Способ выделения цефалоспорина с

 

О П И С А Н И Е 468430

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Зависимый от патента— (22) Заявлено 14.11.72 (21) 1848528/23-4 (32) Приоритет 15.11.71 (31) 198986 (33) США

Опубликовано 25.04.75. Бюллетень № 15

Дата опубликования описания 10.11.75 (51) М. Кл. С 07d 99/24

"Тосударственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 547.86.07 (088.8) ио делам изобретений и открытий (72) Авторы изооретения

Иностранец

Джейн Мюрель Вайлд (США) И нестранная фирма

«Эли Лилли Энд Компани» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦЕФАЛОСПОРИНА С

„,о

R-C

Изобретение относится к способам выделения цефалоспорина С из водных растворов, например из ферментацион ных бульонов, содержащих цефалоапори н С.

Известны способы выделения цефалоспорииа С из водных растворов, например, обработкой фильтратов бульона цефалоспорина С галоидангидридом кислоты, .например бензоилхлоридом, с последующей экстрадицией реакционной смеси. Однако обязательное проведение стадии экстрагирова ния цефалоопорина С или

его производных связано с необходимостью применения органических растворителей и ароблемой,выделения эмульсий и растворителей.

С целью уп|рощения процесса, а также повышения качества и выхода получаемых продуктов, предлагается способ выделения цефалоспорина из водных растворов путем обработки этих растворов ацил ирующим агентом, заключающийся в том, что водный раствор, содержащий цефалоспори н С, смешивают с ангидридом кислоты формулы пде R — алкильная группа, содержащая 1- 5 атомов углерода или талоидалкильная группа с 1 — 5 атомами углерода;

R алкильная группа, содержащая 1 — 5

5 атомов углерода, или галоидалкильная группа, содержащая 1 — 5 атомов углерода, причем галоид в алкильной группе является, наприме р, хло|ром или бромом, при температуре 0 — 30 С и рН 7 — 11 и к по1о лученной реакционной смеси, содержащей об,разовавшееся N-ацильное производное цефалоспорина С, добавляют молярный избыток ,по отношению к N-ацилцефалоспорину С хинолина или изохинолина. Затем с помощь1о

15 подкисляющего реагента доводят рН реак ционной смеси до 2,0 — 3,5 и выдерживают е, при 0 — 30 С до образования кристаллов нолиновой соли N-ацилцефалоспо рина С.

Выделяют кристаллическую хинолинавую соль N-ацилцефалоспорина С известными методами. Она кристаллизуется нз,водной среды обычно,в виде монопидрата.

Водным раствором, содержащим цефалоспорин С, может быть ферментационный буль25 он, в котором регулируют рН среды, добавляют од ин или более фильтров и фильтруют с получением фильтрованного ферментацнонного бульона. Этот бульон называют необработанным фильтрованным ферментацион ным бульоЗ0 ном цефалоспорина С. Водной средой, содер468430 жащей цефалоепорин С, может быть также частично концентрированный, обраоотанный метанолом ферментационный бульон, содержащий цефалоспорин С. Эту водную среду здесь называют «неполностью обра ботанный бульон».

Водная среда, содержащая цефалоспорин

С, может также получаться из раствора цвфалоспо ри на С, который был обра ботан одной пли несколькими ионообменны ми смолами для част".1чной очистки распвора цефалоспорина С.

Эту водную среду здеcb называют «элюат смолы» цефалоспорина С. Источник и чистота водной среды, содержащей цефалослорин С, до .некоторой степени влияют,на 1количест1во ангидр ида алкановой кислоты, которое используют для ацилирования аминогруппы в цефалос11ор ине С.

Если ацилиро вание ведут необработанным бульоном, то обычно на 1 эквивалент цефалоспорина С идет 8 — 9 эквивалентов ангидрида кислоты, Если применяют частично концентрированный неполностью обработанный бульон, то на 1 эквивалент цефалоспор ина С идет 4—

6 эквивалентов ангидрида кислоты. Если используют растворы цвфалоспорина С в элюатах смолы, то на 1 эквивалент цефало1опори)на

С идет 1,5 — 3 эквивалента ангидрида кислоты.

