженные мыши +50 мг/кг CL-55

Введение препарата в течение 3-х дней 1 раз в сутки.

Мониторинг развития инфекции проводили по динамике гибели животных в течение 7 дней после заражения. Возможное негативное действие препарата CL-55 определяли при введении препарата в 3-х концентрациях незараженным мышам.

Не наблюдали гибели животных при введении 150 мг/кг, 100 мг/кг и 50 мг/кг CL-55 незараженным животным. В таблице 11 представлены результаты по гибели и выживаемости животных по дням при внутрибрюшинном заражении дозой 4×106 КОЕ/мышь клиническим штаммом КБ6/6/2014 exoS+ и получавших CL-55 в дозах 150 мг/кг, 100 мг/кг и 50 мг/кг в течение 3-х дней перорально. Данные приведены для экспериментов в 2-х повторах.

В таблице 12 представлены результаты по гибели и выживаемости животных по дням при внутрибрюшинном заражении дозой 2×106 КОЕ/мышь клиническим штаммом 693/6/2014 exoS+ и получавших CL-55 в дозах 150 мг/кг, 100 мг/кг и 50 мг/кг в течение 3-х дней перорально. Данные приведены для экспериментов в 2-х повторах.

В таблице 13 представлены результаты по гибели и выживаемости животных по дням при внутрибрюшинном заражении дозой 1×106 КОЕ/мышь клиническим штаммом 1840/36/2015 exoU+ и получавших CL-55 в дозах 150 мг/кг, 100 мг/кг и 50 мг/кг в течение 3-х дней перорально. Данные приведены для экспериментов в 2-х повторах.

В таблице 14 представлены результаты по гибели и выживаемости животных по дням при внутрибрюшинном заражении дозой 1×106 КОЕ/мышь клиническим штаммом 1625/36/2015 exoU+ и получавших CL-55 в дозах 150 мг/кг, 100 мг/кг и 50 мг/кг в течение 3-х дней перорально. Данные приведены для экспериментов в 2-х повторах.

Таким образом, введение перорально препарата CL-55 в дозах 50 мг/кг в течение 3-х дней 1 раз в сутки приводило к небольшому повышению выживаемости, в 1,5 раза. Введение CL-55 в дозе 100 мг/кг приводило к выраженному снижению смертности, в 2 раза. Введение в том же режиме препарата CL-55 в дозе 150 мг/кг заметно снижало смертность животных в группах, зараженных каждым из штаммов: для зараженных КБ6/6/2014 - в 2,3 раза; для зараженных 693/6/2014 - в 2 раза; для зараженных 1840/36/2015 - в 1.6 раза; для зараженных штаммом 1625/36/2015 выживаемость, получавших CL-55 мышей, составила 92%, при том, что все зараженные мыши без лечения погибли.

Для того чтобы оценить подавление пседомонадной инфекции в органах зараженных мышей, было осуществлено моделирование септической инфекции, так же как описано выше. Заражение осуществляли не летальной, но инфекционной дозой 5×104 КОЕ/мышь штамма КБ6/6/2014, что приводило к развитию псевдомонадной инфекции в органах, но не смерти животных в период наблюдения в течение 4 суток. CL-55 зараженным мышам вводили перорально в дозе 100 мг/кг в течение 3-х дней 1 раз в сутки, что приводило к полному подавлению инфекции в исследованных биологических образцах.

В таблице 15 приведены данные по определению средних количеств псевдомонад в высевах из органов животных, при заражении не летальной дозой штамма КБ6/6/2014, в группах животных получавших CL-55 и без лечения.

Таким образом, на основании проведенных экспериментов было показано, что при пероральном введении препарата CL-55 в течение трех дней в дозе 100 мг/кг в сутки наблюдали подавление накопления псевдомонад в перитонеальном лаваже, крови и селезенке, т.е. был показано эффективное антибактериальное действие ингибитора ССТТ.

Тем самым, минимальная эффективная доза или фармакологически активная доза для CL-55 составила 100 мг/кг для мышей. На модели летальной септической инфекции, вызванной антибиотикорезистентными клиническими штаммами, при использовании всех испытанных доз отмечали снижение смертности у мышей в 1,5-4 раза, что свидетельствует о возможности достижения более эффективного терапевтического действия препарата при изменении режима терапии (изменение сроков и кратности введения препарата).

