Способ определения степени раздражающего действия дезинфекционных средств на кожу человека



Владельцы патента RU 2681874:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Научно-исследовательский институт дезинфектологии" в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ определения степени раздражающего действия дезинфекционных средств на кожу человека, заключающийся в том, что культуру клеток Chang conjunctiva рассеивают на 96-луночную панель по 100 мкл в каждую лунку в концентрации 1×105 клеток/мл в питательной среде Игла-MEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС). Для формирования монослоя клеток панель инкубируют в термостате в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С в течение 24 часов. После инкубации культуральную среду меняют на среду, содержащую 2% ЭТС по 100 мкл в каждую лунку. Затем образцы дезинфекционных средств (ДС) раститровывают непосредственно в лунках с клетками Chang conjunctiva методом двукратных серийных разведений в трех повторах на точку, оставляя три контрольные лунки с монослоем клеток свободными от внесения ДС. Панель помещают в термостат, инкубируют в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С в течение 24 часов. После инкубирования КС из лунок удаляют и добавляют в каждую лунку по 100 мкл среды ИГЛА-МЕМ с 20 мкл реактива МТТ в концентрации 5 мг/л. После 4-х часового инкубирования в термостате в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С среду с реактивом МТТ удаляют и вносят по 100 мкл ДМСО для растворения восстановленного клетками формазана. После 5 минутной выдержки измеряют оптическую плотность раствора формазана в каждой из лунок на спектрофотометре при длине волны 545 нм, после чего сравнивают оптическую плотность (ОП) растворов, полученных после культивирования, с образцами ДС с оптической плотностью растворов контрольных лунок (ОПк). При равенстве ОП и ОПк по величине соответствующего минимального нетоксического разведения выносят суждение о степени раздражающего действия ДС на кожу человека: отсутствие, слабое, умеренное или выраженное. Изобретение обеспечило возможность повышения точности исследований.

 

Изобретение относится к области дезинфектологии и может быть использовано для оценки токсичности дезинфекционных средств (ДС), частности, степени их раздражающего воздействия на кожу человека

Известен способ определения коррозийного действия химических средств на кожу человека in vitro (Международный документ «OECD TG 430 Rat TER skin corrosivity test» 2000 г.), при котором исследуемое химическое (дезинфекционное) средство наносят на кожу убитых крыс и по результатам ответной реакции выносят суждение о наличии или отсутствии коррозийного действия на кожу человека. Исследования, проводимые по данному методу, не позволяют определить степень раздражающего воздействия, кроме того, они противоречат принципам гуманности, т.к. при их проведении животные гибнут.

Известен способ определения коррозийного действия химического средства на кожу человека in vitro (Международный документ OECD TG 435 «Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion» 2006 г.). Метод испытания мембранного барьера in vitro позволяет идентифицировать коррозионные химические вещества и смеси (относя их к категориям разрешенных/неразрешенных) в соответствии со временем их проникновения через искусственный (синтетический высокомолекулярный био-барьер) мембранный барьер. Недостатком известного метода является отсутствие возможности определения степени раздражающего воздействия веществ на кожу человека.

Наиболее близким к изобретению является способ определения раздражающего воздействия дезинфекционного средства (ДС) на кожу человека (ГОСТ 32634-2014), заключающийся в том, что исследуемое вещество наносят на искусственную трехмерную модель человеческой кожи, состоящую, как минимум, из реконструированного эпидермиса с функциональным роговым слоем. Коррозийные (сильно выраженные раздражающие) свойства ДС анализируют по их возможности влиять на жизнеспособность клеток (устанавливаемую с помощью МТТ - теста) за определенное время. При проведении исследований кожу помещают в среду с МТТ реактивом соответствующей концентрации, выдерживают в течение 3-х часов, после чего измеряют оптическую плотность растворенного формазана при длине волны 540-595 нм, сравнивают ее с контрольной и по результатам сравнения выносят суждение о наличии или отсутствии разъедающих свойств исследуемого ДС.

Недостатком известного способа является низкая точность результатов исследований, обусловленная отсутствием возможности определения степени раздражающего действия ДС на кожу человека.