Из ангидридов кислоты, когорые можно применять для осущеспвления предлагаемого спосо ба, можно назвать ангидриды пропионовой, масляной, валериановой и капроновой

11ислот, смешанные алкановые и галоидалкан св ы е а нгидриды, напри мер хлс р у коymlioillip оп ионовый ангидрид, хлоруксусноуксусный ангидрид, бромуксуснопро-.,ионс вый ангидрид, а также такие бис-галоидалкановые ангидриды, как хлоруксусный ангидрид, дихлоруксусный ангидр ид, брому ксус11ый ангидрид, хлорпропионовый ангидрид, хлормасляный ангидрид н т.п.

Первую стадию способа, т. е. стадию ацилирования, ведут при рН 7 — 11, предпочтительно .прп рН 8,5 — 9,5..рН среды можно поддерживать при тщательном контроле реакции и добавлении основания по мере того, как рН снижается за счет образования кислоты в реакции ацилирования. Кроме того, рН можно поддерживать за счет, применения буферных растворов, например бората натрия или борной к ислоты, дополняемых едким натром.

К другим буферным реагентам можно отнесги карбонатно-бикарбонатную буферную систему, приготовленную из натриевых или калиевых солей, .или фосфатные буферы. Ацилирование можно вести при любой температуре от температуры,замерзания смеси до-30 С, желательно температуру смеси поддерживать при 10—

20 С, лучше при 15 — 20 С. Такую температуру можно поддерживать соответствующим охлаждением, если это необходимо.

По окончаниии стадии ацилирования pcBIKЦ ионную омесь обрабаты вают хинолином, изохинол ином или экви|валентным им основанием при избытке по отношению к количеству цефалоспорина С в водной смеси. Обычно применя5

l5 ао

25 зо

65 ют 1,5 — 12 экв иваленгав хино.тина на 1 эквивалент N-ацилцефалоспорина С. Лучше употреблять не менее 2 эививалентов хинолина на

1 эквивалент цефалоапорина С, хотя можно применять и большие количества хинолина.

Обычно для полной реакции N-апилированного цефалоспорина С достаточно 2 — 4 экви валентов хинолина на 1 эквивалент цефалоспорина С.

По окончании добавления хинолина к водной реакционной смеси цефалоспори1а С рН среды доводят до 2,0 — 3,5 с помощью подкисляющего реагента, например серной к ислоты или соляной иислоты. Исходя из экономичесиих соображений, лучше применять для этих целей серную кислоту. При таком рН среды реакционную смесь держат при пвремешивании при 0 — 30 С, лучше при 10 — 20 С, в течение 1 час, обычио около 20 мин, до начала кристаллизации. По скончании процесса кристаллизации хинолиновую омесь N-ацилцефалоспорина С выделяют,из водной реакционной смеси обычным способом, например центрифугированием или фильтро ванием, промывают водой, затем органическим растворителем, например этилацетатом, сушат соответствующим образом, например в кипящем слое в течение

-2 час при 60 С до о "таточного соде1ржания,воды Зо/о (определяют методом Карла Фишера).

В начале этого процесса лучше применять водную жидкость, содержащую цефалоспорин

С, с мощностью 30 000 — 50000 мкг/мл по никотинамидному методу (30 — 50 л1г/л1л) или

40 000 — 60 000 мкг/мл по ультрафиолетовому методу (40 — 60 л1г, л1л). При большях м ощностях в исходной .вэдной жлдкости получаются слишком густые суспензии хиноли11овой соли N-BöèëöåôалоcïîðHна С, которые трудно о брабатывать. Прп мсньшнx мощностях может наблюдать=я медленная кристаллизация и также остается сульфат,натрия в продукте, если низкая мощность вызвана разбавлением смеси буферами элюирования смолы. Концентрирование и IH разбавление раствора можно осуществлять до пли Iocлс ацилирования. Наиоолее хорошей водной жидкостью, содержащей цефалоспорин С, является жидкость, содержащая мощность

40 000 — 45 000 мкг/мл (по никотинамидному методу) или 50 000 — 55 000 л1кг/л1л цефалоспорина С (по ультрафиолетовому методу).

Для поддержания рН среды на стадии ацилирс вания лучше применять гидроокись натрия с буфером из буры, при соотношении

4,5 моль гидроокиси,натрия на 3 люль тетрабората натрия. Концентрация гидроокиси натрия может быть до 8 моль (25о ю), концентрация оуры 1 моль. При ацилпровании оптимальный,рН среды равняется 9, при рН 7,5—

10,5 получаются более. низкие выходы.

Наиболес приемлемой температурой ац илирования является температура не выше 20 С.