Пример 6.

Изучение терапевтической эффективности ингибитора ССТТ на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотипов.

Изучение терапевтической эффективности полученного ингибитора CL-55 проводили на модели септической инфекции у мышей и использовали методы накопления псевдомонад и работы с лабораторными животными описанные в Примере 5.

Мышей заражали штаммами псевдомонад двух разных генотипов exoU+ и exoS+. Эффективность действия CL-55 оценивали по динамике гибели животных в течение 4 дней после заражения и по антибактериальному действию CL-55 в крови и селезенке через 24, 48 и 72 часа после заражения с использованием метода бактериологического высева.

Дизайн эксперимента с штаммом exoU+

Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.

1 группа - контроль заражения дозой 2,5×106 КОЕ/мышь (ЛД75) штамма 1840/36/2015 exoU+

2 группа - заражение + лечение CL-55 дозой 100 мг/кг 1-кратно 3 суток

3 группа - заражение + лечение дозой CL-55 50 мг/кг 2-кратно 3 суток

В таблице 16 приведены результаты терапевтической эффективности CL-55 по выживаемости животных по дням после заражения дозой 2,5×106 КОЕ/мышь (ЛД75) штаммом 1840/36/2015 exoU+ (данные для 2 повторов, в каждой группе по 6 животных).

Было показано, что при однократном в течение дня введении препарата CL-55 в дозе 100 мг/кг на протяжении 3 суток после заражения наблюдали снижение гибели животных с 75% (в контроле) до 25%. Увеличение кратности введения препарата с дозой 50 мг/кг до 2-х раз в сутки, в течение 3-х дней после заражения повысило эффективность лечения, более 90% животных выживали.

Для того, чтобы оценить подавление пседомонадной инфекции в органах зараженных мышей после терапевтического введения CL-55, был поставлен следующий эксперимент.

Дизайн эксперимента с штаммом exoU+

Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.

1 группа - контроль заражения дозой ЛД50 (1×106 КОЕ/мышь) штамма 1840/36/2015

2 группа - заражение + лечение CL-55 дозой 100 мг/кг 1-кратно в течение 3-х суток

3 группа - заражение + лечение CL-55 дозой 50 мг/кг 2-кратно в течение 3-х суток

Мышей заражали дозой ЛД50 (1×106 КОЕ/мышь) штамма 1840/36/2015. Лечение начинали в день заражения. Вскрытие осуществляли через 24, 48 и 72 часа после заражения для выживших мышей. В таблице 17 приведены результаты по микробиологическому выделению и определению среднего количества псевдомонад в высевах из селезенок и крови мышей, зараженных дозой ЛД50 (1×106 КОЕ/мышь) штамма 1840/36/2015 в ходе лечения CL-55 в дозе 100 мг/кг однократно.

Результаты показали, что лечение по схеме 100 мг/кг 1 раз в день в течение 3-х дней приводит к снижению размножения синегнойной палочки как в селезенке, так и в крови. При этом наибольшую разницу по снижению бактериальной нагрузки наблюдали начиная с 48 часов после заражения как для крови, так и для селезенки.

В таблице 18 приведены результаты по определению среднего количества псевдомонад в высевах из селезенок и крови мышей, зараженных дозой ЛД50 (1×106 КОЕ/мышь) штамма 1840/36/2015 в ходе лечения CL-55 в дозе 50 мг/кг двукратно.

Лечение по схеме 50 мг/кг 2 раза в день в течение 3-х дней показало эффективное подавление размножения псевдомонад к 48 и 72 часам после заражения. К этим срокам в селезенке и в крови практически полностью отсутствовали бактерии.

Подавление пседомонадной инфекции в органах зараженных мышей при использовании отработанной схемы терапии оценивали также при заражении штаммом КБ6/6/2014 exoS+ генотипа.

Дизайн эксперимента с штаммом exoS+

Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.

1 группа - контроль заражения дозой ЛД10 (1×106 КОЕ/мышь) штамма КБ6/6/2014

2 группа - заражение + лечение CL-55 дозой 50 мг/кг 2-кратно в течение 3 суток

Мышей заражали дозой ЛД10 (1×106 КОЕ/мышь) штамма КБ6/6/2014. Лечение начинали в день заражения. Вскрытие осуществляли через 72 часа после заражения для выживших мышей.