Техническим результатом, которого можно достичь при осуществлении изобретения является повышение точности исследований.

Технический результат достигается тем, что согласно способу определения степени раздражающего действия дезинфекционных средств на кожу человека, заключающемуся в том, что культуру постоянных трансформированных клеток нормальной ткани глаза человека Chang conjunctiva рассевают на 96-луночную панель по 100 мкл в каждую лунку в концентрации 1×105 клеток/мл в питательной среде Игла-МЕМ с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), после чего панель инкубируют в термостате в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С в течение 24 часов, после инкубации культуральную среду (КС) во всех лунках меняют на среду, содержащую 2% ЭТС по 100 мкл в каждую лунку, затем образцы дезинфекционных средств (ДС) раститровывают непосредственно в лунках с монослоем клеток Chang conjunctiva методом двукратных серийных разведений в трех повторах на точку, оставляя три контрольные лунки свободными от дезинфекционных средств, из каждой из первых трех лунок с монослоем клеток, содержащих 100 мкл культуральной среды и 100 мкл образца ДС, после перемешивания отбирают по 100 мкл смеси и переносят их в каждую из трех следующих по порядку лунок, из которых, в свою очередь, смесь переносят в следующие лунки, последовательно повторяя данное действие до заполнения всех лунок панели, после чего панель помещают в термостат, инкубируют в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С в течение 24 часов, затем культуральную среду из всех лунок, включая контрольные, удаляют и добавляют в каждую лунку по 100 мкл среды ИГЛА-MEM с 20 мкл реактива МТТ с концентрацией 5 мг/л, после 4-х часового инкубирования в термостате в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С среду с реактивом МТТ удаляют и вносят по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения восстановленного клетками формазана, после 5 минутной выдержки измеряют оптическую плотность раствора формазана во всех лунках на спектрофотометре при длине волны 545 нм, после чего сравнивают оптическую плотность (ОП) растворов, полученных после культивирования с образцами ДС с оптической плотностью растворов в контрольных лунках (ОПк) и по величине минимального нетоксического разведения (МНР), выявленной при равенстве ОП и ОПк, выносят суждение о степени раздражающего действия ДС на кожу человека: при МНР≤1:20000 - отсутствие, при МНР от 1:21000 до 1:50000 - слабое, при МНР от 1:51000 до 1:150000 - умеренное, при МНР >150000 - выраженное.

Отличительной особенностью данного изобретения является то, что в качестве тест - объекта выбраны культуры постоянных

трансформированных клеток нормальной ткани глаза человека Chang conjunctiva, которые по результатам проведенных исследований показали себя наилучшими индикаторами воздействия ДС на кожу человека при исследованиях in vitro. Кроме того, только при использовании ранее выявленной зависимости степени раздражающего действия на кожу человека ДС от величины его МНР, обеспечена возможность достижения технического результата.

Известно использование Chang conjunctiva в качестве тест - объекта для выявления цитотоксических и иммунологических эффектов под влиянием химических соединений и лекарственных препаратов с применением МТТ-теста. Однако в проанализированных патентных источниках информации не обнаружено сведений о применении клеток Chang conjunctiva для оценки степени кожно-раздражающего действия ДС на человека с помощью МТТ - теста с использованием ранее выявленной зависимости степени раздражающего действия на кожу человека ДС от величины его МНР, на основании чего можно сделать вывод о соответствии данного решения критериям охраноспособности.

Способ осуществляют следующим образом.

В основе данного способа лежит реакция восстановления желтой соли тетразолия митохондриальными дегидрогеназами живых клеток до пурпурных кристаллов формазана, которые нерастворимы в водной клеточной среде. Кристаллы формазана растворяют в диметилсульфоксиде (ДСМО) и определяют оптическую плотность (ОП) полученного раствора колометрически.