Менее желательны температуры выше 25 С и ниже 15 С. Реакцию ацилирования заканчи468430 вают в течение 2 — 2,5 лгин, но для обеспечения полноты реакции обычно ведут ее в течение 10 — 15 лгин.

В некоторых случаях бывает необходимо хранить реакционную смесь N-ацилирова нного цефалоопорина С .из-за графика кристаллизации пли по другим причинам. В этом случае для увеличен ия стабильности смеси ее рН доводят до 5,0 — 5,5 с помощью 30%-1ной серной кислоты и охлаждают до 10 — 15 С во время хранения.

Хинолиновая соль N-ацилированного цефалоспорина С образуется с хорошими выходами при наличии 2 — 6 моль хинол и на,на 1 лоль цефалоспорина С (по ультрафиолетовому способу).

Кристаллическую хинолиновую соль Nацилцефалоспорина С лучше промывать водой для удаления загрязнений, большая часть которых;растворима в воде, например боратов, сульфатов, продуктов гидролиза ангидрида, избытка хинолина и растворимых примесей.

После водной промьгвки кристаллическую соль лучше lilpoMbIBBTb этилацетатом для удаления органических примесей и для частичного удаления воды из осадка на фильтре. Это дает осадок, который легче сушить. Водосмешивающиеся растворители (Опирты, ацетон, ацетониT!pHJI) нельзя применять для промывки, так ка1к mx водные растворы частично растворяют продукт и приводят к уменьшению Bblxoда и к плохой обрабатываемости осадка на фильтре.

О=адок хпнолпнозой соли N-ацилцефалоопорина С можно сушить обычными, методами, лучше в кипящем слое в течение 1,5 — 3 час при -60 С до остаточного содержания воды

3,5% и меньше (по методу Фишера).

Пример 1. 500 лгл водного элюата смолы, содержащего 33,0 ггг цефалоспорина С в

1 гл, ацилируют, добавляя 42 мл раствора хлсруксуснопропионового анг 1дрида IB этилацетате (2 эквивалента ангидрида по цефалоспорииу С) . Температура смеси около 20 С, рН смеси около 9,0 годдерживают с помощью буфера из бората натрия (60 юг). По окончании ацилирования добавляют 26,2 ял хинолина и рН доводят до 3,3 с помощью 61 мл 30%НоН серной кислоты. Смесь перемегп ивают в течение 4 час для обеспечения окончания реакции, охлаждают до 15 С,и фильтруют. Кристаллическую хинолиновую соль N-ацилированного цефалоопорина С промывают водой и сушат в течение ночи в вакууме при 40 С.

Выход составляет 22,4 г, ччстота продукта

97,1"„, это соответствует выходу 86% из элюата смолы.

П,р и м е р 2. Кр 1с1аллизац;гя в водной среде как -;po!Ho÷òHòo:i! I!ûé метод получения хи;10 IHHQBQH соли lU а пи l lpoBHHHol o 1",сфало спорина С из фильтрованного бульона.

Часть фильтрата, полученного из цельного бульона ферментации .цефалоспор,lia С, обработанного 13 г октадекагидрата сульфата

Предмет изобретения

1, Способ выделения цефалоспор1на С из водных растворов путем обработки этих растворов ацилирующим агенто;l, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, водный раствор, содержащий цефало пор.гн С, обрабатыва1от ангидридом кислоты формулы

55 алюминия и 10 лгл 6,6%-ного полиэтиленимина на 1 л бульона, содержащего 25,8 г цефалоспори1на С, обрабаты1вают 2 объемами метанола на 1 объем фильтрата.

Осадок отфильтровывают и выб расывают.

Фильтрат упаривают до объема 530 ял.

Сконцентрированный фильтрат охлаждают до

10 С и ацилируют 105 лл хлоруксуснопропионового ангидрида (5 эквивалентов ангидрида на 1 эквивалент цефалоспори на С). рН смеси поддерживают 9,0 с помощью 145 ял боратного буфера. По окончании ацилирования дооавляют 39 лгл хинолина. рН смеси доводят до 2,9 с помощью 105 мл 30 jo-ной серной кислоты. Подкисленную смесь перемешивагот в течение 30 мин во цремя крпсталлизац.»I «инолиновой соли N-ацилцефалоспорина. Смесь охлаждают до — 15 С, фильтруют .и промывают водой. После сушки в вакуум" прп 40 С в о течение ночи получают 32,5 г кристаллической хинолиновой соли N-ацилцефалоспорина, чистота продукта 95,4% (ультрафиолетовый анализ), выход 81,5% из фильтрованного бульона.