В таблице 19 представлены результаты по определению среднего количества псевдомонад в высевах из селезенок и крови мышей, зараженных дозой ЛД10 (1×106 КОЕ/мышь) штамма КБ6/6/2014 в ходе лечения CL-55 в дозе 50 мг/кг двукратно.

Таким образом, была показана терапевтическая эффективность препарата CL-55 - низкомолекулярного ингибитора ССТТ псевдомонад. В качестве эффективной схемы терапии было выбрано лечение в дозе 50 мг/кг 2 раза в день в течение 3-х дней после заражения. Лечение по такой схеме приводило к снижению гибели мышей на 91,7% при заражении псевдомонадами дозой равной ЛД75 и 100% выживаемости при заражении дозой ЛД50 и ЛД10. Оценка антибактериального действия препарата CL-55 выявила снижение накопления возбудителя в крови и селезенке уже через 1 сутки после начала лечения. Через 48 и 72 часа в селезенке и крови леченных мышей возбудитель практически полностью отсутствовал. Терапевтическая эффективность 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида - ингибитора ССТТ была установлена на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотипов.

Пример 7.

Изучение профилактической эффективности ингибитора ССТТ на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотипов

Изучение профилактической эффективности полученного ингибитора CL-55 проводили на модели септической инфекции у мышей и использовали методы накопления псевдомонад и работы с лабораторными животными описанные в Примере 5.

Лекарственное средство вводилось лабораторным животным перорально в течение 3-х суток до заражения. Эти сроки были выбраны на основании первичных данных по фармакокинетическим исследованиям, которые свидетельствуют о том, что после перорального введения CL-55 он накапливается в хорошо васкуализированных органах, таких как, печень, селезенка, легкие. Мышей заражали штаммами псевдомонад двух разных генотипов, exoS+ и exoU+.

Дизайн эксперимента для exoS+ генотипа

Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.

1 группа - контроль инфекции при заражении дозой 4×106 КОЕ/мышь (ЛД50) штаммом КБ6/6/2014

2 группа - профилактика CL-55 дозой 150 мг/кг 3 суток + заражение

3 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг 3 суток + заражение

4 группа - профилактика CL-55 дозой 50 мг/кг 3 суток + заражение

Эффективность профилактического действия CL-55 оценивали по динамике гибели животных в течение 4 дней после заражения.

В таблице 20 приведены результаты по изучению эффективности профилактики различными дозами CL-55 в течение 3 суток - выживаемость животных по дням после заражения дозой 4×106 КОЕ/мышь (ЛД50) штаммом КБ6/6/2014 exoS+ (данные для 2 повторов, в каждой группе 6 животных). Результаты исследования показывают высокую профилактическую эффективность перорального введения CL-55 в течение 3-х суток в дозах 150 и 100 мг/кг в отношении выживаемости животных, зараженных дозой ЛД50 штамма КБ6/6/2014.

Дизайн эксперимента для exoS+ генотипа

Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.

1 группа - контроль инфекции при заражении дозой 1×107 КОЕ/мышь (ЛД100) штаммом КБ6/6/2014

2 группа - профилактика CL-55 дозой 150 мг/кг 3 суток + заражение

3 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг 3 суток + заражение

4 группа - профилактика CL-55 дозой 50 мг/кг 3 суток + заражение

При заражении дозой ЛД100 штамма КБ6/6/2014 результаты выживаемости животных, после профилактического введения CL-55 в течение 3-х суток в дозах 150 и 100 мг/кг были ниже, однако против 100% гибели животных в контрольных группах 67 и 58% животных выживало для доз 150 и 100 мг/кг соответственно. В таблице 21 приведены результаты исследования эффективности профилактики дозами CL-55 150 и 100 мг/кг в течение 3 суток с последующим заражением мышей дозой 1×107 КОЕ/мышь (ЛД100) штамма КБ6/6/2014 - выживаемость животных по дням после заражения (данные для 2 повторов, в каждой группе 6 животных).

Для того, чтобы оценить подавление пседомонадной инфекции в органах зараженных мышей после профилактического введения CL-55, был поставлен следующий эксперимент.

Дизайн эксперимента для штамма exoS+

Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.