Для реализации способа исследуемое дезинфекционное средство наносят на сформированный монослой клеток Chang conjunctiva (тест-объект) и с помощью МТТ - теста проводят цитологические исследования, на основании которых выносят суждение о степени воздействия ДС на кожу человека. Культуру постоянных трансформированных клеток нормальной ткани глаза человека Chang conjunctiva рассевают с помощью автоматической пипетки Eppendorf на 96-луночную панель по 100 мкл в каждую лунку в концентрации 1×105 клеток/мл в питательной среде Игла-МЕМ с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС). Для формирования монослоя клеток панель инкубируют в термостате в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С в течение 24 часов. После инкубации культуральную среду во всех лунках меняют на среду, содержащую 2% ЭТС по 100 мкл в каждую лунку. Затем образцы дезинфекционных средств раститровывают непосредственно в лунках с клетками Chang conjunctiva методом двукратных серийных разведений в трех повторах на точку, оставляя три контрольные лунки свободными от ДС. Из каждой из первых трех лунок с монослоем клеток, содержащих 100 мкл культуральной среды и 100 мкл образца ДС после перемешивания отбирают по 100 мкл смеси и переносят их в каждую из трех следующих по порядку лунок. Из них, в свою очередь, смесь переносят в следующие лунки, последовательно повторяя данное действия до заполнения всех лунок панели. Панель помещают в термостат, инкубируют в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С в течение 24 часов. После инкубирования культуральную среду из лунок удаляют и добавляют в каждую лунку (включая контрольные) по 100 мкл среды ИГЛА-MEM с 20 мкл реактива МТТ (соль тетразолия) в концентрации 5 мг/л. После 4-х часового инкубирования в термостате в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С среду с реактивом МТТ удаляют и вносят по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения восстановленного клетками формазана. После 5 минутной выдержки измеряют оптическую плотность раствора формазана в каждой из лунок на спектрофотометре при длине волны 545 нм, после чего сравнивают оптическую плотность (ОП) растворов, полученных после культивирования с образцами ДС с оптической плотностью растворов контрольных лунок (ОПк). При равенстве ОП и ОПк по величине соответствующего минимального нетоксического разведения (МНР) выносят суждение о степени раздражающего действия ДС на кожу человека: при МНР≤1:20000 - отсутствие, от 1:21000 до 1:50000 - слабое, от 1:51000 до 1:150000 - умеренное, >150000 - выраженное.

При каждом исследовании достоверным считают различие средних величин в опыте и контроле по критерию Стьюдента при уровне статической значимости р<0,05.

Если одной 96-луночной панели недостаточно для определения величины минимального нетоксического разведения ДС, то исследования проводят аналогичным образом в следующей панели до окончательного определения его значения.

Шкала зависимости степени выраженности раздражающего действия ДС от величины его МНР получена в результате испытаний на кроликах, реакция кожи которых наиболее точно коррелирует с реакцией кожи человека.

Таким образом, использование культуры постоянных трансформированных клеток нормальной ткани глаза человека Chang conjunctiva в качестве тест - объекта МТТ - теста с помощью ранее выявленной зависимости степени раздражающего действия на кожу человека ДС от величины его минимального нетоксического разведения, обеспечило возможность повышения точности исследований, т.е. достижения технического результата.

Способ может найти широкое применение при производстве дезинфекционных средств, для оценки степени их токсичности, в частности, степени их раздражающего воздействия на кожу человека.