Пример 3. К раствору 21,0 г борной кислоты в 2000 л.л раствора натриевой соли цефалоспорина С, смешанного с ацетатом натрия, содержащего 40,4 юг/лгл цефалоспорпна

С, называемого водный раствор элюата смолы

5о с буфером из бората натрия, добавляют в течение 10 лгин раствор 50,6 г пропионового ангидрида в 150 мл этилацетата для блокирования азота аминогруппы. Температуру поддерживают 15 — 20 С с помощью водяной оани, 35 рН 8,5 — 9,0 — с помощью 25%-ного раство ра едкого натра. Когда,рН устанав;1и вастся (приблизительно через 3 лгин после окончания добавления ангидрида), его доводят до 2,5 с помощью 30%-ного раствора серной к;1слэты, 40 затем добавляют 75 г оолегчающего р,ильтрование вещества. Смесь фпльтругот 11 к фильтрату добавляют 91,5 г «:шолпна. >Н снова доводят до 3,5 с помощью серной кислоты раствор перемешивают 30 IILiH.,HðH комнатной

45 температуре. Смесь Охлаждают в течение ночи (5 С). Осадок хинолпновой соли цсфалоспорина С отфильтровывают, 111ромывают водой и сушат в вакууме при 40 С. Вео осадка

81,2 г (чистота 97,6 ;:с,), вы«од 84,6% 11з элюата смолы.

468430

Составитель В. Навина

Текред Л. Казачкова

Корректор И. Снмкнна

Редактор О. Кузнецова

Заказ 899/1293 Изд. № ббб Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил, пред. сПатент» где R — алкильная группа, содержащая 1 — 5 атомов углерода, пли галоидалкильная группа, содержащая 1 — 5 атомов углерода;

R — алкильная группа, содержащая 1 — 5 атомов углерода или галоидалкильная грулпа, содержащая 1 — 5 атомо в углерода, пр ичем галоид,.в,галоидалкильной группе, например, хлор или бром, при температуре 0 — 30 C,è,рН 7 — 11 с последующей обработкой полученной при этом реакционной смеси, содержащей N-ацилцефалоспорин С, .молярным из бытком хинолина или изохинолина по отношению к N-ацилцефалоспорину С с доведением рН смеси до 2,0—

3,5 с помощью подкисляющего реагента, выдерживанием полученной смеси при 0 — 30 С и по следующим;выделением об разовавшейся кристаллической хинолиновой соли N-ац илцефалоопорина С известными приемами.

2. С пособ по н. 1, отличающийся тем, что в качестве исходной смеси используют смесь с концентрацией цефалоспорина С в водной среде от 30 до приблизительно 50 мгlнл водной смеси.

3. Способ,по п. 1, отличающийся тем, что процесс на 1стадии ацилирования проводят при

10 — 20 С.

4. Способ по п. 1, 2 и 3, отличающийся тем, что исходную водную среду, содержащую цефалос орин С, предварительно обрабатывают одной или более IHонообменными смолами

5 для частичной очистки.

5. Способ:по лп. 1, 2 и 3, отличающийся тем, что,в качестве исходной водной среды. содержащей цефалоапорин С,;применяют частично концентрированный ферментационный бульон цефалоспарина С, обработанный мета нолом. б. Способ по пп. 1, 2,и 3, отличающийся тем, что в качестве,исходного водного раствора, содержащего цефалоспор ин С, использу15 ют необработанный фильтрованный ферментационный бульон цефалоспорина С.

7. Способ,по пп. 1 — б, отличающийся тем, что в качеспве ангидрида кислоты,применяют хлор уксусно пропио новый ангидрид.

20 8. Способ по пп. 1 — 7, отличающийся тем, что рН среды на стадии ацилирова ния поддерж ивают 8,5 — 9,5.

9. Опособ но,пп. 1 — 8 отличающийся тем, что хинолин добавляют в IKQ;Iè÷åñ âå 2 — 4 эквивалента хинолина на каждый эквива",åíò N ацилцефалоспорина С.

10. Снособ по п. 7, отличающийся тем, что ангидрид кислоты добавляют в количестве

1,5 — 3 эквивалента, ангидрида на каждый эквивалент цефалоапорина С.