1 группа - контроль инфекции при заражении ЛД50 (4×106 КОЕ/мышь) штамма КБ6/6/2014

2 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг за 24 ч. до заражения

3 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг в течение 2 суток за 48 ч. до заражения

4 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг в течение 3 суток за 72 ч. до заражения

Мышей заражали дозой ЛД50 (4×106 КОЕ/мышь) штамма КБ6/6/2014 после окончания профилактики CL-55. Вскрытие осуществляли через 24 ч. после заражения. В таблице 22 приведены результаты определения среднего количества псевдомонад в высевах из селезенок мышей, зараженных дозой ЛД50 (4×106 КОЕ/мышь) штамма КБ6/6/2014 после профилактического введения CL-55 в дозе 100 мг/кг за 24 часа, 48 часов и 72 часа до заражения.

Таким образом, даже одна профилактическая доза 100 мг/кг CL-55 оказывает выраженное антибактериальное действие и приводит к снижению количества псевдомонад в селезенках на 50% по сравнению с группой без профилактики. Увеличение кратности введения профилактических доз CL-55 до 3-х раз приводит практически к полному подавлению накоплению возбудителя в селезенках.

Было проведено изучение эффективности профилактических режимов введения ингибитора системы секреции III типа, лекарственного средства CL-55, при пероральном введении, на септическую псевдомонадную инфекцию, вызванную синегнойной палочкой ExoU фенотипа при заражении дозами ЛД50 и ЛД75.

Дизайн эксперимента с штаммом exoU+

Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.

1 группа - контроль инфекции при заражении дозой 1,15×106 КОЕ/мышь (ЛД50) штаммом 1840/36/2015

2 группа - профилактика CL-55 дозой 150 мг/кг 3 суток + заражение

3 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг 3 суток + заражение

Эффективность профилактического действия CL-55 оценивали в острой септической модели по динамике гибели животных в течение 4 дней после заражения.

В таблице 23 приведены результаты исследования эффективности профилактики различными дозами CL-55 в течение 3 суток - выживаемость животных по дням после заражения дозой 1,15×106 КОЕ/мышь (ЛД50) штаммом 1840/36/2015 exoU+ (данные для 2 повторов, в каждой группе 6 животных). Полученные данные показывают профилактическую эффективность перорального введения CL-55 в течение 3-х суток в дозах 150 и 100 мг/кг в отношении выживаемости животных, зараженных дозой ЛД50 штамма 1840/36/2015.

Дизайн эксперимента с штаммом exoU+

Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.

1 группа - контроль инфекции при заражении дозой 2,25×106 КОЕ/мышь (ЛД75) штаммом 1840/36/2015

2 группа - профилактика CL-55 дозой 150 мг/кг 3 суток + заражение

3 группа - профилактика CL-55 дозой 100 мг/кг 3 суток + заражение

Эффективность профилактического действия CL-55 оценивали в острой септической модели по динамике гибели животных в течение 4 дней после заражения.

В таблице 24 приведены результаты исследования эффективности профилактики дозами CL-55 150 и 100 мг/кг в течение 3 суток с последующим заражением мышей дозой 2,25×106 КОЕ/мышь (ЛД75) штамма 1840/36/2015 exoU+ - выживаемость животных по дням после заражения (данные для 2 повторов, в каждой группе 6 животных). Полученные данные показали, что при заражении дозой ЛД75 штамма 1840/36/2015 exoU+ выживаемость животных после профилактического введения CL-55 в течение 3-х суток в дозах 150 и 100 мг/кг была также достоверно выше.

Для того, чтобы оценить подавление пседомонадной инфекции в органах зараженных мышей после профилактического введения CL-55, был поставлен следующий эксперимент.

Дизайн эксперимента с штаммом exoU+

Были сформированы группы по 6 мышей в каждой.