Способ определения степени раздражающего действия дезинфекционных средств на кожу человека, заключающийся в том, что культуру постоянных трансформированных клеток нормальной ткани глаза человека Chang conjunctiva рассевают на 96-луночную панель по 100 мкл в каждую лунку в концентрации 1×105 клеток/мл в питательной среде Игла-МЕМ с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), после чего панель инкубируют в термостате в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°C в течение 24 часов, после инкубации культуральную среду (КС) во всех лунках меняют на среду, содержащую 2% ЭТС по 100 мкл в каждую лунку, затем образцы дезинфекционных средств (ДС) раститровывают непосредственно в лунках с монослоем клеток Chang conjunctiva методом двукратных серийных разведений в трех повторах на точку, оставляя три контрольные лунки свободными от дезинфекционных средств, из каждой из первых трех лунок с монослоем клеток, содержащих 100 мкл культуральной среды и 100 мкл образца ДС, после перемешивания отбирают по 100 мкл смеси и переносят их в каждую из трех следующих по порядку лунок, из которых, в свою очередь, смесь переносят в следующие лунки, последовательно повторяя данное действие до заполнения всех лунок панели, после чего панель помещают в термостат, инкубируют в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°C в течение 24 часов, затем культуральную среду из всех лунок, включая контрольные, удаляют и добавляют в каждую лунку по 100 мкл среды ИГЛА-MEM с 20 мкл реактива МТТ с концентрацией 5 мг/л, после 4-х часового инкубирования в термостате в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°C среду с реактивом МТТ удаляют и вносят по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения восстановленного клетками формазана, после 5 минутной выдержки измеряют оптическую плотность раствора формазана во всех лунках на спектрофотометре при длине волны 545 нм, после чего сравнивают оптическую плотность (ОП) растворов, полученных после культивирования, с образцами ДС с оптической плотностью растворов в контрольных лунках (ОПк) и по величине минимального нетоксического разведения (МНР), выявленной при равенстве ОП и ОПк, выносят суждение о степени раздражающего действия ДС на кожу человека: при МНР ≤1:20000 - отсутствие, при МНР от 1:21000 до 1:50000 - слабое, при МНР от 1:51000 до 1:150000 - умеренное, при МНР >150000 - выраженное.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ детекции полинуклеотида или полинуклеотидной последовательности в образце.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к средствам диагностики вируса парагриппа 3 типа у животных. Предлагается тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у животных с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Изобретение относится к биохимии, биологии, медицине, онкологии, ветеринарии, и может быть использовано для определения активности теломеразы при диагностике злокачественных новообразований.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полинуклеотидам, которые кодируют CDR3 в генах TCR-[альфа] и TCR-[бета] цепей CD4+ хелперных Т-клеток, которые специфичны к хелперному пептиду WT1322, и может быть использовано в медицине для индукции иммунного ответа против WT1322-экспрессирующей злокачественной опухоли.

Изобретение относится к биотехнологии. Заявлен способ определения вероятности того, что пациент имеет волчанку в доклинической стадии.

Изобретение относится к области биологии и медицины и предназначено для экспресс-выделения ДНК из размороженной крови. Проводят забор 2 мл цельной венозной крови в пробирки, содержащие ЭДТА-К3.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены олигонуклеотидные ДНК-праймеры для выявления и филогенетического анализа провирусной ДНК вируса лейкоза кошек, а также для синтеза фрагмента гена поверхностного гликопротеина gp70, содержащего протективные антигенные эпитопы, отличающиеся тем, что две пары олигонуклеотидных ДНК-праймеров имеют следующие последовательности: внешние (1 fwd: 5'TCCAACGCACCCAAAACCCT3'; 1 rev: 5'GCTTTAGTCCCTGTTCCGAC3'), внутренние (2 fwd: 5'TCCTGCCTATCTACTCCGCA3'; 2 rev: 5'ATGCATGGGGTGAGTCCAGT3').

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначено для прогнозирования тяжелой степени сухого керататоконъюнктивита (СКК) при синдроме Шегрена, ассоциированном с ревматоидным артритом.
Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике и гинекологии, и предназначено для выявления риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития ишемического инсульта. У индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья, выделяют ДНК из венозной крови и проводят анализ полиморфизмов генов цитокинов rs1061624 TNFR2 и rs767455 TNFR1.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен биореактор для культивирования мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК).

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полинуклеотидам, которые кодируют CDR3 в генах TCR-[альфа] и TCR-[бета] цепей CD4+ хелперных Т-клеток, которые специфичны к хелперному пептиду WT1322, и может быть использовано в медицине для индукции иммунного ответа против WT1322-экспрессирующей злокачественной опухоли.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к активации хелперных Т-клеток, которые специфичны к пептиду WT1, и может быть использовано в медицине для индукции иммунного ответа против WT1-экспрессирующей злокачественной опухоли.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ иммобилизации нативной амниотической мембраны для транспортировки, консервации и применения ее в качестве носителя культивированных клеток, где нативную амниотическую мембрану механически фиксируют в расправленном состоянии к гладким краям стерильной чашки Петри диаметром 3 см со срезанным дном при помощи стерильного зажимного хомута таким образом, чтобы оставался запас мембраны от гладких краев не меньше, чем ширина одноразового стерильного зажимного хомута.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к композиции среды для производства ботулинического токсина и, более конкретно, к композиции среды для культивирования Clostridium sp., способного вырабатывать ботулинический токсин.