1 группа - контроль инфекции при заражении дозой ЛД50 (1,15×106 КОЕ/мышь)

2 группа - профилактика CL-55 дозой 150 мг/кг в течение 3 суток до заражения

3 группа - контроль инфекции при заражении дозой ЛД75 (2,25×106 КОЕ/мышь)

4 группа - профилактика CL-55 дозой 150 мг/кг в течение 3 суток до заражения

Мышей заражали дозами ЛД50 (1,15×106 КОЕ/мышь) и ЛД75 (2,25×106 КОЕ/мышь) штамма 1840/36/2015 exoU+ после окончания профилактики CL-55. Через 72 ч. после заражения проводили вскрытие выживших мышей и определяли количество бактерий в селезенке. В таблице 25 приведены полученные результаты по определению среднего количества псевдомонад в высевах из селезенок мышей, зараженных дозами ЛД50 (1,15×106 КОЕ/мышь) и ЛД75 (2,25×106 КОЕ/мышь) штамма 1840/36/2015 exoU+ после профилактического введения CL-55 в дозе 150 мг/кг за 72 часа до заражения.

Таким образом, профилактическое применение CL-55 в дозе 150 мг/кг оказывает выраженное антибактериальное действие и приводит к практически полному снижению количества псевдомонад в селезенках при заражении мышей клиническими штаммами с exoS+ и exoU+ генотипами вне зависимости от приобретенной резистентности.

Заключение

В представленных примерах было экспериментально продемонстрировано, что полученное низкомолекулярное соединение, 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид, является ингибитором ССТТ Pseudomonas aeruginosa. Полученное соединение специфически ингибирует секрецию токсинов - эффекторов системы секреции III типа псевдомонад, вызывающих гибель эукариотических клеток. Блокирование in vitro системы секреции III типа Pseudomonas aeruginosa было показано для клинических штаммов с различными генотипами по генам эффекторных белков ССТТ и различным профилем антибиотикорезистентности.

Низкомолекулярный ингибитор ССТТ псевдомонад вызывал подавление развития инфекции на моделях лабораторных животных при использовании как терапевтической, так и профилактической схемы введения препарата. Действие препарата выражалось в значительном увеличении выживаемости животных и подавлению накопления псевдомонад в органах при септической инфекции у мышей. Терапевтическая и профилактическая эффективность 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида была установлена на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотипов. Таким образом, техническая задача, поставленная в данном изобретении, достигнута.

Кроме того, проведенные исследования по изучению токсичности 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на животных показали, что соединение является малотоксичным и может быть рекомендовано для дальнейших доклинических и клинических испытаний. По результатам проведенного исследования также можно сделать вывод о том, что изучаемый ингибитор ССТТ 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид (CL-55), в соответствии с механизмом его действия, не обладает бактерицидным действием на кишечную микрофлору животных. Отсутствие негативного влияния на состав кишечной микрофлоры ингибитора ССТТ, перспективного для лечения антибиотикорезистентных госпитальных штаммов синегнойной палочки, является его принципиальным преимуществом перед используемыми антибиотиками.

Таким образом, поставленная задача, а именно:

подавление инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa с различным генотипом по генам эффекторных белков ССТТ и различным профилем антибиотикорезистентности.

- подавление развития инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa у зараженного организма на модели in vivo, вне зависимости от приобретенной антибиотикорезистентности.

- отсутствие ингибирующего действия на нормальную микрофлору макроорганизма при применении 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa решена в данном изобретении.

Промышленная применимость.

Результаты исследований, отраженных в приведенных примерах подтверждают промышленную применимость данного соединения, которое специфически ингибирует секрецию токсинов - эффекторов системы секреции III типа псевдомонад, вызывающих гибель эукариотических клеток.

Источники информации

1. Somayeh Moazami Goudarzi, Fereshteh Eftekhar. Multidrug resistance and integron carriage in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in Tehran, Iran. Turkish Journal of Medical Sciences. Turk J Med Sci (2015)45: 789-793/ doi:10.3906/sag-1408-120.

2. Burgess DS1, Nathisuwan S. Cefepime, piperacillin/tazobactam, gentamicin, ciprofloxacin, and levofloxacin alone and in combination against Pseudomonas aeruginosa. Diagn Microbiol Infect Dis. 2002 Sep; 44(1):35-41.

3. Bodey GP, Jadeja L, Elting L. Pseudomonas bacteremia. Retrospective analysis of 410 episodes. 1985Arch. Intern. Med. 145:1621-1629].

4. Hilf M, et al. Antibiotic therapy for Pseudomonas aeruginosa bacteremia: outcome correlations in a prospective study of 200 patients. 1989. Am. J. Med. 87:540-546.

5. Leibovici L, et al.. Monotherapy versus beta-lactamaminoglycoside combination treatment for gram-negative bacteremia: a prospective, observational study. 1997, Antimicrob. Agents Chemother. 41: 1127-1133.

6. Siegman-lgra Y, Ravona R, Primerman H, Giladi M.. Pseudomonas aeruginosa bacteremia: an analysis of 123 episodes, with particular emphasis on the effect of antibiotic therapy. 1998,Int. J. Infect. Dis. 2:211-215.

1. Применение 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa в живом организме.

2. Способ подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa, заключающийся в воздействии на штаммы Pseudomonas aeruginosa эффективным количеством соединения по п. 1.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к пептидной химии, и может быть использовано в медицине. Получены синтетические пептиды на основе бета-шпилечных полипептидов.

Изобретения касаются вакцинных составов против Streptococcus pneumoniae и их применения. Представленные вакцинные составы содержат фармацевтически приемлемый носитель и первый полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 265, 266 или 268, и второй полипептид, имеющий по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, 10, 20, 21, 6, 7, 18 или 19.

Изобретение относится к фармацевтике и медицине и представляет собой кремнийцинкборсодержащий глицерогидрогель для местного применения, обладающий ранозаживляющей, регенерирующей, бактерицидной и противогрибковой активностью, состав которого отвечает формуле mSi(C3H7O3)4⋅ZnC3H6O3⋅nHB(C3H6O3)2⋅xC3H8O3⋅yH2O, где 1≤m≤3, 1≤n≤2, 9≤х≤15, 28≤у≤70, получен взаимодействием тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(C3H7O3)4⋅xC3H8O3, где 1,5≤х≤4,5, моноглицеролата цинка в избытке глицерина ZnC3H6O3⋅6C3H8O3, бисглицеролата бора НВ(C3H6O3)2 и воды в мольном соотношении Si(C3H7O3)4:ZnC3H6O3:НВ(C3H6O3)2:C3H8O3:H2O, равном (1÷3):1:(1÷2):(9÷15):(28÷70), при температуре 40-60°С и перемешивании.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству для лечения заболеваний кожи, обладающему противовоспалительным, антибактериальным, противовирусным, противогрибковым действием, представляющему собой масляный экстракт из листьев Gynura procumbens, полученному определенным способом.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и представляет собой антибактериальную композицию в виде суппозитория и способ ее получения, где композиция содержит жидкую субстанцию бактериофагов, включающую, по меньшей мере, три бактериофага с титром не менее 2×108 БОЕ на суппозиторий каждого штамма, суппозиторную основу, включающую витепсол или твердый жир типа А, а также твин-80, причем компоненты в композиции находятся, в определенном соотношении, в % на 1 суппозиторий.

Изобретение относится к средству, обладающему антимикробным, репаративным и ранозаживляющим действием. Указанное средство включает экстракт сухой из побегов рододендрона золотистого с содержанием суммы простых фенолов и фенологликозидов не менее 28%, полученный путем экстракции сырья с размером частиц 2-3 мм водой очищенной при соотношении сырья и экстрагента 1:10, время экстракции при первом контакте фаз 2 ч, втором - 1,5 ч, третьем - 1 ч, при перемешивании сырья и температуре 60±5°С.
Изобретение относится к медицине, а именно кардиохирургии и трансплантологии, может быть использовано для профилактики пневмоцистной пневмонии у реципиентов сердца в раннем послеоперационном периоде после трансплантации сердца.

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и представляет собой антибактериальную композицию, предназначенную для изготовления имплантируемых изделий медицинского назначения на основе полидиметилметилвинилсилоксанового каучука, включающую аэросил, антиструктурирующую добавку, кремнегидрид, платиновый катализатор и антимикробную добавку, отличающуюся тем, что в качестве антимикробной добавки композиция содержит рифампицин, причем компоненты в композиции находятся в определенном соотношении, в масс.ч.
Изобретение относится к области медицины, фармацевтики и нанотехнологий. Предлагается фармацевтическая композиция, обладающая антимикробной и противогрибковой активностью, содержащая трийодметан, нанесенный на алюмосиликатные нанотрубки с внешним диаметром трубок - 60-160 нм, внутренним диаметром - 10-60 нм и длиной трубок - 100-5000 нм, взятые при следующих соотношениях, масс.%: трийодметан 50, алюмосиликатные нанотрубки 50.