Изобретения относятся к области биотехнологии, в частности к средствам для поддержания или стимуляции, косметическому продукту, фармацевтическому продукту, лечебно-профилактическому препарату, продукту питания и напитку недифференцированного состояния эмбриональных стволовых клеток или соматических стволовых клеток, средству для лечения раны и способу выращивания эмбриональных стволовых клеток, исключая эмбриональные стволовые клетки человека, или соматических стволовых клеток при поддержании недифференцированного состояния.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к способу выделения мезенхимальных стволовых клеток шейки матки, не являющихся опухолевыми, которые экспрессируют клеточные маркеры CD29, CD44, CD73, CD105 и CD90 и не экспрессируют клеточные маркеры CD117, CD133, HLA-DR, TRA-81, CD45, CD34 и CD31, применению выделенной ткани шейки матки и способу получения кондиционированной среды.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения стволовых клеток (СК) из зуба. Способ включает заполнение внутренней полости отделенного зуба через апикальную часть его корневого канала 0,1-0,4% раствором коллагеназы и выдерживание в диапазоне от примерно 25°С до примерно 39°С в течение 20-120 минут.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу выделения клеток внелуковичной дермальной оболочки волосяного фолликула (NBDS), и может быть использовано в медицине.

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к способам использования композиции сред клеточной культуры для выращивания клеток и/или белкового производства.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности при идентификации осмотолерантных дрожжей Zygosaccharomyces rouxii. Способ включает предварительное обогащение дрожжей, осаждение их центрифугированием, выделение ДНК с проведением ПЦР в реальном времени, причем для амплификации используются праймеры: ZygRux-f GACGTGAACTCTTAACGGAG и ZygRux-r GAGAGCAGAACCCTCCC, а также Taqman зонд ZygRux-p FAM CGGAGGAGATTAAAAACAGCCGCGCA BHQ1, а логарифмическое повышение уровня флюоресценции в канале FAM свидетельствует о наличии штамма дрожжей рода Zygosaccharomyces rouxii. 1 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ определения степени раздражающего действия дезинфекционных средств на кожу человека, заключающийся в том, что культуру клеток Chang conjunctiva рассеивают на 96-луночную панель по 100 мкл в каждую лунку в концентрации 1×105 клетокмл в питательной среде Игла-MEM с 10 эмбриональной телячьей сывороткой. Для формирования монослоя клеток панель инкубируют в термостате в атмосфере 5 СО2 при температуре 37°С в течение 24 часов. После инкубации культуральную среду меняют на среду, содержащую 2 ЭТС по 100 мкл в каждую лунку. Затем образцы дезинфекционных средств раститровывают непосредственно в лунках с клетками Chang conjunctiva методом двукратных серийных разведений в трех повторах на точку, оставляя три контрольные лунки с монослоем клеток свободными от внесения ДС. Панель помещают в термостат, инкубируют в атмосфере 5 СО2 при температуре 37°С в течение 24 часов. После инкубирования КС из лунок удаляют и добавляют в каждую лунку по 100 мкл среды ИГЛА-МЕМ с 20 мкл реактива МТТ в концентрации 5 мгл. После 4-х часового инкубирования в термостате в атмосфере 5 СО2 при температуре 37°С среду с реактивом МТТ удаляют и вносят по 100 мкл ДМСО для растворения восстановленного клетками формазана. После 5 минутной выдержки измеряют оптическую плотность раствора формазана в каждой из лунок на спектрофотометре при длине волны 545 нм, после чего сравнивают оптическую плотность растворов, полученных после культивирования, с образцами ДС с оптической плотностью растворов контрольных лунок. При равенстве ОП и ОПк по величине соответствующего минимального нетоксического разведения выносят суждение о степени раздражающего действия ДС на кожу человека: отсутствие, слабое, умеренное или выраженное. Изобретение обеспечило возможность повышения точности исследований.

Наверх