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для экстренной профилактики экспериментальной мелиоидозной инфекции. Для этого применяют сочетанное введение иммуномодулятора имунофана и антибиотика доксициклина животным.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для повышения неспецифической резистентности организма свиней. Смешивают 90 мас.ч.

Изобретение относится к производному азола формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, где R1 представляет собой атом водорода или С1-5 алкил; R2 представляет собой атом водорода или С1-5 алкил; R3 представляет собой фенил или пиридил (где фенил или пиридил необязательно замещен одним или двумя фрагментами, выбранными из группы, состоящей из С1-5 алкокси, атомов галогена и трифторметила); каждый из R4 и R5, которые могут быть одинаковыми или различными, представляет собой атом водорода или С1-5 алкил (где С1-5 алкил необязательно замещен одним фрагментом, выбранным из группы, состоящей из гидрокси и С1-5 алкокси), или R4 и R5 вместе с соединяющим их атомом азота образуют 4-7-членный насыщенный или ненасыщенный гетероцикл, необязательно содержащий один циклический атом азота, кислорода или серы, помимо указанного выше соединяющего атома азота (где 4-7-членный насыщенный или ненасыщенный гетероцикл необязательно замещен одним или двумя фрагментами, выбранными из группы, состоящей из гидрокси, С1-5 алкила (где С1-5 алкил необязательно замещен одной или двумя гидроксильными группами), C1-5 алкокси, атомов галогена, циано, С2-5 алканоила, аминокарбонила, моно-C1-5 алкиламинокарбонила, ди-C1-5 алкиламинокарбонила, трифторметила, амино, моно-C1-5 алкиламино, ди-С1-5 алкиламино и С2-5 алканоиламино, причем в указанном 4-7-членном насыщенном или ненасыщенном гетероцикле необязательно имеется С1-5 алкиленовый фрагмент, соединяющий два различных циклических атома углерода), или образуют 2-окса-6-азаспиро[3.3]гепт-6-ил или 7-окса-2-азаспиро[3.5]нон-2-ил; азольный цикл, представленный формулой (α), имеет любую из структур формулы группы (II), приведенных в формуле изобретения, и где Ry представляет собой атом водорода или С1-5 алкил; X1 и X2 являются такими, что: (i) если X1 означает простую связь или фрагмент -СО-, X2 означает -С1-5 алкилен- или -О-С1-5 алкилен-; и (ii) если X1 означает фрагмент -CONRx1-, X2 означает простую связь; Rx1 представляет собой атом водорода или C1-5 алкил; и цикл А представляет собой бензольный цикл, пиридиновый цикл (где бензольный цикл необязательно замещен одним или двумя фрагментами, выбранными из группы, состоящей из атомов галогена и С1-5 алкокси), 5-6-членный насыщенный или частично ненасыщенный гетероцикл, содержащий один или два атома азота (где 5-6-членный насыщенный или ненасыщенный гетероцикл необязательно замещен одной оксо группой) или С3-7 циклоалкан.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии и урологии, и может быть использовано для хирургического лечения больных с гнойным пиелонефритом. Для этого осуществляют видеоретроперитонеоскопическую декапсуляцию почки с удалением апостематозных очагов, санацией и дренированием забрюшинного пространства.

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для лечения невралгии. Для этого используют комплекс препаратов, в котором в качестве базисного средства анальгезии применяют один из препаратов нестероидных противовоспалительных соединений, а именно - кеторолака трометамин в дозе 15-75 мг, или метамизол натрия в дозе 500-2500 мг, или кетопрофен в дозе 50-250 мг, или декскетопрофен в дозе 25-125 мг, или лорноксикам в дозе 4-20 мг, в качестве адъювантного средства анальгезии применяют цианкобаламин в дозе 500-2500 мкг, и в качестве спазмолитика миотропного действия применяют дротаверина гидрохлорид в дозе 10-50 мг, которые вводят внутривенно с распределением указанных доз на одно-два введения в сутки продолжительностью курса лечения 1-10 суток.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ инкапсуляции препарата методом осаждения нерастворителем, отличающийся тем, что в качестве ядер нанокапсул используются водорастворимые цефалоспориновые антибиотики, в качестве оболочки альбумин человеческий сывороточный при соотношении оболочка:ядро 1:1 или 3:1, при этом водорастворимые цефалоспориновые антибиотики в виде порошка и препарат Е472с в качестве поверхностно-активного вещества добавляют к раствору альбумина, полученную смесь перемешивают и после растворения компонентов медленно по каплям добавляют петролейный эфир, полученную суспензию нанокапсул отфильтровывают, промывают петролейным эфиром и сушат.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ инкапсуляции лекарственного препарата методом осаждения нерастворителем, отличающийся тем, что в качестве ядер нанокапсул используются антибиотики, в качестве оболочки - геллановая камедь при соотношении оболочка:ядро 3:1, при этом к геллановой камеди в гексане в присутствии препарата Е472с в качестве поверхностно-активного вещества добавляют порошок антибиотика, далее по каплям приливают бутилхлорид, полученную суспензию нанокапсул отфильтровывают и сушат.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новой твердой форме соединения формулы (I). Также изобретения относится к способу получения указанной твердой формы, фармацевтической композиции на основе твердой формы, применению твердой формы соединения (I) и способу лечения или предотвращения расстройств, связанных с ГАМК А α5 рецептором.

Изобретение относится к соединениям формулы I или их фармацевтически приемлемым солям, обладающих антибактериальным действием в которой R1a представляет собой Н или карбокси и R1b представляет собой Н, или R1a и R1b представляют собой совместно или группу *-C(O)-NH-S-# или группу *-C(OH)=N-S-# в которой “*” представляет собой точку присоединения R1a и “#” представляет собой точку присоединения R1b; R2 представляет собой Н, (С1-С3)алкил, гидрокси-(С1-С3)алкил, бензил или (С3-С5)циклоалкил; R3 представляет собой Н или галоген; U представляет собой N или CR4; причем R4 означает Н или (С1-С3)алкокси; А представляет собой СН, В представляет собой NH и m представляет собой 1 или 2 и n представляет собой 1 или 2; или А представляет собой N, В отсутствует, m представляет собой 2 и n представляет собой 2; Y представляет собой СН или N; и Q представляет собой О или S.

Изобретение относится к соединениям формулы I или их фармацевтически приемлемым солям, обладающих антибактериальным действием в которой R1a представляет собой Н или карбокси и R1b представляет собой Н, или R1a и R1b представляют собой совместно или группу *-C(O)-NH-S-# или группу *-C(OH)=N-S-# в которой “*” представляет собой точку присоединения R1a и “#” представляет собой точку присоединения R1b; R2 представляет собой Н, (С1-С3)алкил, гидрокси-(С1-С3)алкил, бензил или (С3-С5)циклоалкил; R3 представляет собой Н или галоген; U представляет собой N или CR4; причем R4 означает Н или (С1-С3)алкокси; А представляет собой СН, В представляет собой NH и m представляет собой 1 или 2 и n представляет собой 1 или 2; или А представляет собой N, В отсутствует, m представляет собой 2 и n представляет собой 2; Y представляет собой СН или N; и Q представляет собой О или S.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции в виде таблетки, предназначенной для лечения гипертензии. Фармацевтическая композиция содержит 132,02 мг тригидрата фимасартана калия, 12,5 мг гидрохлортиазида и связующее вещество, связующий раствор которого обладает вязкостью от 20 мПа·с до 650 мПа·с.

Изобретение относится к новым фторированным 4-фурил-3,4-дигидро-2Н-бензо[1,4]тиазин-1,1-диоксидам общей формулы 1 . Технический результат: получены новые соединения формулы 1, обладающие высокой антиаритмической активностью. 1 табл., 5 пр.

Группа изобретений относится к микробиологии и медицине, может быть использована для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa. Предложено применение 4--5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2--карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa в живом организме, а также способ подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa, при воздействии на штаммы Pseudomonas aeruginosa эффективным количеством этого соединения. Технический результат: реализация заявленного назначения при заражении мышей клиническими штаммами с exoS+ и exoS- генотипами вне зависимости от приобретённой резистентности, соединение не обладает бактерицидным действием на кишечную микрофлору животных и является малотоксичным. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 25 табл.

Наверх